由成纤维细胞构建的组织工程天然基质是一种新兴工具，可用于生成支持上皮细胞增殖和分化的间质基底。本文介绍了一种应用该方法评估不同类型间质细胞对肿瘤细胞生物学特性影响的实验方案。
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摘要
摘要
在嵌有间充质细胞的基质上培养上皮细胞的三维类器官培养体系，被广泛用于研究上皮细胞的分化与侵袭行为。传统上，大鼠尾部来源的I型胶原蛋白和/或源自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞的基质常被用作模拟间充质细胞（通常为成纤维细胞）所处的基质或间质微环境的底物。尽管使用此类基质的实验具有重要信息价值，但可以认为，由于这些底物中单一蛋白成分占主导（如I型胶原蛋白），或富含基底膜组分和生长因子（如小鼠肉瘤细胞来源的基质），它们并不能最真实地反映间质细胞自身对基质成分的贡献。为了研究从易发生肿瘤的遗传性大疱性皮肤病（隐性营养不良型大疱性表皮松解症）患者中分离得到的原代皮肤成纤维细胞所分泌的天然基质，我们改进了一种现有的天然基质制备方案，用于研究肿瘤细胞的侵袭能力。该方法诱导成纤维细胞在长期培养过程中自主分泌形成其天然基质，随后将该基质从培养皿上分离，并在其上接种上皮细胞，再将整个共培养体系置于气-液界面进行培养。随后可在不同时间点评估细胞的分化状态和/或侵袭行为。该技术能够在三维环境中评估上皮-间充质细胞间的相互作用，且无需使用人工或外源性基质，唯一的缺点是制备天然基质所需时间较长。本文中，我们描述了该技术的应用，用于评估成纤维细胞表达的一种分子——VII型胶原蛋白——抑制肿瘤细胞侵袭的能力。
引言
生物材料在三维组织培养中的应用使研究人员能够在实验室中更接近生理条件下研究细胞行为 体内 相较于在二维黏附条件和塑料基质上重建的环境，采用气-液界面三维培养方法在模拟复层上皮方面已取得显著进展。1-4这些技术能够真实模拟角质形成细胞的分化和肿瘤细胞的侵袭过程，为研究这些生物学过程的研究人员提供了更高的灵活性和保真度。用于模拟间质环境的生物材料基质主要采用Ⅰ型胶原、Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤基质以及去表皮真皮。例如，已发现癌症相关成纤维细胞可促进癌症的侵袭5，通过间质-上皮相互作用的起始与进展6,7 在这些底物中培养时。
在利用此类技术研究的最大且最受关注的分层上皮——皮肤中，模拟其基质环境的金标准被认为是去表皮人真皮（DED）。DED的制备需通过胰蛋白酶消化或物理分离的方法，将表皮从人尸体皮肤中去除3,4。然而，对于未与临床机构关联的实验室而言，获取此类皮肤非常困难，而病变真皮则几乎无法获得。作为替代方案，实验室常使用I型胶原（源自大鼠尾部）和/或Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤基质的组合。
1927年，Nageotte8发现可通过乙酸和盐....
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方案
本研究遵循赫尔辛基宣言原则，并获得了相应伦理委员会的批准。
1. 培养基与试剂的准备
- 200倍L-抗坏血酸-2-磷酸盐储备液的制备
- 每5 ml杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）溶液中溶解29 mg L-抗坏血酸-2-磷酸盐，并通过0.22 μm微孔滤膜过滤。分装为0.25 ml无菌等份，于-20 °C保存。
- 根据需要，在当天向每50 ml成纤维细胞培养基（含1% L-谷氨酰胺和10%胎牛血清的DMEM）中加入0.25 ml 200倍L-抗坏血酸-2-磷酸盐储备液，使L-抗坏血酸-2-磷酸盐终浓度为0.1 mM。
- 角质形成细胞生长培养基的制备
- 原代鳞状细胞癌角质形成细胞的分离与培养方法已有先前报道21，其中也描述了角质形成细胞生长培养基的制备方法。
- 简要步骤如下：
300 ml DMEM 和 100 ml Ham’s F-12，添加10% FBS
0.4 mg/ml 氢化可的松
5 mg/ml 胰岛素
10 ng/ml 表皮生长因子（EGF）
5 mg/ml 转铁蛋白
8.4 ng/ml 霍乱毒素
13 ng/ml 三碘甲状腺原氨酸
1x 青霉素-链霉素溶液
....
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结果
该技术为在不同三维间质环境下检测和比较肿瘤细胞（本例中为cSCC）的侵袭行为提供了可能。利用该技术，不仅可以构建模拟RDEB真皮环境的C7缺陷型天然基质，还可构建经基因工程改造而过表达C718的其他基质。如图2所示，与C7缺陷型RDEB对照基质相比，RDEB cSCC角质形成细胞在C7过表达的天然基质中的侵袭显著受到抑制。该侵袭行为通过标准组织学方法进行可视化观察，即将凝胶固定后包埋于石蜡块中，切片并进行免疫染色。建议用于染色的抗体包括：针对cSCC细胞的抗角蛋白14抗体（LL001）和针对成纤维细胞的抗波形蛋白抗体（V9）。
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讨论
由于本实验的性质，完成实验所需的总时间可能长达两个月。在此期间，必须格外小心，并采用无菌细胞培养技术，以防止微生物污染。
除了作为胶原蛋白中羟脯氨酸和羟赖氨酸合成过程中的辅因子外，抗坏血酸还能刺激成纤维细胞中胶原蛋白特异性mRNA的表达22。此处选用的抗坏血酸为更稳定的L-抗坏血酸-2-磷酸盐23。建议每周换液三次，但具体频率需根据所培养的细胞类型而定。初始的成纤维细胞培养物随着培养时间的延长会消耗更多营养物质，因此可能需要更频繁地更换培养基，并使用更大体积的培养液。在更换培养基时操作应轻柔，注意尽量减少对细胞层的扰动，尤其是在天然基质生成过程中。
基质通常在2周后变得可见，尤其是在孔板的周边区域。偶尔，基质会自行脱离，无需任何机械干预。这反映了基质内在的重塑过程及其张力强度，这种张力会将基质向内牵拉，但也可能表明在更换培养基时，原有基质的边缘区域受到了扰动。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
A.P.S 获得国际大疱性表皮松解症协会（DebRA International）和英国皮肤基金会的资助。Y.Z.N 获得新加坡科技研究局—邓迪大学合作博士项目（A*STAR - University of Dundee Partnership PhD Programme）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| L-抗坏血酸-2-磷酸 | Sigma | A8960 | |
| 含L-谷氨酰胺、4,500 mg/L D-葡萄糖、110 mg/L 丙酮酸钠的DMEM培养基 | Life Technologies | 11995-073 | |
| 100倍青霉素-链霉素溶液 | Life Technologies | 15070 | |
| 凡士林 | VWR | PROL28908.290 | |
| 克隆环 | Sigma | Z370789 | |
| 亲水性尼龙网滤膜，孔径100 μm，直径25 μm，每包100片 | Millipore | NY1H02500 | |
| 弯曲的不锈钢丝网支撑架 | 实验室自制 | 尺寸设计为可放入6孔板中 |
参考文献
- Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).
- Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M.
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重印与许可
