利用双分子荧光互补技术在烟草原生质体和叶片中可视化蛋白质-蛋白质相互作用

摘要

蛋白质复合物的形成 体内 可通过双分子荧光互补技术进行可视化。将相互作用的蛋白分别与荧光标记物的互补片段融合，并在烟草叶片中瞬时表达，当两种蛋白彼此靠近时，可重建出荧光信号。

摘要

许多蛋白质会与其他蛋白质发生瞬时相互作用，或被整合到多蛋白复合物中以执行其生物学功能。双分子荧光互补（BiFC）是一种在活体植物细胞中监测此类相互作用的in vivo方法。在本实验方案中，将待研究的候选蛋白分别与荧光蛋白的互补片段融合，并通过农杆菌介导的转化方法将相应的构建体导入植物细胞。随后，在烟草叶片中瞬时表达这些蛋白，利用共聚焦激光扫描显微镜可在完整细胞中检测到恢复的荧光信号。该方法不仅能够可视化蛋白质间的相互作用，还可确定蛋白复合物的亚细胞定位。为此，可将带有荧光标记的标记基因与BiFC构建体共同表达，从而显示内质网、线粒体、高尔基体或质膜等细胞结构。荧光信号可在表皮叶细胞或从转化后的烟草叶片中轻松分离的原生质体中直接观察。BiFC非常适用于在活细胞的自然环境中研究蛋白质-蛋白质相互作用。然而需要注意的是，表达需由强启动子驱动，且由于融合了相对较大的荧光标签，相互作用伙伴可能被修饰，从而可能干扰相互作用机制。尽管如此，BiFC仍是研究蛋白质-蛋白质相互作用的其他常用方法（如免疫共沉淀、in vitro pull-down实验或酵母双杂交实验）的一种极佳的互补手段。

引言

研究植物细胞中蛋白质复合物的形成及其定位 体内 对于研究细胞网络、信号传导和代谢过程至关重要。BiFC 可在活体植物细胞的天然环境中直接可视化蛋白质-蛋白质相互作用^1-5.

在双分子荧光互补（BiFC）方法中，荧光蛋白的两个无荧光的N端和C端片段互补结合，形成重建的荧光蛋白。多种不同荧光蛋白的片段已被用于检测蛋白质相互作用。 例如 绿色荧光蛋白（GFP），其发色团由三个不同的残基在化学上形成⁶荧光蛋白可在环状区域或β-链处被分割成两个无荧光的片段，并可分别与目标蛋白融合。该检测方法可用于在任何可进行有氧生长且能够通过遗传修饰表达融合蛋白的生物体或细胞中，检测任意亚细胞区域内的蛋白相互作用。当两个目标蛋白在细胞内相互靠近时，荧光得以重建，可通过显微镜观察，无需添加外源性荧光染料或染色剂。³.

烟草（Nicotiana benthamiana已证明，利用农杆菌介导的烟草叶片转化方法将构建体导入植物，可便捷地表达目标蛋白，因此本体系成为可视化植物蛋白相互作用的理想模式系统。农杆菌含有称为Ti质粒（肿瘤诱导质粒）的元件，其编码的酶可介导目的基因转入植物细胞。双分子荧光互补技术（BiFC）适用于所有细胞区室中的可溶性蛋白及膜结合蛋白，并已在过去数年中成功用于鉴定相互作用的蛋白质。 体内 以及分析....

方案

1. 农杆菌中BiFC载体的转化

1. 双分子荧光互补（BiFC）载体的克隆
   1. 使用含有侧翼 attB 位点的寡核苷酸，从合适的模板中扩增目的基因。采用具有校对功能的 DNA 聚合酶进行 PCR 扩增。根据设计的引物组合和片段大小，调整退火步骤的时长和延伸步骤的时长。通过琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，并使用 PCR 纯化试剂盒进行纯化。
   2. 将获得的 DNA 片段与入门载体使用 BP 重组酶进行 BP 反应。将 15–150 ng 的 attB-PCR 产物与 150 ng 的入门载体混合，加入 2 µl BP 重组酶，再用 TE 缓冲液补足至总体积 8 µl。在室温下孵育反应 1 小时，然后加入 2 µl 蛋白酶 K，在 37 °C 下孵育 10 分钟以终止反应。
   3. 将整个反应体系转化至感受态 E. coli DH5α 细胞中，通过菌落 PCR 筛选转化子，以确认 DNA 片段正确插入载体。对阳性质粒进行 DNA 测序，以验证无突变产生。
   4. 将获得的入门克隆与相应的目的载体使用 LR 重组酶进行 LR 重组反应 。将 50–150 ng 的入门载体与 150 ng 的目的载体混合，加入 1 µl LR 重组酶，再用 TE 缓冲液补足至总体积 5 µl。在室温下孵育反应 1 小时，然后加入 1 µl 蛋白酶 K，在 37 °C 下孵育 10 分钟以终止反应。
   5. 将整个反应体系转化至感....

结果

在本示例中，我们采用双分子荧光互补（BiFC）方法监测细胞质分子伴侣HSP90与膜锚定蛋白AtTPR7和Toc64之间的相互作用。AtTPR7是Sec易位子的组成部分，可与细胞质伴侣蛋白相互作用，可能参与将分泌型前体蛋白递送至内质网膜进行翻译后易位。同样，位于叶绿体外膜的Toc64也通过接收与HSP90结合的叶绿体前体蛋白，参与翻译后蛋白输入过程。这两种蛋白均含有暴露于细胞质的TPR结构域，该结构域可介导与HSP90羧基末端MEEVD基序的相互作用。

通过特异性重组酶将蛋白质克隆至合适的载体中，使含有TPR结构域的衔接蛋白与Venus^N融合，确保荧光标签连接至胞质结构域，从而不影响蛋白质的靶向定位及膜插入。对于HSP90，则将SCFP^C融合至其N端，以避免干扰C端的MEEVD基序（图1和图2）。

将AtTPR7和HSP90与内质网标记物（mCherry）共转化，以验证蛋白复合物的定位。利用激光扫描显微镜检测完整叶片中.......

讨论

在设计双分子荧光互补（BiFC）实验时，应考虑若干要点。尽管无需了解目标蛋白的结构信息，但在研究跨膜蛋白时必须明确其拓扑结构。荧光蛋白必须位于相同的亚细胞区室，或朝向膜的同一侧，才能发生相互作用。通常情况下，若目标蛋白需要N端定位信号序列，则只能考虑使用C端标签。由于标签可能干扰目标蛋白的正确靶向或膜插入，因此建议预先检测其亚细胞定位，例如 通过表达GFP标记的蛋白进行验证。此外，应始终设置阴性对照。在本例中，我们构建了一个仅在细胞质中表达SCFP^C的对照载体。然而，任何预期不会发生相互作用的蛋白均可作为阴性对照。为验证载体的正确表达，特别是在无可见荧光的情况下，可对侵染后的叶片或原生质体提取蛋白，进行SDS-PAGE电泳，并使用针对相应标签的抗体检测蛋白表达水平。

荧光信号可在完整叶片或分离的原生质体中进行监测。尽管在整片叶片中检测速度更快，但在原生质体中可更清晰地观察到精细结构的信号。此外，观察整片叶片时主要监测的是表皮细胞，而表皮细胞不含叶绿体。因此，在分析叶绿体蛋白时，建议分离原生质体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3',5'-二甲氧基-4'-羟基苯乙酮	西格玛-奥德里奇	D134406	乙酰丁香酮
纤维素酶，Onozuka-R10	Serva	16419	源自 Trichoderma viridae
离析酶 R-10	Serva	28302	源自 Rhizopus sp.
GATEWAY BP Clonase II 酶试剂盒	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY LR Clonase II 酶试剂盒	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel 和 PCR 纯化试剂盒	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE	Invitrogen		Gateway 克隆
pDEST-VYNE(R)GW	Invitrogen		Gateway 克隆
pDEST-SCYCE(R)GW	Invitrogen		Gateway 克隆