DNBS/TNBS 结肠炎模型：揭示炎症性肠病及膳食脂肪影响

摘要

DNBS/TNBS 诱导的结肠炎为研究炎症性肠病的发病机制提供了一种替代且经济的方法。本文讨论的实验方案概述了成功应用 DNBS 在小鼠和大鼠中诱导结肠炎的方法，从而可深入研究宿主介导的肠道免疫应答。

摘要

炎症性肠病（IBD），包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，长期以来被认为具有遗传基础，而近期研究更发现其与宿主对微生物及环境因子的免疫应答密切相关。采用二硝基苯磺酸（DNBS）诱导的结肠炎模型，可用于研究与IBD相关的环境诱因（如应激和饮食）的发病机制、潜在疗法的效果，以及肠道炎症和黏膜损伤的内在机制。本文中，我们探讨了饮食中n-3和n-6脂肪酸对大鼠DNBS诱导结肠炎后结肠黏膜炎症反应的影响。所有大鼠均饲喂相同饮食，仅脂肪酸类型不同，分别为红花油（SO）、菜籽油（CO）或鱼油（FO），持续三周 在经直肠给予DNBS前数周，给予乙醇的对照组大鼠在为期5天的研究期间持续增重，而接受DNBS处理并饲喂脂质饮食的大鼠均出现体重下降，其中鱼油（FO）和玉米油（CO）饲喂组大鼠在48小时时表现出显著体重减轻 hr 和喂食 SO 的大鼠在 72 小时时 小时。体重在72小时后重新开始增加 hr post DNBS，至 DNBS 处理后第 5 天，FO 组的体重高于 SO 组和 CO 组。于 DNBS 处理后第 5 天采集的结肠组织切片 DNBS处理后数天，各饮食组均出现局灶性溃疡、隐窝破坏、杯状细胞减少以及急性和慢性炎性细胞的黏膜浸润，但组织损伤程度在各饮食组间存在差异。其中，SO饲喂组损伤最严重，其次为CO饲喂组，FO饲喂组组织损伤最轻。类似地，结肠髓过氧化物酶（MPO）活性（中性粒细胞活性的标志物）在SO饲喂大鼠中显著升高，CO饲喂大鼠次之，而FO饲喂大鼠的MPO活性显著较低。这些结果表明，本方案所述的DNBS诱导结肠炎模型可用于评估饮食对炎症性肠病（IBD）发病机制的影响。

引言

炎症性肠病（IBD）以胃肠道（GI）的慢性复发性炎症为特征，导致腹泻、体重减轻和腹痛等症状。溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）是IBD的两种主要类型，可通过炎症在胃肠道内的位置进行区分。在UC患者中，炎症通常累及直肠，并连续向上蔓延至结肠，影响范围不一，但仅累及表层黏膜。相比之下，CD可累及胃肠道的任何部位，尽管主要影响回肠和盲肠。CD常表现为透壁性炎症，常伴有肉芽肿，并导致狭窄性（纤维性狭窄）和/或穿透性（瘘管形成）病变。尽管IBD的病因尚不明确，但普遍认为其为多因素疾病，涉及宿主免疫系统、遗传易感性以及对环境和微生物因素反应之间的相互作用。

迄今为止，已提出多种炎症性肠病（IBD）模型，这些模型表现出与溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）相关的不同临床、组织学和免疫反应特征。最常用的模型包括基因修饰小鼠（IL-2、IL-10、SAMP/Yit）、感染诱导模型（Citrobacter rodentium、Salmonella typhimurium）、过继性细胞转移模型（将CD45+ RB High或CD62L+细胞转移至SCID小鼠）以及化学诱导结肠炎模型（葡聚糖硫酸钠（DSS）、三硝基苯磺酸（TNBS）和二硝基苯磺酸（DNBS））。由于化学诱导模型成本较低且疾病发作迅速，因此在研究IBD多个方面时具有重要价值。上述每种化学性结肠炎模型在模拟IBD的临床、免疫学和组织病理学相关性方面均具有各自的优势与局限性。DSS是用于在啮齿类动....

方案

涉及动物受试对象的操作遵循不列颠哥伦比亚大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）制定的动物护理指南。

本方案中提及的实验步骤将同时针对大鼠和小鼠进行描述，而代表性结果则来自Sprague-Dawley大鼠。

1. DNBS 的制备与直肠内给药

1. 对于大鼠的DNBS直肠灌注，需新鲜配制每250 µl含15–30 mg DNBS的50%乙醇溶液。对于小鼠，配制每100 µl含2–6 mg DNBS的50%乙醇溶液。注意：各实验机构应优化所用DNBS的确切浓度。诱导DNBS结肠炎时首选雄性Sprague-Dawley大鼠和C57BL/6小鼠，但也可使用其他品系的小鼠和大鼠。仅给予50%乙醇的动物可作为对照组，但由于乙醇的作用较轻微或不明显，研究中可省略该对照组。¹².
2. 连接1 ml 将注射器连接至19 G针头，针头末端固定有聚乙烯导管（大鼠用PE-90，小鼠用PE-50）。
3. 将大鼠或小鼠置于加热垫上并进行轻度麻醉（例如 通过鼻罩给予1.5%异氟烷，动物应仍保留眨眼和吞咽反射，并呈现规律呼吸。在动物眼睛上涂抹眼用凝胶，以防止眼睛干涩。
4. 用指尖轻轻按压动物后端，以排出远端结肠内可能存在的粪便。
5. 轻轻地将导管经直肠插入，导管插入深度约为大鼠肛门近端8 cm，或小鼠3-4 cm。插入....

结果

使用DNBS对大鼠（Sprague-Dawley）或小鼠（C57BL/6）进行造模，通常会导致短暂的体重下降和腹泻，有时粪便中带血。然而，遗传、饮食以及肠道微生物群等因素可能影响动物对DNBS诱导结肠炎的易感性。因此，实验中所用动物应来自同一机构，可为本地繁育或从单一动物供应商处订购。所有动物在结肠炎期间的体重下降程度及痛苦症状均需密切监测。

所展示的结果 图1-4 代表一项实验，评估了三种膳食油——红花油、芥花油和鱼油——对DNBS结肠炎严重程度的影响。组间统计学差异通过单因素方差分析（ANOVA）及事后Tukey检验确定，所用数据分析软件程序进行分析。P值为 <0.05 被视为具有显著性。

经直肠给予DNBS（20 mg DNBS/250 μl 50%乙醇）后，补充鱼油（FO）和玉米油（CO）的大鼠在48小时时已出现显著体重下降，补充大豆油（SO）的大鼠则在72小时时出现显著体重下降（P<0.05）。体重下降的最大值在补充FO的大鼠中出现在48小时，在补充CO.......

讨论

本方案中描述的DNBS模型是一种有价值、低成本且可重复的结肠炎模型，可用于研究炎症性肠病（IBD）的多个方面。当通过直肠途径给予大鼠或小鼠时，DNBS会在结肠中引发显著的炎症反应和组织损伤，其组织学特征与人类克罗恩病相似，包括透壁性的多形核细胞浸润以及以NF-κB依赖的Th1细胞活化为主。

该模型已用于研究各种被认为会影响炎症性肠病（IBD）的因素，如应激、抑郁和饮食，以及肠神经系统的作用、损伤-修复机制、透壁性炎症和临床前治疗。DNBS模型也是小鼠和大鼠中TNBS诱导炎症的合适替代方法，并且相较于其他常用的化学性结肠炎模型（如DSS），具有成本更低的优势。本实验方案中所述步骤将有助于成功实施该模型。

与其他结肠炎实验模型一致^13-16，本研究进一步证实了膳食脂肪对肠道黏膜免疫反应具有不同影响：在DNBS暴露前后摄入高剂量EPA和DHA可减轻结肠炎，而摄入高剂量ARA且n-3脂肪酸含量极低则会加重病情。本研究中观察到的膳食n-3脂肪酸的有益作用，部分原因在于n-3脂肪酸能够有效降低组织磷脂中的ARA含量，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 ml 注射器	BD Biosciences	309659
19 G 针头	BD Biosciences	305187
聚乙烯导管 PE-50	BD Biosciences	427517	用于小鼠直肠内给药
聚乙烯导管 PE-90	BD Biosciences	427519	用于大鼠直肠内给药
DNBS	MP Bio	150959
泪胶	Novartis	63601662596
10% 甲醛	Fisher	5F93-4
加热垫	Kent Scientific	TPZ-0510
乙醇	Fisher	A-962.4
十六烷基三甲基溴化铵	Sigma-Aldrich	H5882
磷酸钾缓冲液	Sigma-Aldrich	79628-
邻二安息香胺二盐酸盐	Sigma-Aldrich	D3252
30% H2O2	Sigma-Aldrich	31642	过氧化氢
分光光度计	BioRad	Benchmarker Plus
光学显微镜	Zeiss	Axio Image.Z1
数据分析软件程序	GraphPad Software	GraphPad Prism Software Version 4.00	www.graphpad.com