我们提出了一种用于三维（3D）组织学体积重建的图像配准方法，该方法有助于在由细胞构成的宏观结构水平上研究器官的变化。利用该方法，我们研究了野生型与Igfbp7基因敲除型乳腺组织之间的三维结构差异。
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摘要
摘要
组织学体积重建有助于在由细胞构成的宏观结构水平上研究器官的三维形态和体积变化。该技术还可用于研究和验证体积医学成像及治疗中的新技术与算法。构建不同器官的三维高分辨率图谱1,2,3也是组织学体积重建的另一项应用，为研究组织结构以及各种细胞特征之间的空间关系提供资源。本文介绍一种用于组织学体积重建的图像配准方法，该方法使用一组光学块面图像。重建所得的组织学体积能够可靠地反映样本的真实形状，且不引入传播性的后处理配准误差。本研究将两只小鼠乳腺的苏木精-伊红（H&E）染色切片与其对应的块面图像进行配准，配准过程利用了从组织学图像和块面图像中样本边缘提取的边界点。配准的准确性通过视觉方式进行评估，同时还在高分辨率下对乳腺宏观结构的对齐情况进行了视觉评估。
本研究详细阐述了该图像配准流程的各个步骤，从乳腺组织的切除到三维组织学体积重建。二维组织学图像可揭示成对切片之间的结构差异，而三维组织学体积则能够可视化乳腺在形态和体积上的差异。
引言
IGFBP7（胰岛素样生长因子结合蛋白7）属于胰岛素样生长因子结合蛋白家族，已被证明能够结合IGF1受体4。已知IGFBP7的下调与乳腺癌的不良预后相关5，而在异种移植肿瘤模型中重新引入IGFBP7可显著抑制肿瘤生长6，其机制涉及诱导细胞凋亡和细胞衰老7。为了研究IGFBP7的作用，研究人员构建了Igfbp7基因敲除小鼠5（未发表数据）。尽管这些小鼠不会自发形成肿瘤，但其卵巢、肌肉和肝脏组织的组织学结构出现改变，并伴有乳腺发育模式异常（未发表数据）。该缺陷表型最初表现为基因敲除小鼠产仔数量较少，且无法维持多次大规模繁殖（未发表数据）。
三维组织学体积图像有望为定量和比较分析以及体医学影像中病理学发现的评估提供有用信息。三维共聚焦、双光子显微镜可在局部范围内提供腺体的高分辨率细胞形态学信息14，但其视野和成像深度有限。组织学体积重建则可在更大的空间范围内提供更多信息。采用传统方法制备组织学切片时，通常会出现一些形变，如收缩、膨胀、撕裂和折叠。这些形变使得将连续的组织学图像配准为三维图像堆栈以重建三维体积变得困难。随着存在缺陷的连续切片数量增加，完整切片之间的相似性降低，从而使配准过程更加复杂。
已有多种方法被提出用于对齐组织学切片并构建连续的组织学三维体积。某些技术依赖于图像强度的变化
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方案
1. 样本
- 在乳汁分泌开始三天后，从野生型 CDH1 以及 Igfbp7 基因敲除小鼠中手术切除乳腺组织。
- 将乳腺组织铺展在玻璃载片上，以帮助恢复其天然的乳腺形态。
2. 固定与组织处理
- 将乳腺组织置于中性缓冲的4%多聚甲醛中，4 oC条件下固定过夜。
- 在组织处理前，将组织保存于70%乙醇中。
- 将乳腺组织转移至小型组织处理盒中。
- 使用自动组织处理仪进行组织处理
- 依次用浓度递增的乙醇和二甲苯溶液进行脱水：70%乙醇中45分钟，95%乙醇中两次、每次45分钟，100%乙醇中三次、每次1小时，二甲苯中两次、每次45分钟。
- 在真空加压条件下，用石蜡渗透组织，每次1小时，共3次。
- 将组织包埋于石蜡中制成蜡块，以备切片。
3. 组织学与块面成像
- 使用旋转式切片机修整石蜡包埋块，直至去除多余的石蜡。
- 使用垂直铣床在石蜡包埋块至少两个角上垂直于包埋盒的方向钻出1 mm的孔。
- 将组织块安装到旋转式切片机上。
- 在切片机前方安装切面成像系统19。 <....
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结果
传统显微技术的一个局限在于，对器官在微观层面的理解一次仅限于一个视野。即使是提供完整切片的“全视野”玻片，也无法提供三维信息。随着全切片动态扫描技术的发展，我们观察切片整体的能力已有所提升，但要推断结构仍需进行三维组织学体积重建。
为了更好地表征Igfbp7基因敲除小鼠的表型缺陷，对开始泌乳后3天切除的乳腺组织进行了三维重建。图1展示了本研究所提出方法在三维组织学重建中的流程。首先利用石蜡块四角的孔洞对块面图像进行配准。图2A-B分别显示了野生型和Igfbp7基因敲除型乳腺组织的块面图像体积。随后将组织学图像与其对应的已配准块面图像进行配准，以重建组织学体积。图3A-B分别展示了野生型和Igfbp7基因敲除型乳腺组织的重建后组织学体积。通过观察整体结构（视频A和B），可以发现突变型与野生型腺体在大小上的差异。然而，采用本文所述方法后可明显看出，这种大小差异主要体现在长度和宽度上，而有趣的是，在深度上并无显著差异。在本初步实验所用的样本中，野生型腺体深度为1.06 mm，而Igfbp.......
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讨论
本研究中，我们开发了一种图像配准工作流程，用于从连续的二维组织学图像重建三维组织学体积，该方法无需在组织内选择随机的内部标志点或植入基准标记物，从而避免对组织造成形变。根据所述方法，在切片前将光学块面图像本身用作参考图像。我们利用在石蜡块上钻取的外部孔洞来辅助对齐块面图像，并校正石蜡块在相机前发生的二维横向移动。将二维组织学图像与对应的二维块面图像对齐，以防止配准误差的累积传播，从而即使在因石蜡块问题导致连续切片存在缺陷的情况下，仍能重建出精确的组织学体积。为了使该工作流程独立于组织类型和所使用的组织学染色方法，我们采用边界点进行配准。这种基于点的方法相较于基于强度的方法具有优势，即计算需求更低，因而更适用于处理非常大的数字病理图像。
使用块面图像对齐组织学图像的另一个优势在于，组织学图像之间的间距不会影响其对齐生成组织学体积图像的质量。这一点在临床环境中尤为重要，因为切片间距可能变化很大，通常可大至半厘米。
在本文中，我们已证明该方法对于两种结构和强度变化不同的乳腺组织具有可重复性。由于该方法利用组织切片的边界信息，不同腺体.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
作者感谢桑尼布鲁克研究所的生物标志物成像 研究实验室（BIRL）提供的组织学服务。本研究得到了特里·福克斯基金会、加拿大乳腺癌基金会—草原-西北地区以及加拿大卫生研究院（CIHR）基金项目（#MOP-97996）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16% PFA | VWR International | 15710 | 16% 多聚甲醛溶液 |
| 小型组织处理盒 | VWR International | CA95029-956 | |
| Leica ASP300 全自动组织处理机 | Leica | 14047643515 | |
| 100% 乙醇 | Fisher Scientific | S25307B | |
| 二甲苯 | VWR International | CA95057-822 | |
| 石蜡 | Thermo Fisher | 39501006 | Paraplast 组织包埋介质 |
| Leica EG 1160 组织包埋中心 | Leica | ||
| Leica 旋转式切片机 | Leica | ||
| 研磨机 | Argo | ||
| 显微镜载玻片 | VWR International | CA48312-015 | |
| 苏木精-伊红染色（H&E 染色） | VWR International | ||
| 自动染色机 | |||
| 盖玻片 | VWR International | 48404-452 | |
| MEDITE RCM 7000 玻片封片机 | MEDITE | ||
| Leica SCN400 玻片扫描仪 | Leica | ||
| MATLAB | MathWorks Inc | MATLAB 2007b | 开发软件 |
| MeVisLab | MeVis Medical Solutions AG | MeVisLab 2.1 | 三维可视化软件 |
参考文献
- Sunkin, S. M., et al. Brain Atlas: An integrated spatiotemporal port for exploring the central nervous system. Nucleic Acids Research. 41, 996-1008 (2012).
- Shen, E. H., Overly, C. C., Jones, A. R. The Allen Huma....
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