Summary
Dendrittiske celler (DCS) skiller ut IL-1β som reaksjon på TLR8 anerkjennelse av syntetisk purin, R848, etterfulgt av NLRP3 inflammasome aktivering med nigericin derfor IL-1β kan brukes til å måle NLRP3 inflammasome aktivitet. Intracellulær cytokin farging, immunoblotting, og ELISA brukes til å måle NLRP3 inflammasome grunning og aktivering via IL-1β uttrykk.
Abstract
Inflammatoriske prosesser som følge av utskillelsen av interleukin (IL) -1 familien av cytokiner immunceller fører til lokal eller systemisk inflammasjon, vev-omdanning og reparasjon, og virologisk kontroll 1, 2. Interleukin-1β er et vesentlig element i det medfødte immunforsvaret og bidrar til å eliminere invaderende patogener mens hindre etablering av vedvarende infeksjon 1-5.
Inflammasomes er nøkkelsignale plattformen for aktivering av interleukin 1-konverterende enzym (ICE eller Caspase-1). Den NLRP3 inflammasome trengs minst to signaler i DCS å forårsake IL-6 sekresjon 1β. Pro-IL-1β protein ekspresjon er begrenset i hvilende celler; derfor en tennsignal er nødvendig for IL-1β transkripsjon og proteinekspresjon. Et andre signal som avføles av NLRP3 resulterer i dannelsen av multi-protein NLRP3 inflammasome. Muligheten av dendrittiske celler til ansvard til de signaler som er nødvendige for IL-1β sekresjon kan testes ved hjelp av en syntetisk purin, R848, som blir avfølt av TLR8 i human monocytt avledet dendrittiske celler (moDCs) å prime-celler, etterfulgt av aktivering av NLRP3 inflammasome med bakterielle toksiner og kalium ionophore, nigericin.
Som stammer fra monocytter DCs er lett produsert i kultur og gi betydelig flere celler enn rensede menneske myeloide DCs. Metoden som er presentert her er forskjellig fra andre inflammasome assays ved at den bruker in vitro human, i stedet for mus avledet, DC og dermed gir for studiet av inflammasome i human sykdom og infeksjon.
Introduction
Aktivering av medfødte immunsystemet er nødvendig for å styre adaptive immunresponser under infeksjon, sykdom, vaksinasjon og 7.. Dendrittiske celler er de mest potente antigenpresenterende celler av det medfødte immunsystemet; de er spesialisert for opptak av antigener, migrasjon til lymfeknuter, og aktivering av naive CD4 + og cytolytiske CD8 + T-celler 8-10. For å muliggjøre rask deteksjon av patogen det medfødte immunsystemet benytter mange germline kodet mønstergjenkjenning reseptorer (PRR) som gjenkjenner konservert patogen avledet motiver eller verts avledet markører for celle stress og skade. Toll like reseptorer (TLR) er membran bundet mønstergjenkjenning reseptorer som gjenkjenner visse ekstracellulære phagocytized patogen assosiert molekylære mønstre (PAMPs) og fare forbundet molekylære mønstre (demper). I motsetning nikk like reseptorer (NLRs) er cytosolic og svare på et variert utvalg av PAMPs og demper. Nikke like reseptorer representere en andrelinjeforsvar mot patogener som unndrar celleoverflaten og endocytiske PRRs. Samspillet av patogen avledet, eller "fare" forbundet, faktorer med TLR og NLR ligander fører til en tilstand av DC modning som resulterer i økt DC samhandling med andre immunceller og fremming av T-celle og natural killer celle aktivering 11.
Interleukin-1β er en viktig komponent i mange forsvar mot infeksjon. Ved godkjenning av en mikroorganisme, den svært proinflammatoriske cytokiner, IL-1β, utskilles og fungerer som en chemo tiltrekkende og aktivator av medfødte og ervervede immunceller. In vivo IL-1β er i stor grad ansvarlig for den akutte fase respons inkludert feber og inflammatorisk cytokin syntese 12.
De fleste NLRs inneholde en C-terminal leucine rikt gjenta domene som er tenkt å fungere i ligand sensing, en sentral nucleotide bindende domenet (NACHT) som er important for NLRP3 oligomerization, og en N-terminal effektor domene (PYD i NLRP3) som medierer signaltransduksjon til nedstrøms mål gjennom protein protein interaksjoner. NLRP3 protein definerer de mest intenst studert inflammasome kompleks. Dette proteinet er et medlem av familien NLR og har evnen til å danne et multi molekylproteinkompleks bestående av NLRP3, adapteren protein PYCARD (også kjent som ASC), og is. Ved inflammasome aktivering PYCARD binder seg til NLRP3 I terminal domener og rekrutterer ICE via caspase aktivering og rekruttering domene (kort) domener. Interleukin-1-konverterende enzym blir først generert som et zymogenplasminogen.Plasminogen inneholdende et CARD motiv ved dets N-terminus. Inflammasome dannelsen, resulterer i å bringe to is molekyler tilstrekkelig tett til å indusere deres autokatalytisk aktivering. Den inflammasome kompleks som er nødvendig for aktivering av ICE og dermed tillater det å konvertere cytoplasmisk pro-IL-1β å modne cytokin.
Vellykket sekresjon av IL-1β i DCs krever sensing av to ulike og uavhengige faresignaler. Først, TLR sensing av PAMPs, demper, eller cytokin signalering (TNF-alfa eller IL-1β) fører til en oppregulering av cytoplasmatisk pro-IL-1β protein uttrykk. En annen, ofte annerledes, signal er nødvendig for inflammasome kompleksdannelse oppstrøms for ICE modning. Noen inflammasome stimulerende signaler omfatter bakterielle membran poredannende toksiner (som nigericin), lysosomale forstyrre krystaller (for eksempel mononatrium urat krystaller, MSU), og ekstracellulært ATP. Oppstrøms mekanisme som fører til NLRP3 inflammasome aktivering av disse ulike aktivatorer er uklart. Studier som undersøker signaliserer oppstrøms inflammasome dannelse foreslår at intracellulære hendelser, for eksempel induksjon av hypokalemi eller reaktive oksygenforbindelser (ROS) indirekte aktivere inflammasome 13-28.
Blant de forskjellige virale aktivatorer av den NLRP3 inflammasome er influensa, som gir bOTH den primære og sekundære signal kreves for IL-1β sekresjon 3, 29-33. Ved hjelp av muse NLRP3 knockout modeller ble det funnet at IL-1β sekresjon i DCs er NLRP3 avhengig 32. I tillegg NLRP3 knockout mus tilt færre leukocytter til området for infeksjon og opplevde høyere dødelighet 2, 5. To nyere papirer foreslå en mekanisme for NLRP3 inflammasome aktivering under Influensa virus infeksjon; først grunning gjennom anerkjennelse av viralt RNA ved TLR7 eller TLR8 (avhengig TLR ekspresjon av det reagerer celle) eller ved avføling av Commensal bakterier ved andre TLR å indusere cytoplasmisk pro-IL-1β ekspresjon, fulgt av et andre signal, aktivering av NLRP3 inflammasome dannelsen av viral ionekanal protein M2 på trans Golgi nettverk 33, 34. I det sistnevnte trinn, er utløsning av den NLRP3 inflammasome oppnådd ved forstyrrelse av intracellulær ionisk <em> miljø som fører til ROS produksjon, noe som er ganske enkelt, som avføles av NLPR3 som et signal for å danne det inflammasome. Men den nøyaktige virkningsmekanismen inflammasome aktivering oppstrøms ICE aktivitet under influensainfeksjon er fremdeles uklart.
Dette arbeidet beskriver en teknikk verdifullt for å studere NLRP3 inflammasome i menneskelige moDCs som kan brukes som et grunnlag for videre etterforskning av veien underliggende DC basert IL-1β sekresjon i respons til TLR8 ligation med R848 fulgt av aktivering av inflammasome av et godt kjent aktivator av NLRP3, nigericin. Variasjoner av denne fremgangsmåte kan anvendes sammen med andre celletyper, inkludert, men ikke begrenset til, monocytter, makrofager, andre DC-undergrupper, og epitelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Forsknings prøvene er innhentet og lagret for forskning med givernes samtykke. Alle prøver skal kodes eller anonymisert før bruk. Denne protokollen følger retningslinjene til vår Institutional Review Board.
En. Differensiering av humane perifere blod monocytter inn stammer fra monocytter dendrittiske celler.
Merk: Menneske buffy coats tjene som kilde til humane perifere blodceller (PBMC) og ble hentet fra New York Blood Center (New York, NY). Blodgivere er friske frivillige. Prosedyren 5 dag begynner med plating av humane perifere mononukleære blodceller (PBMC) på vevskulturflasker 35,36. Betydelige forskjeller fra de publiserte protokoller er følgende:
- Bruk 225 cm 2 non pyrogenic polystyren vevskulturflasker med et filter cap å følge totalt 2x10 8 PBMC per flaske i stedet for 10 cm isopor vevkulturplates (58 cm 2) (trinn 1).
- Forbered media med 5% sammenslåtte humant serum (PHS, 30 ml) i 500 ml RPMI-1640 + L-glutamin, 5 ml 1 M HEPES-buffer, og 1,4 ml 50 mg / ml Gentamicin (5% PHS media) fulgt av filtrering gjennom en 20 mikrometer filter. Til en total av 50 ml 5% PHS-medium per 225 cm 2 vevskultur kolbe.
- Vask følges cellene tre ganger med 25 ml frisk RPMI-1640. Rist kraftig i 5 sekunder under hver vask og aspirer ikke heftende celler (trinn 4).
- Legg 190 mL av 400 IE / mL IL-4 og 380 mL av 100 IU / mL GM-CSF per flaske (trinn 3) på dag 0, 2 og 4. Dag 0 er definert som dagen PBMC blir først belagt i trinn 1 (trinn 8).
- Innhøstings dag 5 moDCs ved en konsentrasjon på 1x10 6 celler / ml (trinn 15).
- Bruk moDCs umiddelbart i sin hviletilstand. Steps 17-22 er aldri utført. Merk: Prøvene skal behandles så snart som mulig etter innsamling for best resultat.
- Delmengde moDCs på en konsentrasjonsjon på 2x10 5 celler / brønn (200 ul / brønn av 1x10 6 celler / ml) i en 96 brønn rundbunnet plate (western blot, ELISA, FACS) eller på en poly-L-lysin-behandlede chamberslide (mikroskopi) for eksperimentering . Merk: Det er minst fire forhold: Helt unstimulated (negativ kontroll), grunning bare, aktivisering bare, og grunning etterfulgt av aktivering. Forhold kan bli utvidet til å omfatte fortynningsmiddel kontroller for R848 og nigericin hvis ønskelig. Hvis nedstrøms analysen er ICS, duplikater er nødvendige for isotype kontroll.
. 2. Lufting av Inflammasome - Signal en
- Rekonstituere lyofilisert R848 i DMSO i henhold til produsentens instruksjoner. Fortynne arbeider lager ved RT med RPMI-1640.
- Legg R848 på en 10 pM sluttkonsentrasjon til passende brønner i 18 timer. Plasser cellene i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
3 Aktivere NLRP3 Inflammasome -. Signal2
- Rekonstituere frysetørret nigericin i etanol i henhold til produsentens instruksjoner. Fortynne arbeider lager ved RT med RPMI-1640 før du legger til de aktuelle forholdene.
- Legg nigericin med 20 mM sluttkonsentrasjon og gå tilbake til inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2 i 6 timer. Ingen vasketrinn oppstår mellom priming og under aktivering. Merk: Sekresjon av IL-1β økes ved nærvær av kalsium ionophores, brefeldin A, monensin, dinitrofenol, eller karbonyl-cyanid chlorophenylhydrazone 37, 38. Derfor er tilsetning av disse sekretoriske inhibitorer anbefales ikke ved analyse inflammasome priming eller aktivitet, siden den vil endre sekresjon av IL-1β.
4. IL-1ss Prøvetaking
- Sentrifuger plate med celler og supernatantene ved 974 x g i 3 min.
- Uten å forstyrre cellepelleten, suge-og supernatanten overføres til someparate rundbunnet plate for å måle cytokin sekresjon fra supernatantene. Merk: Supernatanter kan bli midlertidig lagret ved -20 ° C eller -80 ° C for langtidslagring.
- Vask de cellulære pellets tre ganger med 200 ul av 1 x PBS ved 974 x g i 3 minutter for å fjerne eventuelt ekstracellulære IL-1β fra de cellulære prøvene. Merk: Når du vasker cellen pellets fra en plate med 96 brønner, fjern vask ved rask plate inversjon i en samling bin slik som å ikke forstyrre prøven.
5. Måling IL-1ss Fra Cellular og supernatantprøvene
- Intracellulær cytokin Farging (ICS): Den ICS-protokollen er beskrevet under 39, 40. Merk: ikke suspendere cellene hvis nedstrøms analysen er mikroskopi. Alle vasker og ambisjoner bør gjøres uten å forstyrre cellelaget / pellet (avhengig av nedstrøms assay).
- Legg 100 mL av 5% PHS media i hensiktsmessige brønner. Leggpassende volum (omtrent 1 μl/2x10 5 celler, eller 1 pl / brønn) av fluorescensmerkede α-CD11c og α-CD14 (fenotype markører; klon B-ly6 og MφP9, henholdsvis) eller isotype-kontroll til cellene i 10 minutter ved RT i mørket.
- Vask tre ganger med 1 x PBS ved 974 x g i 3 min.
- Løser cellene ved tilsetning av 100 pl av 4% PFA i 20 min ved RT i mørket.
- Pause Point: Vask med 100 mL 1x PBS ved 974 xg i 3 min og oppbevar ved 4 ° CO / N i 1x PBS.
- Tilsett 100 ul av permeabilization buffer til cellene 30 min. Merk: permeabilization buffer er sammensatt av 1 x PBS med 0,3% Triton X-100 og 1% bovint serum albumin (BSA) for permeabilization. Ikke forstyrr heftende celler når nedstrøms analysen er mikroskopi.
- Legg passende volum (ca. 62 ng antibody/2x10 5-celler, ca eller 2,5 pl / brønn) av α-IL-1β-FITC (klon 8516) eller isotype kontroll for2 timer i en inkubator ved 37 ° C.
- Vask cellene tre ganger med 200 pl av permeabilization buffer ved 974 x g i 3 min i mørket.
- Valgfritt: Stain med DAPI, legge mountant, og legg dekkglass forsiktig på toppen av en glass-slide. Tillat mountant å kurere O / N før fangst mikroskopi bilder.
- Acquire dataene ved FACS eller mikroskopi. Merk: Sammenlign isotype for hver tilstand til riktig flekker ved analyse av FACS eller mikroskopi.
- FACS: Skaff en prøve om gangen. Sett FSC / SSC gate på levende celler, etterfulgt av gating på CD11c + CD14 - celler før analysere moDC befolkningen pro-IL-1β farging.
- Mikroskopi: Still inn eksponeringstiden ved hjelp av positiv farging prøven - R848 behandlet. Bruk DAPI + pro-IL-1β + og DAPI + pro-IL-1β - for å bestemme prosentandelen av pro-IL-1β + uttrykker moDCs.
- SDS-Page: Immunoblotting er utført for å oppdage pro-IL-1β. Merk: Den teknikk som er beskrevet nedenfor, og kombinerer standard immunoblotting teknikk, gradient 4-20% polyakrylamidgel, og fluorescerende eller kjemiluminescerende deteksjon 41, 42.
- Lyse cellene direkte i 10 mL denaturerende lyseringsbuffer (5 pl β-mercaptoethanol/950 pl Laemmli prøvebuffer etterfulgt av fortynning 1:1 med cellelyseringsbuffer). Overfør lysatet til 1,5 ml Eppendorf-rør.
- Varme lysat på en tørr plate i 10 minutter ved 100 ° C.
- Spin-lysat ved 20 800 xg i en minicentrifuge i 1 min for å konsentrere det flytende volum. Pause Punkt: prøvene kan fryses ved -20 ° C for kortvarig lagring.
- Laste det totale volum på polyakrylamidgel. Løpe 140 V gjennom gel boks i ca 1 time, eller inntil fargestoffet foran løper ut i bunnen av gelen.
- Overfør protein fra polyakrylamidgelen til en Immobilon PVDF-FL membrane i 90 min ved 100 V. Block membranen med 5% BSA i Tris-bufret saltvann / 0,1% Tween-20 (TBS-T) i 1 time. Merk: PVDF Immobilon-FL er best for bruk med fluoriserende oppdagelse. En membran med en annen sammensetning er anbefalt for andre deteksjonsteknikker for å øke signal til bakgrunnsforhold.
- Fortynn primære og sekundære antistoffer i 10 ml 5% BSA / TBS-T. Utfør primære antistoff inkubering ved 4 ° CO / N samtidig rysting og sekundære antistoff ved RT i 1 time under risting.
- Vask membranen 3 ganger med TBS-T i 5 min under risting mellom primære og sekundære antistoff inkubasjoner og igjen mellom sekundær inkubasjoner og avbildning. Merk: Band kan oppdages ved hjelp av fluoriserende eller chemiluminescent deteksjon. Følg produsentens instruksjoner for deteksjon.
- ELISA: Prøver som er frosset for lagring trenger å ekvilibrere til romtemperatur før analysering. Spinn ned prøvene i en sentrifuge for å konsolidere supernatantprøvene kondensasjon. Følg produsentens anvisninger for måling av IL-1β. Merk: I denne protokollen IL-1β er spesielt målt; Men samtidig måling av TNFa, IL-6, og immunmodulerende cytokiner IL-10 sikre de nødvendige betingelser ble primet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse teknikkene måle TLR8 grunning med R848. Intracellulær cytokin farging for pro-IL-1β åpner for mikroskopi og FACS avlesninger fra CD14 - CD11c + moDCs. Begge teknikkene kan kvantifiseres i forhold til en ikke fylt, eller hviler, cellekontroll, så vel som en isotype-kontroll (figur 1 og 2). Prosent av pro-IL-1β + fargings celler er multiplisert med den geometriske midtlinje av denne populasjon for å gi median fluorescensintensitet (MFI). MFI er sammenlignbar med mengden av pro-IL-1β til stede i den positive flekker celler.
Immunoblotting måler pro-IL-1β fra celle-lysat, som deretter kvantifisert i forhold til en intern cellulær kontroll, for eksempel β-tubulin eller β-aktin (figur 3). Immunoblotting for pro-IL-1β i nigericin behandlet cellene skal avsløre en nedgang i pro-IL-1β. Dette kompletteres med ensamtidige økning i IL-1β i supernatanter, målt ved ELISA, bare i R848 fulgt av nigericin forhold (figur 3 og 4). Alle andre betingelser skulle resultere i ingen ekstracellulære IL-1β tilstede. Samtidig måling av andre inflammatoriske cytokiner, slik som TNFa, IL-10 og IL-6, sikrer at nigericin er spesifikk i å forårsake sekresjon av IL-1β. Nivået av fyllingen er tid (figur 3) og dose (figur 4) avhengig, en reaksjon reflekteres i graden av intracellulære pro-IL-1β i R848 primet og ekstracellulære IL-1β (så vel som TNF-alfa, IL-10, og IL-6) sekresjon i alt R848 behandlet betingelser (figur 4).
Figur 1. Cytoplasmisk pro-IL-1β detekteres av f lav cytometri. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Cytoplasmisk pro-IL-1β oppdages ved mikroskopi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3. Cytoplasmatisk pro-IL-1β detekteres ved SDS-PAGE.res.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 utskilt IL-1β er oppdaget av ELISA.. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inflammatoriske cytokiner er integrert i styre medfødte og adaptive immunrespons til å bekjempe virusinfeksjoner. Utskilt IL-1β har vist seg å øke i løpet av influensainfeksjon 3, 43, 44. De nøyaktige mekanismer som disse cytokiner er bearbeidet som respons på viral anerkjennelse i humane dendritiske celler er ikke fullt ut forstått. Myeloid DC isolasjonssett er kostbare og tidkrevende. Isolasjon kits og FAC sortering kan utilsiktet stress eller aktivere cellene. I tillegg er det ofte utilstrekkelig mengde av isolerte celler for eksperimentering. Heldigvis, biologi av menneskelige moDCs nøye modeller som av primære humane myeloide DCs in vitro 45, 46. Begge celletyper krever to signaler, TLR grunning og NLRP3 aktiverende, for å oppnå modent IL-1β sekresjon. Derfor moDCs gi og rimelig og enkel DC-modellen celletype for å studere og satseter forstår relevansen og rolle NLRP3 inflammasome i menneskers helse og sykdom.
Påvisning av IL-1β anvendelse av fremgangsmåtene beskrevet her gir forskjellige enkle og effektive immunologiske analyser for å studere sykdommer assosiert med inflammatoriske patologier, inklusive viral RNA-infeksjon; spesielt, hvordan man kan måle IL-1β på en rekke måter i respons til R848 og nigericin stimulering. Andre TLR-agonister (for eksempel Poly (I: C) og LPS) og NLRP3 inflammasome aktivatorer (slik som ATP og MSU) kan brukes for å måle denne aktiviteten ved stimulering i sammenheng med andre sykdoms patologier; kan imidlertid stimuleringstider og betingelser må justeres. Ganger og konsentrasjoner Reagens eksponerings ville også må justeres når du endrer denne protokollen for bruk i andre celletyper og arter.
Alle forholdene skal kjøres i tre eksemplarer og responsen veies nøye for kvalitetskontroll; det er vanlig forstor donor variasjon å eksistere. Monocytt-avledet DC er en celletype, ikke en cellelinje, og heterogenitet eksisterer innenfor et moDC kultur.
Grunning kan bekreftes med ICS for pro-IL-1β og sammenligne hviler moDCs til R848-primet tilstand. Resting moDCs bør ikke resultere i positiv farging. Grunning kan også bli validert ved immuno for uttrykket av pro-IL-1β. Vellykket R848 grunning resulterer i sekresjon av proinflammatoriske cytokiner TNF-alfa, IL-6, og immunmodulerende cytokiner IL-10 med minimal utskillelse av IL-1β. Inflammasome aktiverte cellene bør ikke vise en ytterligere økning i TNF-alfa, IL-6 og IL-10 sekresjon, men vil ha en økning i utskilling av IL-1β konsentrasjoner, sammenlignet med uaktiverte celler.
Pro-IL-1β kan være passivt frigjøres under nekrotisk celledød biotilgjengeligheten analyser kan være av interesse. Alternativt kan immunoblotting utføres på overståendets for å bestemme molekylvekten av utskilt IL-1β å sikre aktiv IL-1β er i form av cytokin utskilt; moden IL-1β er 17 kDa mens forløperen er 31 kDa. For å måle IL-1β fra supernatanter, vil cellekonsentrasjonen må justeres for å oppnå et positivt signal over deteksjonsgrensen. Caspase-1 aktivering kan også måles via en rekke metoder for å bestemme inflammasome aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., og Meagan O'Brien, MD for deres støtte og tilbakemeldinger. Denne forskningen ble støttet av National Institute of Allergy and Infectious Disease og gjennomført med midler fra NIH gir Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards for Individual Predoctoral Fellowships (F31) for å fremme mangfold i helsefaglig forskning (AI089030) og RO1 (AI081848 ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IL-4 | R&D | ||
| GM-CSF | Genzyme | NDC 58468-0180-2 | We acquire this item through our local pharmacy with a prescription |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Cellgro | 10-040-CV | |
| Peripheral blood mononuclear cells | New York Blood Center | PBMCs were isolated from the blood of healthy donors | |
| 12 well tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3516 | |
| 96 well round bottom tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3799 | |
| α-IL-1β-FITC | R&D | IC201F | |
| FITC isotype control | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| α-β-Tubulin | Santa Cruz | SC-9014 | |
| α-IL-1β | R&D | mab201 | |
| PVDF Immobilon-FL membrane | Millipore | IPFL00010 | |
| gradient 4-12% polycrylamide gel | Bio Rad | 161-1159 | |
| Laemmli sample buffer | Bio Rad | 161-0737 | |
| BSA | Equitech Bio Inc | 30% solution sterile/filtered | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| Human inflammatory cytokine bead array kit | BD | 551811 | |
| Nigericin | Invivogen | tlrl-nig | |
| R848 | 3M Corp. | ||
| α-CD14 | BD | 340436 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| TBS | On site stock room | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100mL | |
| Nunc EasYFlask 225 cm2, Filter Cap, 70 ml working volume, 30/Cs | Thermo Scientific | 159933 | |
| 20 μM Sterile Disposable Filter Units | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| Goat α-mouse IRDye 800CW | Licor | 926-32210 | |
| Donkey α-rabbit IRDye 680RD | Licor | 926-68073 | |
| Spectra multicolor broad range protein ladder | Thermo Scientific | 26634 | |
| Tris Glycine SDS 10x | Bio Rad | 1610732 | |
| Tris Glycine 10x | Bio Rad | 161-0734 | |
| Methanol - 4 L | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| 8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide | BD Falcon | 354108 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 |
References
- Durrant, D. M., Robinette, M. L., Klein, R. S. IL-1R1 is required for dendritic cell-mediated T cell reactivation within the CNS during West Nile virus encephalitis. The Journal of Experimental Medicine. 210, 503-516 (2013).
- Thomas, P. G., et al. The intracellular sensor NLRP3 mediates key innate and healing responses to influenza A virus via the regulation of caspase-1. Immunity. 30, 566-575 (2009).
- Schmitz, N., Kurrer, M., Bachmann, M. F., Kopf, M. Interleukin-1 is responsible for acute lung immunopathology but increases survival of respiratory influenza virus infection. Journal of Virology. 79, 6441-6448 (2005).
- Pang, I. K., Ichinohe, T., Iwasaki, A. IL-1R signaling in dendritic cells replaces pattern-recognition receptors in promoting CD8(+) T cell responses to influenza A virus. Nat Immunol. 14, 246-253 (2013).
- Allen, I. C., et al. The NLRP3 inflammasome mediates in vivo innate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA. Immunity. 30, 556-565 (2009).
- Bauernfeind, F. G., et al. Cutting edge: NF-kappaB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J Immunol. 183, 787-791 (2009).
- Zabel, F., Kundig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: on how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. , (2013).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nature Medicine. 13, 1155-1159 (2007).
- Bhardwaj, N., et al. Influenza virus-infected dendritic cells stimulate strong proliferative and cytolytic responses from human CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 94, 797-807 (1994).
- Sheng, K. C., Day, S., Wright, M. D., Stojanovska, L., Apostolopoulos, V. Enhanced Dendritic Cell-Mediated Antigen-Specific CD4+ T Cell Responses: IFN-Gamma Aids TLR Stimulation. Journal of Drug Delivery. 2013, (2013).
- Pohl, C., Shishkova, J., Schneider-Schaulies, S. Viruses and dendritic cells: enemy mine. Cellular Microbiology. 9, 279-289 (2007).
- Dinarello, C. A. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Curr Top Microbiol Immunol. 216, 133-165 (1996).
- Petrilli, V., et al. Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration. Cell Death and Differentiation. 14, 1583-1589 (2007).
- Hussen, J., Duvel, A., Koy, M., Schuberth, H. J. Inflammasome activation in bovine monocytes by extracellular ATP does not require the purinergic receptor P2X7. Developmental and Comparative Immunology. 38, 312-320 (2012).
- Rajamaki, K., et al. Extracellular Acidosis Is a Novel Danger Signal Alerting Innate Immunity via the NLRP3 Inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 288, 13410-13419 (2013).
- Ayna, G., et al. ATP release from dying autophagic cells and their phagocytosis are crucial for inflammasome activation in macrophages. PLoS One. , (2012).
- Vyleta, M. L., Wong, J., Magun, B. E. Suppression of ribosomal function triggers innate immune signaling through activation of the NLRP3 inflammasome. PLoS One. 7, (2012).
- Lacroix-Lamande, S., et al. Downregulation of the Na/K-ATPase pump by leptospiral glycolipoprotein activates the NLRP3 inflammasome. J Immunol. 188, 2805-2814 (2012).
- Segovia, J., et al. TLR2/MyD88/NF-kappaB pathway, reactive oxygen species, potassium efflux activates NLRP3/ASC inflammasome during respiratory syncytial virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Hamon, M. A., Cossart, P. K. K+ efflux is required for histone H3 dephosphorylation by Listeria monocytogenes listeriolysin O and other pore-forming toxins. Infection and Immunity. 79, 2839-2846 (2011).
- Schorn, C., et al. Sodium overload and water influx activate the NALP3 inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 286, 35-41 (2011).
- Said-Sadier, N., Padilla, E., Langsley, G., Ojcius, D. M. Aspergillus fumigatus stimulates the NLRP3 inflammasome through a pathway requiring ROS production and the Syk tyrosine kinase. PLoS One. 5, (2010).
- Arlehamn, C. S., Petrilli, V., Gross, O., Tschopp, J., Evans, T. J. The role of potassium in inflammasome activation by bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 285, 10508-10518 (2010).
- Chu, J., et al. Cholesterol-dependent cytolysins induce rapid release of mature IL-1beta from murine macrophages in a NLRP3 inflammasome and cathepsin B-dependent manner. Journal of Leukocyte Biology. 86, 1227-1238 (2009).
- Silverman, W. R., et al. The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and astrocytes. The Journal of Biological Chemistry. 284, 18143-18151 (2009).
- Piccini, A., et al. ATP is released by monocytes stimulated with pathogen-sensing receptor ligands and induces IL-1beta and IL-18 secretion in an autocrine way. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 8067-8072 (2008).
- Wickliffe, K. E., Leppla, S. H., Moayeri, M. Anthrax lethal toxin-induced inflammasome formation and caspase-1 activation are late events dependent on ion fluxes and the proteasome. Cellular Microbiology. 10, 332-343 (2008).
- Franchi, L., Kanneganti, T. D., Dubyak, G. R., Nunez, G. Differential requirement of P2X7 receptor and intracellular K+ for caspase-1 activation induced by intracellular and extracellular bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 282, 18810-18818 (2007).
- Owen, D. M., Gale, M. Fighting the flu with inflammasome signaling. Immunity. 30, 476-478 (2009).
- Pang, I. K., Iwasaki, A. Inflammasomes as mediators of immunity against influenza virus. Trends in Immunology. 32, 34-41 (2011).
- Kanneganti, T. D., et al. Critical role for Cryopyrin/Nalp3 in activation of caspase-1 in response to viral infection and double-stranded RNA. The Journal of Biological Chemistry. 281, 36560-36568 (2006).
- Ichinohe, T., Lee, H. K., Ogura, Y., Flavell, R., Iwasaki, A. Inflammasome recognition of influenza virus is essential for adaptive immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 206, 79-87 (2009).
- Ichinohe, T., Pang, I. K., Iwasaki, A. Influenza virus activates inflammasomes via its intracellular M2 ion channel. Nat Immunol. 11, 404-410 (2010).
- Ichinohe, T., et al. Microbiota regulates immune defense against respiratory tract influenza A virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5354-5359 (2011).
- O'Neill, D. W., Bhardwaj, N. Differentiation of peripheral blood monocytes into dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 22, (2005).
- Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), (2013).
- Rubartelli, A., Cozzolino, F., Talio, M., Sitia, R. A novel secretory pathway for interleukin-1 beta, a protein lacking a signal sequence. The EMBO Journal. 9, 1503-1510 (1990).
- Ritchie, H., Booth, N. A. Secretion of plasminogen activator inhibitor 2 by human peripheral blood monocytes occurs via an endoplasmic reticulum-golgi-independent pathway. Experimental Cell Research. 242, 439-450 (1998).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nature Protocols. 1, 1507-1516 (2006).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J Vis Exp. 38, (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of Medical Sciences. 4, 429-434 (2012).
- Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods in Enzymology. 463, 573-599 (2009).
- Hennet, T., Ziltener, H. J., Frei, K., Peterhans, E. A kinetic study of immune mediators in the lungs of mice infected with influenza A virus. J Immunol. 149, 932-939 (1992).
- Pirhonen, J., Sareneva, T., Kurimoto, M., Julkunen, I., Matikainen, S. Virus infection activates IL-1 beta and IL-18 production in human macrophages by a caspase-1-dependent pathway. J Immunol. 162, 7322-7329 (1999).
- Anderson, J., Gustafsson, K., Himoudi, N. Licensing of killer dendritic cells in mouse and humans: functional similarities between IKDC and human blood gammadelta T-lymphocytes. Journal of Immunotoxicology. 9, 259-266 (2012).
- Waithman, J., Mintern, J. D. Dendritic cells and influenza A virus infection. Virulence. 3, 603-608 (2012).
