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方法文章

一种用于多肽表位定量分析的高通量MHC II类分子结合检测方法

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DOI：

10.3791/51308

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2014年3月25日

 ,  ,  , 
1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Institute for Immunology and Informatics, University of Rhode Island, 3Department of Computer Science, Dartmouth College

本文内容

勘误通知

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摘要

使用重组人MHC II分子进行生化检测，可快速、定量地获得有关免疫原性表位鉴定、去除或设计的信息。 本文描述了一种适用于384孔板的肽-MHC II结合检测方法。这种成本效益高的检测格式在蛋白质去免疫化以及疫苗设计与开发领域中具有重要应用价值。

摘要

使用重组人 MHC II 分子进行的生化检测可快速、定量地提供有关免疫原性表位鉴定、删除或设计的见解1,2。本文将肽-MHC II 结合检测方法优化至 384 孔板格式。该简化后的实验方案可将试剂成本降低 75%，且通量高于此前报道的 96 孔板方法1,3-5。具体而言，该实验设计允许在单个 384 孔 ELISA 板上，对每种 MHC II 等位基因同时稳健、可重复地分析多达 15 种肽段。通过使用一台液体处理机器人，单名研究人员可在不到 48 小时内，针对八种浓度梯度和四种 MHC II 等位基因类型，对约 90 种待测肽段进行三复孔分析。从事蛋白质去免疫化或疫苗设计与开发领域的研究人员可能会发现该方案有助于推进自身工作。特别是，JoVE 提供的分步操作说明和可视化展示形式，可帮助其他用户在其各自实验室中快速、便捷地建立该技术方法。

引言

蛋白质是增长最快的治疗剂类别6，生物治疗药物研发管线的快速扩展使得人们对蛋白质药物在开发和使用过程中所面临的挑战日益关注。其中一个独特的考量因素在于，在健康且功能正常的免疫系统中，所有细胞外蛋白质都会被抗原呈递细胞（APCs）摄取。一旦被APCs内化，蛋白质将被切割成小肽片段，潜在的免疫原性片段会被装载到II型主要组织相容性复合物蛋白（MHC II）的结合槽中。肽-MHC II复合物随后呈现在APC表面，真正的免疫原性肽段（称为T细胞表位）会与相应的CD4+ T细胞表面受体形成MHC II-肽-T细胞受体三元复合物7这一关键的分子识别事件会启动复杂的信号级联反应，导致T细胞活化、细胞因子释放、CD4+ T细胞介导的B细胞成熟，最终产生可结合并清除致病性外源蛋白的循环IgG抗体。因此，可通过鉴定免疫原性蛋白中的T细胞表位，并突变参与MHC II类分子复合物形成的关键残基，实现蛋白的去免疫化。然而需要注意的是，T细胞表位数量较多且在免疫原性蛋白中分布广泛，大多数表位删除突变可能导致蛋白功能或稳定性的意外丧失。因此，设计去免疫化的生物治疗药物是一项复杂且技术上具有挑战性的目标，但目前已有一些成功删除T细胞表位的案例。3,5,8-12. 与基于嫁接的 "人源化"，尽管目前主要局限于抗体治疗领域，表位删除策略原则上可应用于任何蛋白质靶标，无论其序列、结构、功能如何，也不受同源人源支架是否可得的限制。实施该方法的第一步是鉴定嵌入在靶蛋白序列中的关键肽段表位。

利用合成肽和重组人MHC II分子进行高通量生化检测，可快速初步揭示表位鉴定与免疫原性降低的相关信息1,3-5。这类ELISA型检测可作为其他蛋白质/疫苗设计与开发工具的有力补充。例如，一种已被广泛采用的表位定位实验方法依赖于耗时、耗力且资源密集的ex vivo细胞增殖实验15。简而言之，首先将目标蛋白的一级序列划分为一组重叠肽段，通常为15个氨基酸长度的肽，相邻肽段之间有12个氨基酸的重叠。这些肽段通过化学合成制备，并在多种免疫检测中利用从人类供体分离的外周血单个核细胞（PBMC）测试每条肽段的免疫原性13,14。为了提高结果的可靠性，通常需使用来自50名或更多不同供体的PBMC对肽段进行重复测试。在以去免疫化为最终目标的情况下，工作量进一步增加：需要额外合成多组突变肽段，并在将任何去免疫化突变引入全长蛋白进行后续功能分析之前，先在PBMC检测中测试这些新肽段面板10。尽管这些细胞检测仍是评估人类患者免疫原性潜力的金标准，但通过快速、高通量的MHC II-肽结合检测预先筛选潜在的免疫原性表位，有望显著提高此类全面策略的效率。

同样，生化肽-MHC II 结合实验可与预测性 in silico 方法相结合，从而极大地加速表位鉴定过程。目前存在多种用于 T 细胞表位预测的计算工具，例如 ProPred16、MHCPred17、SVRMHC18、ARB19、SMM-align20、NetMHCIIpan21，以及 EpiVax 公司的专有工具 EpiMatrix22。此外，近年来表位预测工具已与其他生物信息学和分子建模工具相结合，开发出集成化的蛋白质去免疫化算法，旨在降低去免疫化突变可能破坏蛋白质结构和功能的风险23-26。尽管已有多种表位预测工具被证明具有较高的准确性27,28，但计算结果 invariably 需要通过实验验证。快速、高通量且成本效益高的实验方法最适合作为 in silico 表位预测的初步筛选手段。

类似地，表位预测工具可推动反向疫苗学中的抗原筛选29,30。例如，生物信息学的进步已实现全基因组筛选，能够快速识别出以完整蛋白质或从病原体蛋白质组中提取的肽段表位形式存在的疫苗候选物。尽管这一关键技术正在重塑保护性疫苗的发现与开发过程，但它也带来了一个新的挑战，即产生数量庞大且难以处理的免疫原性疫苗候选物列表。高通量肽段-MHC II 结合实验可通过量化肽段与多种 MHC II 等位基因之间的结合亲和力和结合广度，指导表位的选择。与蛋白质去免疫化类似，此类实验方法最终仍是验证计算预测出的有前景疫苗候选物所必需的。

本文介绍了一种适用于384孔板格式的肽段-MHC II类分子结合实验方法。该方案具有高度并行性，与先前报道的96孔板格式相比，可将试剂成本降低75%1,3-5。使用一台液体处理机器人，一名研究人员可在不到48小时内，针对四种MHC II类等位基因类型，以八个浓度梯度对约九十种待测肽段进行三复孔分析。本文详细描述了针对一种MHC II类等位基因分析七种实验肽段的单个384孔ELISA板的建立过程，同时提供了电子表格计算器作为补充材料，以便轻松将实验规模扩展至任意数量的目标肽段和/或MHC II类分子。

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方案

肽-MHC II 结合实验包含四个主要步骤：1-结合：待测肽段与标记的对照肽段在溶液中竞争结合可溶性 MHC II 蛋白。通过一系列不同浓度的待测肽段测定结合情况。2-捕获：当结合反应接近平衡后，利用固定化的抗体通过构象依赖性识别，将肽-MHC II 复合物从游离的肽段和蛋白质中捕获并分离出来。3-检测：使用时间分辨荧光法对捕获的对照肽段进行定量检测。4-分析：对光谱数据进行处理、绘图和分析，以确定待测肽段与 MHC II 蛋白之间的剂量依赖性结合特性。

在以下实验步骤中的多个环节，如果条件允许，建议使用液体处理机器人。特别是在384孔板体系中，自动加样和稀释液体可最大限度减少人为操作误差，使各孔之间的液体体积更加一致，并相比手动操作的96孔板检测获得更窄的IC50值95%置信区间（数据未显示）。若无液体处理机器人，标注有“（液体处理机器人）”的步骤可手动完成。同样，如条件允许，建议使用与384孔板兼容的自动洗板机，以有效标准化洗板过程。若无洗板机，标注有“（洗板机）”的步骤也可手动完成。

1. 包被 ELISA 板（第 1 天）

  1. 将 L243 抗体原液（0.5 mg/ml）用硼酸盐缓冲液稀释至工作浓度 10 µg/ml。
    1. 为包被一块 384 孔板，将 200 µl 抗体原液加入 9.8 ml 硼酸盐缓冲液中。（不同规模稀释请参见补充电子表格计算器）。
  2. 向 384 孔高结合白色 ELISA 板的每孔中加入 25 µl L243 抗体溶液。（使用液体处理机器人）
  3. 用聚酯膜密封板孔，并在 4 °C 下孵育过夜。
    注意：每块 384 孔 ELISA 板最多可容纳 15 种测试肽段，每种肽段设 8 个稀释度，对应一种 MHC II 等位基因，同时包含阳性和阴性对照。最终可获得三复孔测量结果。

2. 制备测试肽段稀释液（第1天）

  1. 从每种测试肽在 DMSO 中的 10 mM 原液开始，使用 384 孔聚丙烯板在柠檬酸磷酸盐缓冲液中配制以下系列稀释液（表 1）。（液体处理机器人）
    注意：一个完整的 384 孔聚丙烯板需要三个独立的 ELISA 板。三分之一的聚丙烯板仅需一个 ELISA 板（图 1）。
稀释序号从前一稀释液/原液中取用的体积需加入的柠檬酸盐缓冲液体积稀释液浓度结合反应中的浓度中和 ELISA 中的浓度
(μl)(μl)(μM)(μM)(μM)
10.735.1195.53197.76548.883
214.314.397.76548.88324.441
37.128.719.3899.6954.847
414.314.39.6954.8472.424
57.128.71.9230.9610.481
614.314.30.9610.4810.24
77.128.70.1910.0950.048
814.314.30.0950.0480.024
从第 8 号稀释液中移除并弃去 7.1 μl 肽溶液。

表1. 测试肽稀释系列的制备。

ELISA 板示意图；聚乙烯 vs. 高结合；肽梯度稀释；比较性检测结果。
图 1. 肽结合检测的板布局图。（A）聚丙烯384孔板中肽梯度稀释的布局。每块聚丙烯板可容纳三组15种肽，用于针对单一MHC II等位基因的竞争性结合反应。（B）结合反应接近平衡后，每组肽以三复孔形式转移至另一块已预先包被抗MHC II抗体的384孔ELISA板中。

3. 准备MHC II主混合液（第1天）

  1. 配制反应缓冲液
    1. 向 3,920 µl 的柠檬酸磷酸盐缓冲液中加入 80 µl 的 1 mM Pefa Bloc 和 60 µg 的辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷。（参见补充电子表格计算器以进行其他比例换算）。
  2. 使用 15 ml 圆底离心管，用反应缓冲液将选定的 MHC II 原液稀释至 101 nM（表 2）。
    注意：MHC II 在结合反应中的最终浓度为 50 nM，在中和 ELISA 检测中的最终浓度为 25 nM。MHC II 原液的浓度会因生产商批号不同而有所差异。（参见补充电子表格计算器）。
MHC II 等位基因 DRB1*:1501
MHC II 储存液浓度 (mg/ml)1.3
MHC II 储存液浓度 (µM)20
需加入的 MHC II 储存液体积 (µl)14.65
需加入的反应缓冲液体积 (µl):2885.35
MHC II 主混合液浓度 (nM)101

表2. MHC II主混合液的制备。

4. 准备阴性对照和阳性对照（第1天）

  1. 向步骤 2.1 中的 384 孔聚丙烯板的“阴性对照”孔中加入 21.5 µl 柠檬酸磷酸盐缓冲液（图 1A）。
  2. 向 384 孔聚丙烯板的“阳性对照”孔中加入 21.5 µl 柠檬酸磷酸盐缓冲液。
    注意： “阳性对照”将在下文第 5 节中完成。
  3. 从步骤 3.2 中取出 49.5 µl MHC II 主混合液，并用移液器转移至一个 1.5 ml Eppendorf 管中。
  4. 向步骤 4.3 中的 49.5 µl MHC II 主混合液中加入 0.5 µl 柠檬酸缓冲液。
  5. 将步骤 4.4 中浓度调整后的 MHC II 主混合液 21.5 µl 加入 384 孔聚丙烯板的“阴性对照”孔中（图 1A）。
    注意：此样品代表零信号阴性对照，含有 MHC II 蛋白、无对照肽和无待测肽。

5. 向 MHC II 预混液中加入适当对照肽段（第 1 天）

MHC II 等位基因 DRB1*生物素标记对照肽（残基）序列
0101Flu-HA-B(306-318)Biotin-(Ahx)(Ahx)PRYVKQNTLKLAT-amide
0301肌红蛋白(137-148)Biotin-(Ahx)-(Ahx)-LFRKDIAAKYKE-OH
0401YAR-B(1-14)Biotin-(Ahx)(Ahx)YARFQSQTTLKQKT-OH
0701TetTox-B(830-843)Biotin-(Ahx)(Ahx)QYIKANSKFIGITE-OH
1101Flu-HA-B(306-318)Biotin-(Ahx)(Ahx)PRYVKQNTLKLAT-amide
1501MBP-B (84-102)Biotin-(Ahx)(Ahx)NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH

*我们建议订购10 mg规格以节省成本。
表3. 各种MHC II等位基因的对照肽段。

  1. 将对照肽（以 DMSO 保存于 400 µM 浓度）用新鲜 DMSO 按 1:20 比例稀释，得到 20 µM 的稀释储备液。
    1. 取 25 µl 400 µM 对照肽加入 475 µl DMSO 中。注意：此比例为大量过量，但有助于准确操作黏稠的 DMSO 溶液。
  2. 将第 5.1 步中稀释后的对照肽（20 µM）进一步按 1:100 比例加入第 3.2 步制备的 MHC II 主混合液中。
    1. 取 28.8 µl 第 5.2 步稀释后的对照肽加入剩余的 2,850.5 µl MHC II 主混合液中。
  3. 取 21.5 µl 含对照肽的 MHC II 主混合液（第 5.2 步）加入 384 孔聚丙烯板的阳性对照孔中（第 4.2 步）（图 1A）。注意：该样品为高信号阳性对照，包含 MHC II 蛋白、对照肽，但不含待测肽。

6. 制备结合反应体系（第1天）

  1. 按1:1比例将含有对照肽的MHC II主混合液（步骤5.2）加入各测试肽稀释液（步骤2.1）中，以建立结合反应。
    1. 使用液体处理机器人，将步骤5.2中含对照肽的MHC II主混合液21.5 µl加入至步骤2.1中每种测试肽稀释液21.5 µl中。
  2. 用聚酯膜密封结合反应体系，并在37 °C、无CO2控制的培养箱中孵育12–24小时，期间不振荡。

7. 中和并转移结合反应（第2天）

  1. 从37 °C培养箱中取出含有结合反应液的384孔聚丙烯板（步骤6.2）。
  2. 用中和缓冲液将结合反应液按1:1比例稀释。（液体处理机器人）
    1. 向每个结合反应孔中加入43 µl中和缓冲液。
  3. 从4 °C取出ELISA板（步骤1.3），用每孔60 ml的PBS-0.05%吐温20溶液洗涤3次。（洗板机）
  4. 将步骤7.2中每个中和后的结合反应液各25 μl转移至步骤7.3中已包被抗体的384孔ELISA板的三个复孔中。（图1）（液体处理机器人）
  5. 用聚酯膜覆盖ELISA板，置于37 °C培养箱中孵育2.5小时，或置于4 °C冰箱中过夜。

8. ELISA 检测的建立（第2天或第3天）

  1. 从第 7.5 步中取出 ELISA 板，用 60 µl/孔的 PBS-0.05% Tween 洗涤 3 次。（使用板式洗涤仪）
  2. 将链霉亲和素-铕储备液（0.1 mg/ml 链霉亲和素，每链霉亲和素结合 7 个 Eu3+）用 DELFIA 检测缓冲液稀释 1,000 倍。
    1. 对于一块 384 孔板，将 10 µl 链霉亲和素-铕加入 10 ml 检测缓冲液中进行稀释。
  3. 向第 8.1 步的 384 孔 ELISA 板每孔中加入 25 µl 稀释后的链霉亲和素-铕溶液。（使用液体处理机器人）
  4. 用聚酯膜覆盖板孔，置于室温避光环境中孵育 1 小时。注意：在 1 小时孵育期间，从冰箱中取出增强溶液，并在避光条件下于室温放置 10 ml/板备用。
  5. 完成 1 小时孵育后，用 60 µl/孔的 PBS-0.05% Tween 对第 8.3 步的 384 孔 ELISA 板洗涤 3 次。（使用板式洗涤仪）
  6. 向第 8.5 步的 384 孔 ELISA 板每孔中加入 25 µl 增强溶液。（使用液体处理机器人）
  7. 用聚酯膜覆盖 384 孔 ELISA 板，置于室温避光环境中静置 10–15 分钟。
  8. 完成 10–15 分钟孵育后，使用时间分辨荧光酶标仪（设置为铕检测模式，例如：起始时间：200，终止时间：1,000，激发波长：340，发射波长：615，截止波长：无，PMT：自动，每孔读数次数：50）读取第 8.7 步 384 孔 ELISA 板的荧光信号。

9. 数据分析

  1. 以 XY 格式图表输入数据，将 3 次重复值置于并列的列中（X = 测试肽浓度；Y = 荧光测量值）。
  2. 对所有数据的 X 值进行对数转换：X = log(X)。
  3. 使用单一位点竞争性结合模型拟合对数转换后的数据，以提取 IC50 值。
  4. 将底部值约束为阴性对照的平均值。
  5. 对顶部值进行全局拟合，并确保全局拟合参数低于或等于阳性对照值。

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结果

阴沟肠杆菌 P99 β-内酰胺酶（BLA）（Genbank ID# X07274.1）的成熟肽序列通过 ProPred16 分析，预测其与 MHC II 等位基因 DRB1*1501 结合的潜在肽段（表4）。ProPred 鉴定出 117 个九肽，均含有必需的 P1 锚定残基（即 第1位为 M、L、I、V、F、Y 或 W，这是 MHC II 结合所必需的31）。在 5% 阈值下，仅得分大于或等于 2.6 的肽段才可能是结合物。因此，在 5% 阈值下，仅预测前 11 个肽段可结合 MHC II DRB1*1501。

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讨论

生物治疗药物已成为现代医学的基石，2012年销售额最高的五种药物中有四种属于此类32。生物制药行业已持续增长多年6，新型药物的不断开发以及生物类似药的出现进一步拓展了生物制药的研发管线。展望未来，评估并降低蛋白质治疗药物的免疫原性将成为早期生物治疗药物研发中不可或缺的环节。为促进这一过程，生物技术研究人员可利用表位预测的计算方法16-22，以及旨在降低免疫原性同时保持功能的整合性蛋白质设计算法3,23-26。同样，疫苗的设计与开发也可借助预测算法的强大能力4，而反向疫苗学的持续成熟有望为以往难以攻克的多种传染病病原体提供有效的保护性疫苗33。尽管这些计算工具具备显著加速药物和疫苗研发进程的潜力，但in silico预测的结果仍需进一步筛选，以确定数量可控且性能最优的候选分子。近年来，定量肽-MHC II分析技术的进展包括工程化酵母细胞表面展示系统34和基于微珠的发光氧通道免疫分析法35，但in vitro ELISA类检测仍是量...

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披露

Leonard Moise 任职于位于罗德岛州普罗维登斯的私营生物技术公司 EpiVax, Inc.，并持有该公司股票期权。本研究报告所包含的工作不受该公司商业目标可能带来的任何偏见影响。

致谢

本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）授予 CBK 和 KEG 的 R01-GM-098977 和 R21-AI-098122 基金项目资助。RSS 部分受卢斯基金会（Luce Foundation）研究员项目资助，部分受工程学院（Thayer School of Engineering）塔耶创新计划（Thayer Innovation Program）研究员项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
十水合四硼酸钠Sigma221732
柠檬酸SigmaC1901
磷酸氢二钠SigmaS7907
Trizma HClOmniPur9310
Tween-20SigmaP7949
100% DMSOSigmaD8418
辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷Fischer29836-26-8
Pefa Bloc SCFRoche1158591600
Dulbecco’s 10x 磷酸盐缓冲液Invitrogen14200-166
DELFIA 检测缓冲液Perkin Elmer4002-0010
DELFIA 增强缓冲液Perkin Elmer4001-0010
铕标记链霉亲和素Perkin Elmer1244-360
L243 抗 HLA-DR 抗体Biolegend307602
生物素化示踪肽21st Century Biochemicals定制订单
测试肽（1-4 mg，85% 纯度）Genscript定制订单
纯化的 HLA-DRB1 单体（非生物素化）Benaroya Research Institute*定制订单
384 孔白色 EIA/RIA 板Thermo460372
聚丙烯 384 孔板Costar3656
封膜，AxySeal，80 µm，ELISA 涂布器 Axygen AscientificPCR-SP
MilliQ 水N/AN/A
Epimotion 液体处理仪（或类似设备）Eppendorf5075
Select TS 板式洗板机（或类似设备）BioTek405
SpectraMax Gemini 微孔板读板仪（或类似设备）Molecular DevicesN/A
*重组人 MHC II 类分子可从 Benaroya 四聚体核心实验室获取。  参见：https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory

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勘误


Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 3/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*:1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml)1.3
MHC II Stock Concentration (mM)20
Vol. MHC II Stock to Add (ml)14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml):2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM)101

to:

MHC II Allele DRB1*:1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml)1.3
MHC II Stock Concentration (μM)20
Vol. MHC II Stock to Add (μl)14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl):2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM)101

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