斑马鱼胚胎中氧化应激的分析

摘要

本文报道了一种用于检测活体斑马鱼胚胎氧化应激的实验方案。该方法可实现对整个胚胎组织及单细胞群体中活性氧（ROS）的检测。本方案可同时完成定性与定量分析。

摘要

活性氧（ROS）水平升高可能导致细胞氧化还原状态发生改变，进而引发氧化应激状态。这种情况会引起分子的氧化（如脂质、DNA、蛋白质），并导致细胞死亡。氧化应激还会影响多种病理过程的发展，例如糖尿病、视网膜病变、神经退行性疾病和癌症。因此，开发用于研究氧化应激的工具非常重要，不仅要在单细胞水平上，还应在完整生物体的背景下进行研究。本文中，我们认为斑马鱼胚胎是一个有价值的in vivo系统，可用于开展此类研究，并提供一种在in vivo条件下测量氧化应激的实验方案。利用荧光ROS探针和转基因荧光斑马鱼品系，我们建立了两种不同的in vivo氧化应激检测方法：i）“全胚胎ROS检测法”，用于氧化应激的定性测量；ii）“单细胞 ROS检测法”，用于氧化应激的定量测量。本文中，我们通过氧化剂处理以及生理或遗传学方法诱导组织中氧化应激水平升高，以验证这些方法的有效性。该方案适用于正向遗传筛选，并将有助于阐明在神经系统疾病和癌症等与氧化应激相关病理的动物模型中，ROS的因果关系。

引言

氧化应激特指由于细胞氧化还原状态失衡所导致的一种生理状况。细胞内持续发生的复杂氧化还原反应决定了细胞的氧化还原状态。氧化还原反应包括所有生物分子原子间发生电子转移的化学反应，从而导致分子的还原与氧化即 氧化还原反应）。这些反应由电子活化的物种催化（即 促氧化物质）具有极端的结构不稳定性，其未配对电子可自发活化，并与邻近的生物分子发生电子交换。这些异常反应会导致DNA损伤、蛋白质羧化和脂质氧化，最终引发细胞死亡¹. 氧化应激水平的升高与衰老及多种病理状态的进展相关联²氧化应激已被报道为糖尿病和心血管疾病中血管改变的原因。^3,4它还在阿尔茨海默病和帕金森病的神经元退行性变中发挥关键作用。⁵此外，氧化应激已被证实是调控癌症进展和转移事件的关键因素^6,7此外，炎症和免疫反应可能引发并进一步加剧氧化应激。⁸.

在活细胞中，促氧化性物质来源于氧（ROS，活性氧物种）或氮（RNS，活性氮物种）。ROS 包括羟基自由基（^.OH）、超氧阴离子（O₂^-）和过氧化氢（H₂O₂）。主要的 RNS 是一氧化氮（NO^.

方案

1. 仪器和工作溶液的准备

1. 制备鱼水溶液。通过将 2 g 海盐“Instant Ocean”溶解于 50 ml 蒸馏水中配制储备液。取 1.5 ml 鱼水储备液加入 1 L 蒸馏水中，制备即用型鱼水（终浓度为 60 µg/ml 海盐）。使用前对即用型鱼水进行高压灭菌。该溶液用作斑马鱼胚胎培养基。
2. 制备用于胚胎固定的甲基纤维素。将 1.5 g 甲基纤维素溶解于 50 ml 无菌鱼水中。使用磁力搅拌器促进溶解，粉末完全溶解可能需要数小时。检查溶液澄清度后分装至小管中。可在 -20 °C 保存数月，使用时解冻分装样品。使用前以 950 × g 离心甲基纤维素 5 分钟。避免分装样品反复冻融。
3. 通过将 200 mg 三卡因溶解于 100 ml 水中并用 1 M Tris-HCl（pH 9）调节 pH 至 7.0，配制 50 ml 三卡因/乙基-3-氨基苯甲酸甲磺酸盐（储备液）。该储备液于 4 °C 保存，不得超过 30 天。警告：三卡因具有毒性，请按照适当的处理规范操作。
4. 在斑马鱼胚胎中诱导氧化应激
   1. 制备用于一般性氧化应激诱导的氧化剂溶液：通过将 H₂O₂ 储备液（过氧化氢；100 mM）加入鱼水中，配制 50 ml 氧化剂溶液。H₂O₂ 的终浓度使用范围为 2 mM 至 100 μM。该溶液需在使用前短时间内配制。该氧化剂溶液可用于整体染色 R....

结果

通过应用此处所述的方法，我们可以轻松检测和测量斑马鱼胚胎组织中的氧化应激（以及活性氧水平）。在成年斑马鱼交配后，收集卵子并使其在28 °C条件下发育至受精后72小时（hpf）。为了诱导氧化应激，我们提出两种不同的方法：1）用强促氧化剂处理胚胎；或2）在组织损伤后促进活性氧（ROS）的生成。

在第一种方法中，我们根据具体需求使用了两种不同的试剂：过氧化氢（H₂O₂）作为通用的细胞活性氧（ROS）生成剂，以及鱼藤酮作为特异性的线粒体活性氧诱导剂。鱼藤酮是电子传递链（ETC）复合体I的抑制剂，其功能失调可导致氧化应激⁴¹。

在第二种方法中，我们通过在斑马鱼胚胎的尾鳍处制造伤口来诱导活性氧的积累³⁹. 或者，可通过显微注射吗啉代寡核苷酸敲低斑马鱼组织中的基因表达，以诱导氧化应激条件 Nrf2 抗氧化反应 通路 这是细胞抵御氧化应激细胞毒性的主要防御机制³⁸.<.......

讨论

关键步骤

此处所述的斑马鱼胚胎氧化应激检测程序包含两种不同方法。整体 ROS 检测法主要用于 ROS 的定性分析，而单细胞 ROS 检测法则可实现更特异的定量测量。图1。这两种方法均可快速、简便地评估 体内 斑马鱼胚胎中的活性氧检测。然而，这两种方法均包含一些关键步骤。

与方法一相关的关键步骤

第一种全胚胎ROS检测方法具有显著优势，可轻松检测活体胚胎所有组织中的氧化应激（图2）。然而，有三个关键因素必须加以考虑，因其可能影响检测结果：1）探针对胚胎组织的通透性，2）探针的毒性，以及3）探针对低浓度活性氧的敏感性。

第一个方面特别与该方法的体内应用相关⁴²。活性氧敏感探针的“细胞通透性”是实现本检测的关键特性。理想情况下，所有水溶性化学物质均适合用于活体斑马鱼胚胎的递送；然而，大多数用于氧化应激检测的试.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
过氧化氢溶液	SIGMA	516813	切勿储存稀释液
1× Hank's 平衡盐溶液	GIBCO	14025
甲基纤维素	SIGMA	M0387
Instant Ocean 水族馆海盐混合物	INSTANT OCEAN	SS15-10
三卡因	SIGMA	A5040
通用活性氧敏感探针：CellROX Deep Red 试剂	INVITROGEN	C10422
线粒体特异性活性氧敏感探针：MitoSOX	INVITROGEN	M36008	用 13 μl DMSO 溶解一支试剂瓶
氢溴乙啶	INVITROGEN	D23107
鱼藤酮	SIGMA	R8875	用 DMSO 配制 5 mM 储存液。
二甲基亚砜	SIGMA	D2650
VAS2870；3-苄基-7-(2-苯并噁唑基)硫代-1,2,3-三唑[4,5-d]嘧啶	EnzoLifeScience	BML-EI395	将粉末溶于 DMSO；在鱼水中稀释
碘化丙啶	Molecular probes (Life Technologies)	P3566
7-氨基放线菌素 D (7-AAD)	Molecular probes (Life Technologies)	A1310
Nrf2a Morpholino	GeneTools	5'-CATTTCAATCTCCAT CATGTCTCAG-3'	参考文献：Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413)；Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)
胶原酶 P	ROCHE	11213857001	将粉末以 100 mg/ml 浓度溶于无菌 HBSS 中。分装后于 -20 °C 保存
磷酸盐缓冲液 (PBS)	GIBCO	10010-056
胎牛血清	GIBCO	10082-147
完全蛋白酶抑制剂混合片剂	ROCHE		将一片药片溶于 1 ml 水中
0.5% 胰蛋白酶-EDTA (10x)，无酚红	GIBCO	15400-054	使用前配制 1x 工作液
显微镜	ZEISS
带荧光照明的体视显微镜	Nikon	AZ100
相机	ZEISS	AxioCamMRm
荧光图像采集软件	ZEISS	ZEN 2011
荧光激活细胞分选仪	BD FACSCalibur
离心机	Eppendorf	5417R
FACS 管	BD	342065
多孔板	BD Falcon	353047
90 mm 无菌未处理培养皿	VWR	391-1915
共聚焦显微镜	Leica	Leica SP5