使用重组人MHC II分子进行生化检测，可快速、定量地获得有关免疫原性表位鉴定、去除或设计的信息。 本文描述了一种适用于384孔板的肽-MHC II结合检测方法。这种成本效益高的检测格式在蛋白质去免疫化以及疫苗设计与开发领域中具有重要应用价值。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
勘误通知
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
摘要
摘要
使用重组人 MHC II 分子进行的生化检测可快速、定量地提供有关免疫原性表位鉴定、删除或设计的见解1,2。本文将肽-MHC II 结合检测方法优化至 384 孔板格式。该简化后的实验方案可将试剂成本降低 75%，且通量高于此前报道的 96 孔板方法1,3-5。具体而言，该实验设计允许在单个 384 孔 ELISA 板上，对每种 MHC II 等位基因同时稳健、可重复地分析多达 15 种肽段。通过使用一台液体处理机器人，单名研究人员可在不到 48 小时内，针对八种浓度梯度和四种 MHC II 等位基因类型，对约 90 种待测肽段进行三复孔分析。从事蛋白质去免疫化或疫苗设计与开发领域的研究人员可能会发现该方案有助于推进自身工作。特别是，JoVE 提供的分步操作说明和可视化展示形式，可帮助其他用户在其各自实验室中快速、便捷地建立该技术方法。
引言
蛋白质是增长最快的治疗剂类别6，生物治疗药物研发管线的快速扩展使得人们对蛋白质药物在开发和使用过程中所面临的挑战日益关注。其中一个独特的考量因素在于，在健康且功能正常的免疫系统中，所有细胞外蛋白质都会被抗原呈递细胞（APCs）摄取。一旦被APCs内化，蛋白质将被切割成小肽片段，潜在的免疫原性片段会被装载到II型主要组织相容性复合物蛋白（MHC II）的结合槽中。肽-MHC II复合物随后呈现在APC表面，真正的免疫原性肽段（称为T细胞表位）会与相应的CD4+ T细胞表面受体形成MHC II-肽-T细胞受体三元复合物7这一关键的分子识别事件会启动复杂的信号级联反应，导致T细胞活化、细胞因子释放、CD4+ T细胞介导的B细胞成熟，最终产生可结合并清除致病性外源蛋白的循环IgG抗体。因此，可通过鉴定免疫原性蛋白中的T细胞表位，并突变参与MHC II类分子复合物形成的关键残基，实现蛋白的去免疫化。然而需要注意的是，T细胞表位数量较多且在免疫原性蛋白中分布广泛，大多数表位删除突变可能导致蛋白功能或稳定性的意外丧失。因此，设计去免疫化的生物治疗药物是一项复杂且技术上具有挑战性的目标，但目前已有一些成功删除T细胞表位的案例。3,5,8-12. 与基于嫁接的 "人源化"，尽管目前主要局限于抗体治疗领域，表位删除策略原则上可应用于任何蛋白质靶标，无论其序列、结构、功能如何，也不受同源人源支架是否可得的限制。实施该方法的第一步是鉴定嵌入在靶蛋白序列中的关键肽段表位。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
肽-MHC II 结合实验包含四个主要步骤：1-结合：待测肽段与标记的对照肽段在溶液中竞争结合可溶性 MHC II 蛋白。通过一系列不同浓度的待测肽段测定结合情况。2-捕获：当结合反应接近平衡后，利用固定化的抗体通过构象依赖性识别，将肽-MHC II 复合物从游离的肽段和蛋白质中捕获并分离出来。3-检测：使用时间分辨荧光法对捕获的对照肽段进行定量检测。4-分析：对光谱数据进行处理、绘图和分析，以确定待测肽段与 MHC II 蛋白之间的剂量依赖性结合特性。
在以下实验步骤中的多个环节，如果条件允许，建议使用液体处理机器人。特别是在384孔板体系中，自动加样和稀释液体可最大限度减少人为操作误差，使各孔之间的液体体积更加一致，并相比手动操作的96孔板检测获得更窄的IC50值95%置信区间（数据未显示）。若无液体处理机器人，标注有“（液体处理机器人）”的步骤可手动完成。同样，如条件允许，建议使用与384孔板兼容的自动洗板机，以有效标准化洗板过程。若无洗板机，标注有“（洗板机）”的步骤也可手动完成。
1. 包被 ELISA 板（第 1 天）
- 将 L243 抗体原液（0.5 mg/ml）用硼酸盐缓冲液稀释至工作浓度 10 µg/ml。
- 为包被一块 384 孔板，将 200 µl 抗体原液加入 9.8 ml 硼酸盐缓冲液中。（不同规模稀释请参见补充电子表格计算器）。....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
阴沟肠杆菌 P99 β-内酰胺酶（BLA）（Genbank ID# X07274.1）的成熟肽序列通过 ProPred16 分析，预测其与 MHC II 等位基因 DRB1*1501 结合的潜在肽段（表4）。ProPred 鉴定出 117 个九肽，均含有必需的 P1 锚定残基（即 第1位为 M、L、I、V、F、Y 或 W，这是 MHC II 结合所必需的31）。在 5% 阈值下，仅得分大于或等于 2.6 的肽段才可能是结合物。因此，在 5% 阈值下，仅预测前 11 个肽段可结合 MHC II DRB1*1501。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
生物治疗药物已成为现代医学的基石，2012年销售额最高的五种药物中有四种属于此类32。生物制药行业已持续增长多年6，新型药物的不断开发以及生物类似药的出现进一步拓展了生物制药的研发管线。展望未来，评估并降低蛋白质治疗药物的免疫原性将成为早期生物治疗药物研发中不可或缺的环节。为促进这一过程，生物技术研究人员可利用表位预测的计算方法16-22，以及旨在降低免疫原性同时保持功能的整合性蛋白质设计算法3,23-26。同样，疫苗的设计与开发也可借助预测算法的强大能力4，而反向疫苗学的持续成熟有望为以往难以攻克的多种传染病病原体提供有效的保护性疫苗33。尽管这些计算工具具备显著加速药物和疫苗研发进程的潜力，但in silico预测的结果仍需进一步筛选，以确定数量可控且性能最优的候选分子。近年来，定量肽-MHC II分析技术的进展包括工程化酵母细胞表面展示系统34和基于微珠的发光氧通道免疫分析法35，但in vitro ELISA类检测仍是量.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
Leonard Moise 任职于位于罗德岛州普罗维登斯的私营生物技术公司 EpiVax, Inc.，并持有该公司股票期权。本研究报告所包含的工作不受该公司商业目标可能带来的任何偏见影响。
致谢
本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）授予 CBK 和 KEG 的 R01-GM-098977 和 R21-AI-098122 基金项目资助。RSS 部分受卢斯基金会（Luce Foundation）研究员项目资助，部分受工程学院（Thayer School of Engineering）塔耶创新计划（Thayer Innovation Program）研究员项目的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 十水合四硼酸钠 | Sigma | 221732 | |
| 柠檬酸 | Sigma | C1901 | |
| 磷酸氢二钠 | Sigma | S7907 | |
| Trizma HCl | OmniPur | 9310 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| 100% DMSO | Sigma | D8418 | |
| 辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷 | Fischer | 29836-26-8 | |
| Pefa Bloc SCF | Roche | 1158591600 | |
| Dulbecco’s 10x 磷酸盐缓冲液 | Invitrogen | 14200-166 | |
| DELFIA 检测缓冲液 | Perkin Elmer | 4002-0010 | |
| DELFIA 增强缓冲液 | Perkin Elmer | 4001-0010 | |
| 铕标记链霉亲和素 | Perkin Elmer | 1244-360 | |
| L243 抗 HLA-DR 抗体 | Biolegend | 307602 | |
| 生物素化示踪肽 | 21st Century Biochemicals | 定制订单 | |
| 测试肽（1-4 mg，85% 纯度） | Genscript | 定制订单 | |
| 纯化的 HLA-DRB1 单体（非生物素化） | Benaroya Research Institute* | 定制订单 | |
| 384 孔白色 EIA/RIA 板 | Thermo | 460372 | |
| 聚丙烯 384 孔板 | Costar | 3656 | |
| 封膜，AxySeal，80 µm，ELISA 涂布器 | Axygen Ascientific | PCR-SP | |
| MilliQ 水 | N/A | N/A | |
| Epimotion 液体处理仪（或类似设备） | Eppendorf | 5075 | |
| Select TS 板式洗板机（或类似设备） | BioTek | 405 | |
| SpectraMax Gemini 微孔板读板仪（或类似设备） | Molecular Devices | N/A | |
| *重组人 MHC II 类分子可从 Benaroya 四聚体核心实验室获取。 参见：https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory |
参考文献
- Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
- Raddrizzani, L., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 3/18/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. There were typos in the Protocol section and Table 2.
Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:
Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
to:
Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
Step 5.2 in the Protocol was updated from:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
to:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
Table 2 was updated from:
| MHC II Allele DRB1*: | 1501 |
| MHC II Stock Concentration (mg/ml) | 1.3 |
| MHC II Stock Concentration (mM) | 20 |
| Vol. MHC II Stock to Add (ml) | 14.65 |
| Vol. Reaction Buffer to Add (ml): | 2885.35 |
| MHC II Master Mix Concentration (nM) | 101 |
to:
| MHC II Allele DRB1*: | 1501 |
| MHC II Stock Concentration (mg/ml) | 1.3 |
| MHC II Stock Concentration (μM) | 20 |
| Vol. MHC II Stock to Add (μl) | 14.65 |
| Vol. Reaction Buffer to Add (μl): | 2885.35 |
| MHC II Master Mix Concentration (nM) | 101 |
