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三维组织学图像体积重建及其在小鼠乳腺研究中的应用

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DOI：

10.3791/51325

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2014年7月26日

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1Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 2Platform Biological Sciences, Sunnybrook Research Institute, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Physical Sciences, Sunnybrook Research Institute, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 6Manitoba Institute of Cell Biology, University of Manitoba

本文内容

摘要

我们提出了一种用于三维（3D）组织学体积重建的图像配准方法，该方法有助于在由细胞构成的宏观结构水平上研究器官的变化。利用该方法，我们研究了野生型与Igfbp7基因敲除型乳腺组织之间的三维结构差异。

摘要

组织学体积重建有助于在由细胞构成的宏观结构水平上研究器官的三维形态和体积变化。该技术还可用于研究和验证体积医学成像及治疗中的新技术与算法。构建不同器官的三维高分辨率图谱1,2,3也是组织学体积重建的另一项应用，为研究组织结构以及各种细胞特征之间的空间关系提供资源。本文介绍一种用于组织学体积重建的图像配准方法，该方法使用一组光学块面图像。重建所得的组织学体积能够可靠地反映样本的真实形状，且不引入传播性的后处理配准误差。本研究将两只小鼠乳腺的苏木精-伊红（H&E）染色切片与其对应的块面图像进行配准，配准过程利用了从组织学图像和块面图像中样本边缘提取的边界点。配准的准确性通过视觉方式进行评估，同时还在高分辨率下对乳腺宏观结构的对齐情况进行了视觉评估。

本研究详细阐述了该图像配准流程的各个步骤，从乳腺组织的切除到三维组织学体积重建。二维组织学图像可揭示成对切片之间的结构差异，而三维组织学体积则能够可视化乳腺在形态和体积上的差异。

引言

IGFBP7（胰岛素样生长因子结合蛋白7）属于胰岛素样生长因子结合蛋白家族，已被证明能够结合IGF1受体4。已知IGFBP7的下调与乳腺癌的不良预后相关5，而在异种移植肿瘤模型中重新引入IGFBP7可显著抑制肿瘤生长6，其机制涉及诱导细胞凋亡和细胞衰老7。为了研究IGFBP7的作用，研究人员构建了Igfbp7基因敲除小鼠5（未发表数据）。尽管这些小鼠不会自发形成肿瘤，但其卵巢、肌肉和肝脏组织的组织学结构出现改变，并伴有乳腺发育模式异常（未发表数据）。该缺陷表型最初表现为基因敲除小鼠产仔数量较少，且无法维持多次大规模繁殖（未发表数据）。

三维组织学体积图像有望为定量和比较分析以及体医学影像中病理学发现的评估提供有用信息。三维共聚焦、双光子显微镜可在局部范围内提供腺体的高分辨率细胞形态学信息14，但其视野和成像深度有限。组织学体积重建则可在更大的空间范围内提供更多信息。采用传统方法制备组织学切片时，通常会出现一些形变，如收缩、膨胀、撕裂和折叠。这些形变使得将连续的组织学图像配准为三维图像堆栈以重建三维体积变得困难。随着存在缺陷的连续切片数量增加，完整切片之间的相似性降低，从而使配准过程更加复杂。

已有多种方法被提出用于对齐组织学切片并构建连续的组织学三维体积。某些技术依赖于图像强度的变化8，而另一些则基于切片的形态特征9。对于某些样本，可利用解剖结构作为标志点10,11，结合基于标志点的配准方法进行对齐12,13。但这些内部结构可能在整个体积中无法持续识别，且对于某些样本，难以确定可靠的解剖标志。一些研究团队采用逐对配准策略，利用轮廓或解剖结构将连续的组织学图像依次对齐16-18。在缺乏参考图像的情况下，将系列组织学切片相互配准可能导致配准误差累积，并改变组织学体积的真实形态。逐对配准方法依赖于整组图像中切片形态及内部结构的一致性，因此要求对样本进行密集采样，而这一点在某些情况下可能无法实现，e.g., 对于临床样本。

在此流程中，我们使用块面图像作为组织学体积重建的参考图像集19。块面图像在将石蜡包埋的组织块安装到切片机上后、每次切片前拍摄。因此，单个连续切片的损伤不会干扰连续切片之间的配准8,11,15。我们采集块面图像的方式与其他研究组不同。光学块面图像通过远心镜头获取，以消除或最小化桶形畸变和透视畸变，这类畸变在使用普通光学镜头时通常会出现。这是本方法相较于其他已发表方法的优势之一，后者使用普通镜头进行块面成像。图像以轻微倾斜角度拍摄，利用组织块表面的反射增强组织与石蜡表面之间的对比度，并消除石蜡表面下方组织在深度方向上的阴影。此外，还使用摄影滤光片对来自组织块表面和组织的光线进行偏振，以平衡对比度19。为校正组织块在旋转式切片机上的位移，在组织块的角落钻出两到三个小孔，这些小孔在块面图像中易于识别。这些孔的质心与基于标志点的刚性配准相结合，用于对齐块面图像。

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方案

1. 样本

  1. 在乳汁分泌开始三天后，从野生型 CDH1 以及 Igfbp7 基因敲除小鼠中手术切除乳腺组织。
  2. 将乳腺组织铺展在玻璃载片上，以帮助恢复其天然的乳腺形态。

2. 固定与组织处理

  1. 将乳腺组织置于中性缓冲的4%多聚甲醛中，4 oC条件下固定过夜。
  2. 在组织处理前，将组织保存于70%乙醇中。
  3. 将乳腺组织转移至小型组织处理盒中。
  4. 使用自动组织处理仪进行组织处理
    1. 依次用浓度递增的乙醇和二甲苯溶液进行脱水：70%乙醇中45分钟，95%乙醇中两次、每次45分钟，100%乙醇中三次、每次1小时，二甲苯中两次、每次45分钟。
    2. 在真空加压条件下，用石蜡渗透组织，每次1小时，共3次。
  5. 将组织包埋于石蜡中制成蜡块，以备切片。

3. 组织学与块面成像

  1. 使用旋转式切片机修整石蜡包埋块，直至去除多余的石蜡。
  2. 使用垂直铣床在石蜡包埋块至少两个角上垂直于包埋盒的方向钻出1 mm的孔。
  3. 将组织块安装到旋转式切片机上。
  4. 在切片机前方安装切面成像系统19。
  5. 在切片前采集石蜡块切面的光学图像。
  6. 在切片机上以5 μm厚度连续切出四片一组的切片条带。
    1. 将切片条带转移至冷水浴中。
    2. 分离条带中的第二片和第四片切片，并将其贴附于载玻片上。选择第二片和第四片可使相邻切片之间保持5 µm的间隔。
    3. 将每张切片在温水浴（48 oC）中展开以消除皱褶，然后重新贴附于载玻片上。
      注意：切片、贴片和展片过程可能导致切片出现撕裂、折叠、收缩或膨胀等形变。这些伪影会增加组织学切片配准的难度。
    4. 使用自动染色机对切片进行苏木精-伊红（H&E）染色。
    5. 使用自动封片机对载玻片进行封片。
    6. 使用数字组织学切片扫描仪以目标分辨率对切片进行数字化。本实验方案采用20倍放大倍数，分辨率为0.47 μm。
    7. 将组织学图像降采样至与块面图像相同的分辨率，即18 μm。

4. 图像配准

  1. 图像分割与点选择
    1. 在块面图像中测量定位孔的像素值，并使用平均值作为固定阈值，以分割石蜡块角落中的定位孔。
    2. 由于使用固定阈值可能会额外分割出其他部分，因此利用分割对象的圆形度和面积来识别定位孔并剔除多余对象。为此，编写一小段代码，计算各分割对象的 (4π × 面积)/(周长)2 比值，该比值在圆形物体中为 1。
    3. 针对每个乳腺组织，选择一幅块面图像作为参考图像，并利用定位孔中心及基于标志点的配准技术，将其余块面图像与参考图像对齐。
    4. 对于已对齐的块面图像，手动分割或提取组织区域以去除背景。在后续流程中使用掩膜中面积最大的对象。
    5. 对于 H&E 切片，按以下步骤进行自动分割。
      1. 采用 Otsu 阈值法20 将组织学图像与背景分离，并生成组织学图像的二值掩膜。
      2. 利用标记对象的直方图，在每个掩膜中识别并选择面积最大的对象。
      3. 从组织学图像和块面图像的掩膜中提取宽度为一个像素的边界点。
      4. 使用链码算法21，将边界点表示为一系列分段线性拟合。
  2. 初始刚性配准
    1. 采用傅里叶描述子算法22，计算组织学图像边界点与其对应块面图像边界点之间的初始刚性变换。该初始变换包括平移、旋转和缩放因子。
    2. 利用上一步获得的初始变换对每幅组织学图像进行变换。
  3. 刚性配准的优化
    1. 使用滚珠滤波器23 去除组织学轮廓中高曲率的边缘部分。
    2. 使用均匀分布从剩余的组织学边界点中随机选取 500 个点。
    3. 利用傅里叶描述子获得的初始变换，对组织学随机边界点进行变换。
    4. 选取全部块面图像边界点，使用迭代最近点（ICP）算法24 计算块面边界点（目标）与组织学随机边界点之间的刚性变换。
    5. 对上一步获得的已对齐组织学图像进行变换，由此生成的图像序列构成组织学三维体积数据。
    6. 使用三维可视化软件生成组织学体积数据的可视化图像。
  4. 以 5 倍放大倍率查看图像序列
    1. 将原始组织学图像下采样至 5 倍放大倍率。
    2. 在一幅组织学图像中裁剪出感兴趣区域。
    3. 结合两次配准步骤所得的刚性变换，计算该区域在其他 5 倍放大倍率组织学图像中的位置。
    4. 在所有其他组织学图像中，将感兴趣区域裁剪为相同尺寸的区域。
    5. 最后手动优化各区域之间的对齐效果。编写一个程序，能够叠加两幅图像，允许用户调节其中一幅图像相对于另一幅的旋转和平移参数，并在对齐满意后保存变换后的图像。
    6. 使用三维可视化软件查看已对齐的 5 倍放大倍率组织学区域图像序列。

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结果

传统显微技术的一个局限在于，对器官在微观层面的理解一次仅限于一个视野。即使是提供完整切片的“全视野”玻片，也无法提供三维信息。随着全切片动态扫描技术的发展，我们观察切片整体的能力已有所提升，但要推断结构仍需进行三维组织学体积重建。

为了更好地表征Igfbp7基因敲除小鼠的表型缺陷，对开始泌乳后3天切除的乳腺组织进行了三维重建。图1展示了本研究所提出方法在三维组织学重建中的流程。首先利用石蜡块四角的孔洞对块面图像进行配准。图2A-B分别显示了野生型和Igfbp7基因敲除型乳腺组织的块面图像体积。随后将组织学图像与其对应的已配准块面图像进行配准，以重建组织学体积。图3A-B分别展示了野生型和Igfbp7基因敲除型乳腺组织的重建后组织学体积。通过观察整体结构（视频A和B），可以发现突变型与野生型腺体在大小上的差异。然而，采用本文所述方法后可明显看出，这种大小差异主要体现在长度和宽度上，而有趣的是，在深度上并无显著差异。在本初步实验所用的样本中，野生型腺体深度为1.06 mm，而Igfbp...

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讨论

本研究中，我们开发了一种图像配准工作流程，用于从连续的二维组织学图像重建三维组织学体积，该方法无需在组织内选择随机的内部标志点或植入基准标记物，从而避免对组织造成形变。根据所述方法，在切片前将光学块面图像本身用作参考图像。我们利用在石蜡块上钻取的外部孔洞来辅助对齐块面图像，并校正石蜡块在相机前发生的二维横向移动。将二维组织学图像与对应的二维块面图像对齐，以防止配准误差的累积传播，从而即使在因石蜡块问题导致连续切片存在缺陷的情况下，仍能重建出精确的组织学体积。为了使该工作流程独立于组织类型和所使用的组织学染色方法，我们采用边界点进行配准。这种基于点的方法相较于基于强度的方法具有优势，即计算需求更低，因而更适用于处理非常大的数字病理图像。

使用块面图像对齐组织学图像的另一个优势在于，组织学图像之间的间距不会影响其对齐生成组织学体积图像的质量。这一点在临床环境中尤为重要，因为切片间距可能变化很大，通常可大至半厘米。

在本文中，我们已证明该方法对于两种结构和强度变化不同的乳腺组织具有可重复性。由于该方法利用组织切片的边界信息，不同腺体...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

作者感谢桑尼布鲁克研究所的生物标志物成像 研究实验室（BIRL）提供的组织学服务。本研究得到了特里·福克斯基金会、加拿大乳腺癌基金会—草原-西北地区以及加拿大卫生研究院（CIHR）基金项目（#MOP-97996）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% PFAVWR International1571016% 多聚甲醛溶液
小型组织处理盒VWR InternationalCA95029-956
Leica ASP300 全自动组织处理机Leica14047643515
100% 乙醇Fisher ScientificS25307B
二甲苯VWR International CA95057-822
石蜡 Thermo Fisher39501006Paraplast 组织包埋介质
Leica EG 1160 组织包埋中心Leica
Leica 旋转式切片机Leica
研磨机Argo
显微镜载玻片VWR International CA48312-015
苏木精-伊红染色（H&E 染色）VWR International
自动染色机
盖玻片 VWR International 48404-452
MEDITE RCM 7000 玻片封片机MEDITE
Leica SCN400 玻片扫描仪Leica
MATLABMathWorks IncMATLAB 2007b开发软件
MeVisLabMeVis Medical Solutions AGMeVisLab 2.1三维可视化软件

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