软脑膜表面是中枢神经系统中一个独特的前体细胞区域，正受到越来越多的关注。本文详细介绍了一种利用改良电穿孔技术快速进行该前体区域遗传操作的方法。该方法可用于研究细胞谱系和参与细胞分化过程的信号通路，进而阐明子代细胞的命运及其生物学特性。
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本文内容
摘要
摘要
近年来，软脑膜表面被确认为在胚胎期、围产期及成年期神经发生和胶质发生过程中（包括损伤后）具有重要意义的生发微环境。然而，由于缺乏特异性或病毒制备过程耗时较长，针对这些前体细胞群体进行遗传学干预及谱系追踪的方法一直受到限制。因此，该领域的研究进展相对缓慢，针对此部位的研究报道寥寥无几。电穿孔技术已被用于胚胎神经干细胞特性研究超过十年，近年来也逐渐应用于出生后大脑的研究。本文介绍一种基于改良电穿孔技术的高效、快速且简便的软脑膜表面前体细胞遗传操作方法。软脑膜表面电穿孔可实现对这些前体细胞的便捷遗传标记与操控，因而为研究此类细胞提供了一种节省时间且经济有效的手段。
引言
神经干细胞和前体细胞存在于整个哺乳动物的中枢神经系统1,2。过去十年中，对胚胎期和成体脑与脊髓脑室周围区域的生发区中这些细胞的特性与性质已有广泛研究记录1-3。这在很大程度上得益于日益精确的遗传学工具的发展，例如神经系统特异性的Cre介导的floxed等位基因重组或逆转录病毒谱系示踪技术4。然而，其中一个前体细胞区域——软脑膜表面前体细胞区——直到最近才被初步详细描述5-7 ，仍需进一步系统深入的研究。
脑的软脑膜表面被定义为脑表面与周围脑膜之间的界面8。在发育过程中，神经上皮细胞以及随后的放射状胶质细胞终足会附着于该表面9,10。人类大脑中最早出现的一些神经元以及大量神经元的有丝分裂现象均在此区域被观察到11。在胚胎神经发生后期，皮质中间神经元除了通过中间带和室下带的迁移路径外，还已知会穿越软脑膜区域12-14。在此期间，该区域的干细胞可被培养，并且该区域似乎是神经发生和胶质发生的一个活跃部位5。在成年脑中，已有报道表明，在缺氧刺激后，中间神经元可由软脑膜表面的前体细胞产生7。然而，由于难以对该区域进行特异性研究，该区域在胚胎期及出生后发育过程中对神经发生的贡献仍不明确6。在上丘和大....
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方案
该操作程序符合西达赛奈医学中心动物护理和使用委员会（IACUC）的要求。研究人员在开展实验前应确保符合所在机构的IACUC规定。所有工具和试剂在使用前均应进行灭菌处理。
1. 工具、溶液和DNA混合物的准备
- 将100毫米长的火焰抛光硼硅酸盐玻璃毛细管插入微电极拉制仪中。设置加热参数，进行标准加权拉制，形成约17.5毫米长的移液尖端。使用锋利的外科剪刀在尖端起始处约8–9毫米处剪断，以获得直径约为100 µm的开口。
- 通过将经滤膜过滤的无核酸酶水（使用20 μm注射器滤膜）与快绿粉末混合，配制1% w/v的快绿储备液。
- 提取高浓度（即 > 3 μg/μl）且不含内毒素的纯化质粒DNA，并将其溶解于Tris-EDTA（TE）缓冲液中。将所需量的质粒加入TE缓冲液稀释液中，并加入1%快绿溶液，使其终浓度为1:10（即快绿终浓度为0.1% w/v）。为实现外源基因的高效表达，建议质粒终浓度为0.5–2.0 µg/µl。
2. 动物麻醉、移液管装载和软脑膜表面质粒注射
- 将出生后1-2天的小鼠置于放置于冰上的培养皿中，持续5-8分钟，以诱导低温麻醉 （时间取决于幼鼠的年龄/体重）。当通过趾部捏压无反应和/或尾部反射消失确认出现低体温后，小鼠即可进行注射。若动物出现疼痛反射，则应将其重新放回冰上。&....
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结果
软脑膜表面电穿孔可导致质粒DNA在软脑膜表面或其附近的细胞（主要是前体细胞）中表达6。更具体而言，电极的方向对于决定质粒移动方向及后续表达至关重要。因此，在双电极配置中，质粒大致沿负极与正极之间的直线向量移动。因此，若将负极置于注射部位上方，正极位于负极腹侧，则质粒将被驱向软脑膜表面。通常认为，将电极定向以使电流向量垂直于脑表面是最理想的情况。通过适当的电极定向并使用更小、更聚焦的靶向电极，存活率可达100%。然而，在某些区域（如中脑），必须注意避免电流传递可能引起心脏停搏，从而导致电穿孔小鼠幼崽存活率降低。新近描述的三电极配置或其他改进方法可能有助于靶向更困难的区域，同时避开涉及心率等重要功能的结构28。需密切观察幼崽是否被正确复温至其正常体温，复温成功的标志是出现活动和肤色恢复。当幼崽恢复肤色后，即可将其放回巢穴。我们最常使用的CD1品系母鼠会立即开始照料归巢的幼崽。然而，其他品系的行为可能更具变异性，可能出现攻击性或忽视行为。通常将垫料的气味转移到幼崽身上可有效预防这些问题。对于忽视或攻击行为严重的品系，将幼崽寄养至CD1品系母鼠是最有效的解决方案。
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讨论
成功转染软脑膜表面前体细胞的最关键因素包括：1）将质粒混合物准确靶向至软脑膜表面；2）避免在注射部位形成血肿；3）避免与中脑电穿孔相关的动物死亡。
准确地定位软脑膜表面需通过精确且谨慎地穿刺颅骨，以避免穿透软脑膜表面。若靶点定位不当，误及表层皮肤或深层脑室或脑实质，则会出现以下现象：1）轻轻摩擦组织时，亮绿染料随皮肤发生移位（即 快绿染料局限在颅骨上方的皮肤和结缔组织中，或2）快绿染料消失进入脑组织，表明质粒混合物已进入脑室和/或实质。质粒混合物正确位于软脑膜表面的证据是染料在颅骨下积聚，且轻柔移动皮肤无法使其移位。然而，实现精准靶向需要熟练的操作技巧。血肿的形成很可能是由于质粒注射破坏了血管系统所致。在电穿孔后数天至数周内取材组织时，可在注射部位观察到血凝块。为避免血肿，应调整液体注射的脉冲时长，和/或注意大脑血管的一般分布模式，以避免损伤血管。通常情况下，上丘区域较不易发生凝血。使用3 mm镊状电极可更集中地传递电流，从而避免因镊状电极释放的电流导致动物死亡；同时应如图所示将电极方向避开腹侧中脑区域。图2C 和.......
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披露
作者声明不存在相互竞争的经济利益。
致谢
作者感谢塞缪尔·奥斯钦综合癌症研究所癌症研究论坛奖、西达赛奈再生医学研究所以及古林家族提供的支持。本项目获得了国立卫生研究院研究资源中心资助的临床与转化科学研究所核心代金券的支持，资助编号为 UL1RR033176，目前该资助由国家推进转化科学中心负责，资助编号为 UL1TR000124。本内容仅由作者负责，不代表 NIH 的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 火焰抛光硼硅酸盐玻璃管 | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| 微电极拉制仪 | Sutter Instruments Company | P-30 | |
| 快绿FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 | |
| XenoWorks数字显微注射仪 | Sutter Instruments Company | ||
| ECM 830电穿孔仪 | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 | |
| 3毫米铂金镊状电极 | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 | |
| SignaGel导电电极凝胶 | Cardinal Health | 70315-025 | |
| Tris-EDTA缓冲液，pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 | |
| 红外加热灯 | VWR | 36547-009 | |
| 精细锐利剪刀 | Fine Science Tools | 14060-09 |
参考文献
- Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A.
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重印与许可
