利用双分子荧光互补技术在烟草原生质体和叶片中可视化蛋白质-蛋白质相互作用

摘要

蛋白质复合物的形成 体内 可通过双分子荧光互补技术进行可视化。将相互作用的蛋白分别与荧光标记物的互补片段融合，并在烟草叶片中瞬时表达，当两种蛋白彼此靠近时，可重建出荧光信号。

摘要

许多蛋白质会与其他蛋白质发生瞬时相互作用，或被整合到多蛋白复合物中以执行其生物学功能。双分子荧光互补（BiFC）是一种在活体植物细胞中监测此类相互作用的in vivo方法。在本实验方案中，将待研究的候选蛋白分别与荧光蛋白的互补片段融合，并通过农杆菌介导的转化方法将相应的构建体导入植物细胞。随后，在烟草叶片中瞬时表达这些蛋白，利用共聚焦激光扫描显微镜可在完整细胞中检测到恢复的荧光信号。该方法不仅能够可视化蛋白质间的相互作用，还可确定蛋白复合物的亚细胞定位。为此，可将带有荧光标记的标记基因与BiFC构建体共同表达，从而显示内质网、线粒体、高尔基体或质膜等细胞结构。荧光信号可在表皮叶细胞或从转化后的烟草叶片中轻松分离的原生质体中直接观察。BiFC非常适用于在活细胞的自然环境中研究蛋白质-蛋白质相互作用。然而需要注意的是，表达需由强启动子驱动，且由于融合了相对较大的荧光标签，相互作用伙伴可能被修饰，从而可能干扰相互作用机制。尽管如此，BiFC仍是研究蛋白质-蛋白质相互作用的其他常用方法（如免疫共沉淀、in vitro pull-down实验或酵母双杂交实验）的一种极佳的互补手段。

引言

研究植物细胞中蛋白质复合物的形成及其定位 体内 对于研究细胞网络、信号传导和代谢过程至关重要。BiFC 可在活体植物细胞的天然环境中直接可视化蛋白质-蛋白质相互作用^1-5.

在双分子荧光互补（BiFC）方法中，荧光蛋白的两个无荧光的N端和C端片段互补结合，形成重建的荧光蛋白。多种不同荧光蛋白的片段已被用于检测蛋白质相互作用。 例如 绿色荧光蛋白（GFP），其发色团由三个不同的残基在化学上形成⁶荧光蛋白可在环状区域或β-链处被分割成两个无荧光的片段，并可分别与目标蛋白融合。该检测方法可用于在任何可进行有氧生长且能够通过遗传修饰表达融合蛋白的生物体或细胞中，检测任意亚细胞区域内的蛋白相互作用。当两个目标蛋白在细胞内相互靠近时，荧光得以重建，可通过显微镜观察，无需添加外源性荧光染料或染色剂。³.

烟草（Nicotiana benthamiana已证明，利用农杆菌介导的烟草叶片转化方法将构建体导入植物，可便捷地表达目标蛋白，因此本体系成为可视化植物蛋白相互作用的理想模式系统。农杆菌含有称为Ti质粒（肿瘤诱导质粒）的元件，其编码的酶可介导目的基因转入植物细胞。双分子荧光互补技术（BiFC）适用于所有细胞区室中的可溶性蛋白及膜结合蛋白，并已在过去数年中成功用于鉴定相互作用的蛋白质。 体内 以及分析蛋白质内的相互作用位点^7-9在导入基因表达后，可直接在叶片中观察到荧光蛋白的相互作用，该方法适用于观察内质网（ER）、质膜或叶绿体等较大的细胞结构。然而，若需监测更精细结构中的定位情况，例如 叶绿体被膜，建议对从转化的烟草叶片中分离的原生质体进行荧光观察。在植物中进行双分子荧光互补（BiFC）实验时，需使用一组包含C端或N端荧光标签的BiFC载体。¹⁰. 下文所述方案用于研究细胞质热休克蛋白90（HSP90）与四肽重复结构域（TPR）之间的相互作用 定位于叶绿体外膜和内质网的含结构域对接蛋白Toc64和AtTPR7^11-13为此，将HSP90与SCFP的C末端部分融合（SCFP^C）。该标签在伴侣蛋白的N端融合，以确保HSP90的C端MEEVD结合基序可被钳形TPR结构域识别并结合。同时，Venus的N端部分（Venus^N）分别与含有TPR结构域的停泊蛋白Toc64和AtTPR7的胞质结构域融合。作为阴性对照，我们克隆了SCFP的可溶性C末端部分^C 仅存在于细胞质中，因此是合适的对照。

所研究蛋白的荧光标签必须朝向相同的细胞区室，以允许二者紧密接近，从而实现荧光信号的重建。为了确定重建后荧光信号的定位，可通过共转化带有不同荧光标签的标记蛋白，以示踪相互作用发生的亚细胞位置。在定位于内质网的 AtTPR7¹⁴ 实验中，同时转化了与 mCherry 融合的内质网标记蛋白。对于 Toc64，则利用叶绿素的自发荧光作为叶绿体标记。通过该方法，不仅可直接在烟草叶片中实时监测 Toc64 和 AtTPR7 分别与胞质 HSP90 分子伴侣的 in vivo 相互作用，还可进一步研究该相互作用的亚细胞定位。

BiFC 非常适合作为研究蛋白质-蛋白质相互作用的其他方法的补充手段。与免疫共沉淀相比， 体外 例如，在下拉实验中，目的蛋白无需有特异性抗体可供使用，也无需进行重组表达。 体外，这可能具有挑战性，尤其是对于膜蛋白而言。此外，由于蛋白间的相互作用会通过融合的荧光标签结合而被捕获，因此BiFC也可用于监测瞬时相互作用。¹⁵.

方案

1. 农杆菌中BiFC载体的转化

1. 双分子荧光互补（BiFC）载体的克隆
   1. 使用含有侧翼 attB 位点的寡核苷酸，从合适的模板中扩增目的基因。采用具有校对功能的 DNA 聚合酶进行 PCR 扩增。根据设计的引物组合和片段大小，调整退火步骤的时长和延伸步骤的时长。通过琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，并使用 PCR 纯化试剂盒进行纯化。
   2. 将获得的 DNA 片段与入门载体使用 BP 重组酶进行 BP 反应。将 15–150 ng 的 attB-PCR 产物与 150 ng 的入门载体混合，加入 2 µl BP 重组酶，再用 TE 缓冲液补足至总体积 8 µl。在室温下孵育反应 1 小时，然后加入 2 µl 蛋白酶 K，在 37 °C 下孵育 10 分钟以终止反应。
   3. 将整个反应体系转化至感受态 E. coli DH5α 细胞中，通过菌落 PCR 筛选转化子，以确认 DNA 片段正确插入载体。对阳性质粒进行 DNA 测序，以验证无突变产生。
   4. 将获得的入门克隆与相应的目的载体使用 LR 重组酶进行 LR 重组反应 。将 50–150 ng 的入门载体与 150 ng 的目的载体混合，加入 1 µl LR 重组酶，再用 TE 缓冲液补足至总体积 5 µl。在室温下孵育反应 1 小时，然后加入 1 µl 蛋白酶 K，在 37 °C 下孵育 10 分钟以终止反应。
   5. 将整个反应体系转化至感受态 E. coli DH5α 细胞中，通过菌落 PCR 筛选转化子，以确认 DNA 片段正确插入载体。此步骤无需进行 DNA 测序。
   6. 使用质粒小提试剂盒提取质粒 DNA，以确保高纯度。
2. 制备化学感受态农杆菌（菌株 AGL1，利福平和羧苄青霉素抗性）
   1. 从保存的菌种中划线接种农杆菌，在 28 °C 下培养 24 小时。
   2. 挑取单菌落接种于 5 ml LB 培养基中，28 °C 过夜培养。
   3. 取 2 ml 过夜培养物接种于 50 ml LB 培养基中，于 28 °C 培养约 4 小时，至 OD₆₀₀ 达到 1.0。
   4. 在 4 °C 下以 3,000 x g 离心 15 分钟，弃上清，将沉淀重悬于 1 ml 冰冷的无菌 CaCl₂（10 mM）溶液中。此后始终保持细胞处于冰上。
   5. 将细胞分装为 100 µl 每份，立即在液氮中速冻，并于 -80 °C 保存。
3. 化学感受态农杆菌的转化
   1. 将一份感受态 AGL1 细胞在冰上解冻。向细胞中加入 1–2 µg 质粒 DNA。在冰上孵育 5 分钟，液氮中孵育 5 分钟，再于 37 °C 孵育 5 分钟。向细胞中加入 600 µl LB 培养基，于 28 °C、650 rpm 摇床培养 4 小时。
   2. 在 8,000 x g 下离心 1 分钟，弃上清。将沉淀重悬于 50 µl 剩余 LB 培养基中，涂布于含相应抗生素的 LB 平板上。密封平板后于 28 °C 培养 2 天。通过菌落 PCR 筛选菌落，检测质粒的存在。
   3. 挑取一个阳性菌落接种于含相应抗生素的 5 ml LB 培养基中，28 °C 过夜培养。将 500 µl 过夜培养物与 500 µl 50% 无菌甘油混合，于 -80 °C 冻存。
   4. 从甘油保存液中直接接种农杆菌至含相应抗生素的 LB 培养基中，用于烟草叶片的瞬时转化。

2. 烟草叶片的瞬时转化

1. 农杆菌培养
   1. 配制以下储备液：乙酰丁香酮（150 mM，溶于70%乙醇），分装后于-20 °C保存。MES/KOH（0.1 M）pH 5.7，4 °C保存（无菌 条件下经0.2 µM滤膜过滤，以防止长期储存期间细菌生长）， MgCl₂（1 M）储备液，室温保存。
   2. 在无菌50 ml离心管中，取10 ml含适当抗生素的LB培养基，接种50 µl含有目标质粒的AGL1甘油保存菌种，于28 °C、190 rpm振荡培养至少24小时，直至OD₆₀₀达到1.0–2.0。
   3. 在3,000 x g条件下离心细菌15分钟。将菌体沉淀重悬于新鲜配制的侵染缓冲液[MgCl₂（10 mM）、MES/KOH（10 mM）pH 5.7、乙酰丁香酮（150 µM）]中，并将菌液浓度调整至OD₆₀₀为1.0。
   4. 将农杆菌置于摇床中，避光孵育2小时。此后即可用于侵染。
2. 烟草叶片侵染
   1. 使用三周龄的烟草（Nicotiana benthamiana）植株。选择数片较老的叶片进行侵染。
   2. 将携带目标载体的农杆菌菌液等体积混合（各3 ml）。取一支5 ml无针头注射器进行侵染操作。在叶片背面多个位置轻轻按压注射器，将菌悬液小心注入烟草叶片组织中。
   3. 给植株充分浇水，并置于黑暗环境中培养两天。

3. 原生质体准备

烟草叶片原生质体的制备方法参照Koop 等¹⁶的方法并稍作修改。

1. 缓冲液配制
   1. 配制 F-PCN 培养基：大量盐类 [KNO₃ (1012 µg/ml)、CaCl₂•2H₂O (440 µg/ml)、MgSO₄•7H₂O (370 µg/ml)、KH₂PO₄ (170 µg/ml)、NH₄-丁二酸盐 [(20 mM；配制 2 M 储存液（丁二酸 (236 µg/ml) 和 NH₄Cl (106 µg/ml)，调节 pH 至 5.8 以溶解)]，微量盐类 [EDTA-Fe(III) x Na 盐 (40 µg/ml)、KJ (0.75 µg/ml)、H₃BO₃ (3 µg/ml)、MnSO₄•H₂O (10 µg/ml)、ZnSO₄•7H₂O (2 µg/ml)、Na₂MoO₄•7H₂O (0.25 µg/ml)、CuSO₄•5H₂O (0.025 µg/ml)、CoCl₂•6H₂O (0.025 µg/ml)]，MES (390 µg/ml)，葡萄糖（约 80 µg/ml），渗透压 550 mOsm，pH 5.8（用 KOH 调节）。分装后于 -20 °C 保存。
   2. 配制 F-PIN 培养基：成分与 F-PCN 相同，但以蔗糖替代葡萄糖（约 110 µg/ml），渗透压 550 mOsm，pH 5.8（用 KOH 调节）。分装后于 -20 °C 保存。
   3. 配制 W5 培养基：150 mM NaCl、125 mM CaCl₂、5 mM KCl、2 mM MES，渗透压 550–580 mOsm，pH 5.7（用 KOH 调节）。4 °C 保存（使用 0.2 µm 滤膜 无菌过滤，以防止长期储存期间细菌生长）。
   4. 新鲜配制原生质体分离用酶解液（每 10 ml F-PIN 中加入 0.1 g 纤维素酶和 0.03 g 离析酶）。将溶液在 55 °C 孵育 10 分钟，然后冷却至室温。向 10 ml 溶液中加入 100 µl 10% BSA。
2. 原生质体的分离
   1. 将一片浸润过的叶片放入培养皿中，并加入新鲜酶解液。使用新的剃须刀片将叶片切成约 0.5 cm² 大小的碎片。将叶片碎片连同酶解液转移至真空浸润瓶中，进行约 20 秒的真空浸润，直至叶片中释放出气泡（释放真空时需格外小心）。
   2. 在黑暗条件下以 40 rpm 摇动 90 分钟。
   3. 以 90 rpm 摇动 1 分钟以释放原生质体。将溶液通过 100 µm 纱网过滤至 15 ml 离心管（圆底）中。
   4. 在原生质体溶液上层覆盖 2 ml F-PCN 缓冲液，在室温下以 70 × g 离心 10 分钟（缓慢加速和减速）。
   5. 完整原生质体聚集在酶解液与 F-PCN 缓冲液的界面处。使用宽口 1 ml 移液枪头将完整原生质体转移至新的离心管中，并用 W5 缓冲液补足体积。以 100 × g 离心 2 分钟（缓慢加速和减速），使原生质体沉淀。
   6. 小心使用移液器吸除上清液，并根据原生质体量，用约 200 µl W5 缓冲液重悬沉淀。
   7. 始终使用宽口枪头，以防止完整原生质体破裂。

4. 激光扫描显微镜

1. 样品制备
   1. 在载玻片周围粘贴两条小条状密封剂（相距 2 cm）。将 20 µl 原生质体溶液置于两条密封剂之间，然后小心地将盖玻片覆盖在上方。密封剂条可确保原生质体不会被盖玻片压碎。
   2. 对于整片叶片样品，从叶片上剪下 1 cm 的片段，并将其底面朝上放置于载玻片上。加入约 30 µl H₂O，盖上盖玻片，并用胶带在两侧将其牢固固定。
2. 共聚焦成像与显微镜设置
   1. 使用徕卡（Leica）TCS SP5 型共聚焦激光扫描显微镜进行成像。选用 63X 的物镜（HCX PL APO CS），以甘油作为成像介质进行放大。将数值孔径设为 1.3。使用徕卡应用套件/高级荧光软件（Leica Application Suite/Advanced Fluorescence）进行图像分析（参见补充数据 S1）。
   2. 将氩离子激光器设为 30%，并将 488 nm 激光功率设为 18% 以检测在 515 nm 处重建的 BiFC 信号，并设置一个 PMT 探测器的发射波长范围为 495–550 nm。
   3. 为检测叶绿素自发荧光，设置第二个 PMT 探测器的发射波长范围为 650–705 nm。
   4. 为检测 mCherry 信号，使用 HeNe 561 激光器，将 561 nm 激光强度设为 18%，并设置第三个 PMT 探测器的发射波长范围为 587–610 nm。
   5. 确保所有 PMT 探测器通道的图像均在相同的增益设置下采集（增益应保持在 800–900 之间，以排除背景信号）。
   6. 以 1024 × 1024 像素的图像尺寸、100 Hz 的扫描速度采集图像。
   7. 进行 Z 轴层扫时，每层之间的最大距离设为 0.5 µm。

结果

在本示例中，我们采用双分子荧光互补（BiFC）方法监测细胞质分子伴侣HSP90与膜锚定蛋白AtTPR7和Toc64之间的相互作用。AtTPR7是Sec易位子的组成部分，可与细胞质伴侣蛋白相互作用，可能参与将分泌型前体蛋白递送至内质网膜进行翻译后易位。同样，位于叶绿体外膜的Toc64也通过接收与HSP90结合的叶绿体前体蛋白，参与翻译后蛋白输入过程。这两种蛋白均含有暴露于细胞质的TPR结构域，该结构域可介导与HSP90羧基末端MEEVD基序的相互作用。

通过特异性重组酶将蛋白质克隆至合适的载体中，使含有TPR结构域的衔接蛋白与Venus^N融合，确保荧光标签连接至胞质结构域，从而不影响蛋白质的靶向定位及膜插入。对于HSP90，则将SCFP^C融合至其N端，以避免干扰C端的MEEVD基序（图1和图2）。

将AtTPR7和HSP90与内质网标记物（mCherry）共转化，以验证蛋白复合物的定位。利用激光扫描显微镜检测完整叶片中...

讨论

在设计双分子荧光互补（BiFC）实验时，应考虑若干要点。尽管无需了解目标蛋白的结构信息，但在研究跨膜蛋白时必须明确其拓扑结构。荧光蛋白必须位于相同的亚细胞区室，或朝向膜的同一侧，才能发生相互作用。通常情况下，若目标蛋白需要N端定位信号序列，则只能考虑使用C端标签。由于标签可能干扰目标蛋白的正确靶向或膜插入，因此建议预先检测其亚细胞定位，例如 通过表达GFP标记的蛋白进行验证。此外，应始终设置阴性对照。在本例中，我们构建了一个仅在细胞质中表达SCFP^C的对照载体。然而，任何预期不会发生相互作用的蛋白均可作为阴性对照。为验证载体的正确表达，特别是在无可见荧光的情况下，可对侵染后的叶片或原生质体提取蛋白，进行SDS-PAGE电泳，并使用针对相应标签的抗体检测蛋白表达水平。

荧光信号可在完整叶片或分离的原生质体中进行监测。尽管在整片叶片中检测速度更快，但在原生质体中可更清晰地观察到精细结构的信号。此外，观察整片叶片时主要监测的是表皮细胞，而表皮细胞不含叶绿体。因此，在分析叶绿体蛋白时，建议分离原生质体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3',5'-二甲氧基-4'-羟基苯乙酮	西格玛-奥德里奇	D134406	乙酰丁香酮
纤维素酶，Onozuka-R10	Serva	16419	源自 Trichoderma viridae
离析酶 R-10	Serva	28302	源自 Rhizopus sp.
GATEWAY BP Clonase II 酶试剂盒	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY LR Clonase II 酶试剂盒	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel 和 PCR 纯化试剂盒	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE	Invitrogen		Gateway 克隆
pDEST-VYNE(R)GW	Invitrogen		Gateway 克隆
pDEST-SCYCE(R)GW	Invitrogen		Gateway 克隆