实验方案详细信息如下 体外 使用二次谐波生成纳米颗粒标记人类胚胎干细胞。还介绍了通过多光子显微镜研究hESC及其向心肌细胞簇分化的实验方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
在本可视化实验中，提供了以下实验方案的详细步骤 体外 用人胚胎干细胞（hESC）与二次谐波纳米颗粒（HNPs）进行标记。后者是一类新近引入的探针，用于生物样本的多光子成像标记。HNPs 能够通过二次谐波生成这一非线性光学过程，将激发光的频率加倍，且对激发光波长无特定限制。
本文详细介绍了基于多光子技术的hESC向心肌细胞簇分化的方法（以长期气液培养方式维持）。特别展示了在三维监测跳动心肌组织过程中，如何最大化孤立HNPs的强二次谐波（SH）发射的实验证据。同时还详细阐述了对所得图像进行分析以获取三维位移模式的方法。
引言
得益于其固有的三维层析成像能力，非线性显微系统近年来日益推动了对近红外双光子吸收带内具有光稳定性的荧光探针的需求。直到最近几年，除了基于荧光的标记物（染料、量子点、上转换纳米颗粒）不断发展之外，另一种成像方法开始利用一类新型的本征非线性纳米颗粒作为标记物。 即 谐波纳米颗粒（HNPs），专为多光子显微镜技术开发。这类标记物基于无机非中心对称晶体，可通过产生激发频率的二次谐波（SH）来提供光学对比度：例如，将部分近红外脉冲激发光（λ = 800 nm）转换为可见蓝光（λ/2 = 400 nm）。近年来，多位研究者已测试了多种材料，包括碘酸亚铁 Fe(IO₃)₃ 等。3)3 1，铌酸钾（KNbO3)2，铌酸锂（LiNbO3)3，钛酸钡（BaTiO₃）3)4,5，磷酸钛氧钾（KTiOPO4，KTP）6-8和氧化锌（ZnO）5,9,10与荧光探针相比，HNPs 具有一系列优异的特性，例如完全不存在光漂白和闪烁现象、发射谱带窄、激发波长可调（从紫外到红外）、可获取取向信息以及具有相干光学响应。这些独特性质最近已在两篇全面的综述论文中得到阐述11,12在红外光谱区域工作可减少散射和吸收，从而增加成像深度，同时也显著限制了样品的光降解。13,14此外，由 HNPs 提供的无限光稳定性信号使其成为长期细胞示踪的理想探针，在再生医学应用中具有显著优势15.
在本可视化实验中，提供了以下实验方案的详细步骤 体外 用人胚胎干细胞（hESC）与未功能化的HNP进行标记。胶体悬浮液的合成与制备方法已在先前的出版物及其参考文献中有详细描述。16 且超出本研究的范围。本文介绍了利用多光子显微镜研究人胚胎干细胞（hESC）及其向心肌细胞簇分化（以长期气液培养方式维持）的方法。人胚胎干细胞可在所谓的拟胚体（EBs）中通过两种不同方式诱导其分化， 通过悬浮培养中集落片段形成类胚体（EB），或 alternatively 使用 Aggrewell 培养板将单细胞强制聚集成 EB，如图所示 图1A。 在聚四氟乙烯（PTFE）多孔滤膜上培养搏动的心肌细胞簇，有助于其长期维持，以便进行后续研究（例如动作电位的电生理学测量）。
扫描显微镜的激发光源应能够提供超短脉冲（在样品处脉冲持续时间小于300飞秒），以达到进行HNP二次谐波成像所需的峰值功率。例如，目前成像中最常用的飞秒光源是可调谐的钛宝石激光器。此外，也可使用其他超快激光器，例如掺铒离子17、铬掺杂镁橄榄石18或由钛宝石激光器泵浦的红外光学参量振荡器。显微镜应配备数值孔径较高的物镜。尤为关键的是，在每次测量前以及每次更换物镜后，必须通过优化所选工作波长下激光脉冲预压缩器的设置，来最小化系统（透镜）中存在的色散。该步骤在实验方案中有详细说明，其目的是确保在焦平面处的激光脉冲持续时间尽可能接近变换极限（即最短脉冲），从而最大化样品的非线性响应。
本方案末尾所述图像分析的目标是识别并追踪与搏动心肌细胞簇节律性收缩相关的三维HNP运动。通过在连续的视频帧中确定纳米颗粒的位置，即可实现其在图像平面内的追踪。为了提取轴向运动信息，必须预先校准光强响应随轴向位移变化的非线性关系。需要注意的是，在进行长期测量时，必须采用主动干涉测量法控制样品的轴向位置，以在存在热漂移和/或机械漂移的情况下维持校准曲线的有效性。
本研究中用于追踪聚集体内跳动细胞的HNPs基于铌酸钾氧化物（KNbO3），而其他可用的非线性纳米材料在Staedler et al16的研究中已有详细综述。
迄今为止所研究的大多数纳米材料的非线性光学效率都非常相近。选择KNbO3主要是基于其胶体溶液的良好稳定性以及良好的生物相容性，已在多种人体细胞系中验证，即使在较高浓度和长时间暴露条件下亦表现出良好安全性16。
鉴于本研究中所采用的纳米材料具有新颖性，作者通过一段简短的原创计算机视频动画，展示了HNPs与荧光/发光生物标记物相比的主要特性。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 人类胚胎干细胞的培养与扩增
- 制备细胞传代培养基（称为PM），其成分为：在Knockout DMEM中添加20% Knockout Serum、1% MEM非必需氨基酸、1% 200 mM L-谷氨酰胺、1% 青霉素-链霉素和3.5 µl β-巯基乙醇。
- 将人胚胎干细胞（hESC）在8 ml PM培养基中解冻，115 x g离心5分钟，弃去含DMSO的冻存液。
- 加入1 ml含有10 mM Rock抑制剂的PM培养基，以防止细胞凋亡并提高解冻后的细胞存活率（仅培养24小时）。
- 向PM中添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） 在所需浓度（4–10 ng/ml）下维持多能性。
- 将人胚胎干细胞接种于经辐照的人包皮成纤维 feeder 细胞（γHFF）上（图 1A)，先前以 2 x 10 的浓度接种4 细胞/厘米²2.
- 每日更换培养基，必要时使用细长的尖头吸管通过抽吸去除开始分化的菌落部分 剪断巴斯德吸管
- 每周一次，用酶法传代培养细胞集落：
- 吸除培养基，用 2 ml PBS 洗涤菌落。
- 吸除 PBS，每孔加入 0.5 ml 预热的 1 mg/ml 胶原酶 IV，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 10 分钟2.
- 收集菌落碎片至 2 ml 新的 PM 中 并以115 × g离心 x g 离心 3 分钟。
- 或者，可通过刮取的方式机械传代细胞克隆：
- 吸除培养基，用 2 ml PBS 洗涤菌落。
- 使用 StemPro EZPassage 滚轴刮刀工具手动刮取菌落（图1B).
- 收集菌落碎片，115 × g 离心 3 分钟以去除上清液。
- 将细胞接种于γHFF上或进行胚胎小体（EBs）分化处理。
2. 人类ESC分化方案
- 使用 Knockout DMEM 配制分化培养基（DM），添加 2% Hyclone 血清、1.0% MEM 非必需氨基酸、1.0% 200 mM L-谷氨酰胺、1% 青霉素-链霉素和 3.5 µl β-巯基乙醇。
- 吸去培养基，用 2 ml PBS 洗涤细胞集落。
- 悬浮培养中集落片段形成拟胚体（EB）：
- 吸去 PBS，每孔加入 0.5 ml 预热的 IV 型胶原酶（1 mg/ml），在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 10 分钟。
- 收集集落片段至 2 ml 新鲜 DM 中，以 115 × g 离心 3 分钟。
- 将片段接种于超低吸附 6 孔 板中悬浮培养（每孔 2 ml），培养 4 天（图 1C）。
- 收集新形成的 EBs，并接种于 0.1% 明胶包被的 24 孔板中（约 3 个 EBs/孔）（图 1D）。
- 或者，使用 Aggrewell 板通过强制聚集单细胞形成 EBs：
- 吸去 PBS，用 accutase 将集落消化为单细胞（0.5 ml/孔）。
- 离心后将细胞重悬于 DM 中，调整细胞密度至 1.2 × 106/ml。
- 每 Aggrewell 培养室加入 2 ml 细胞悬液，培养 1 天（图 1B'）。
- 收集新形成的 EBs（图 1C'） ，并接种于 0.1% 明胶包被的 24 孔板中（约 3 个 EBs/孔）。
- 每 2–3 天更换一次 DM ，直至出现搏动的心肌细胞簇（15–30 天）。
3. 搏动细胞簇的气液界面3D培养及HNP标记
- 识别并手动分离跳动的心肌细胞簇（图 1D），通常在培养2-4周后出现，使用细长且尖锐的 剪断巴斯德吸管
- 每孔插入4个PTFE滤膜，置于6孔板中 平板图 1F).
- 在每个孔的上方加入 1 ml DM 培养基。
- 将一个解剖出的跳动细胞簇置于每片PTFE滤膜上（图1E），每孔最多4个 即 每块板24个聚集体 (图 1F').
- 每2-3天更换一次DM培养基。
- 为标记细胞簇，移除含有跳动细胞簇的聚四氟乙烯滤膜，并将其置于3.5 cm玻璃底培养皿（厚度170 µm）中。
- 加入1 ml浓度为50 µg/ml的HNP，孵育30 min。
4. 非线性光学成像
- 样品制备。 在HNP标记后（见步骤 3.6），将完整分化早期hEBs或心脏搏动细胞簇（在出现收缩时解剖分离）转移至PTFE滤膜上，并置于厚度为170 µm、适用于高数值孔径物镜工作距离的玻璃底培养皿中。或者，将搏动细胞簇直接接种于预先涂有0.1%明胶的玻璃底培养皿中。
- 将样品转移至配备孵育腔的一体化显微镜中，确保在长时间内维持稳定的温度、湿度和CO2浓度。
- 初步观察后，在白光照明下通过宽场成像对样品进行图像采集，以识别分化EBs或活跃搏动细胞簇中的目标结构，用于后续分析。
- 若需同时采集来自HNP的NADH和SH的细胞自发荧光信号，应设置较短的激光激发波长（即 720 nm），以匹配分子吸收特性。使用一个中心波长为激发波长一半的窄带通光谱滤光片（即，λ = 360 ± 10 nm）检测SH信号，另用一个滤光片检测自发荧光。
- 首先进行快速、低分辨率的三维扫描，重建心脏细胞簇的整体形态，并在细胞簇体积内选择包含多个可见HNP的成像平面。
- 如有必要，可自由调整激发波长，以最佳匹配样品的光学特性，避免光漂白和光损伤，并利用红外波长（即，790 nm）实现更深的组织成像，同时相应更换二次谐波滤光片（即，395 nm）。通过最大化沉积在样品上的HNP的二次 谐波信号，优化所选工作波长下的激光脉冲预压缩器设置。
- 为实时监测心脏细胞簇的收缩活动，将显微镜光学扫描仪设置为最快模式（如共振扫描模式），以实现二维图像的高速采集。
- 在图像对比度与采集速度之间选择最佳折中参数设置，例如：
- 扫描平均次数：4
- 像素驻留时间：0.1 µsec
- 成像速率：每秒3.75帧（fps）
- 激光功率需根据焦点光斑大小和扫描速度进行调整。对于0.1 µsec的像素驻留时间和Plan APO 20X N.A. 0.75物镜，在物镜入口处测量的50 mW是保持 细胞活力的典型值。
5. 图像分析
- 轴向校准程序。选择沉积在裸基底上的单个HNP。调节焦距（即 通过控制显微镜载物台的轴向位置，以获得二次谐波（SH）强度随金纳米颗粒（HNP）相对于焦平面偏移量变化的校准曲线，从而确定最大化SH强度的纳米颗粒轴向位置。该校准程序针对Plan APO 20X物镜的输出结果 N.A. 0.75 物镜被报道于 图 4C.
- 选择所有视频帧中存在的 HNP，并确定其周期性运动。该过程可轻松实现自动化，例如通过自定义代码在定义的兴趣区域内寻找信号强度最大值的斑点，并在不同帧之间将其连接（文中提供了一个使用 Matlab R2009b 编写的示例代码，该代码利用图像处理工具箱中的 'regionprops' 函数实现）。
- 通过将不同帧中强度调制转换为轴向位移，利用在步骤中建立的校准曲线，评估沿光轴移动且无法连续追踪的HNP的面外位移量化情况 5.1. 请注意，该方法可用于获取轴向运动信息，但无法确定绝对方向（向上或向下）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在通过共聚焦成像评估搏动活性之前，对聚四氟乙烯（PTFE）滤膜的非线性光学响应进行了仔细表征，单独测试以及在高浓度（1 mg/ml）HNPs 存在下进行测试。确保了以下两点：i）裸基底的双光子激发荧光非常微弱，不会干扰相关生物样品的测量；ii）可通过基底以背向检测模式成像轻松获取孤立 HNPs 的二次谐波（SH）信号（图 2）。该步骤旨在为三维位移的定量分析提供参考对照。
在图3中展示了HNP标记的心脏结构和EBs。红色（图3A）、黄色（图3B和3C）以及绿色（图3D）对应于NADH的自发荧光，而强烈的蓝色SH信号点来源于孤立的HNP。值得注意的是，该技术可实现良好的光学对比度，并且相较于其他基于纳米颗粒的方法（如量子点或上转换纳米颗粒），其标记密度相对稀疏。在本研究中，具有高强度的孤立标记有利于追踪多个独立颗粒的运动，并重建干细胞衍生结构的集体运动。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
纳米技术在干细胞研究中的应用是一个相对较新但发展迅速的领域。正如该领域多篇综述文章所指出的，纳米颗粒可用于实现多种研究目标，从细胞示踪（包括体外和体内）到调控干细胞的增殖与分化等。 体外 和 体内），用于蛋白质和基因的细胞内递送，尤其是构建仿生细胞环境，以选择性地促进或抑制特定的分化通路19,20该方案所述方法仅限于光学追踪，尽管使用红外激发可相比基于荧光的技术提高穿透深度，但光学成像无法应用于全身，因此应结合磁性检测进行补充。21. 先前已发表的研究展示了多种评估心肌细胞簇结构与运动的方法，包括使用荧光染料进行标记22，量子点23,24超顺磁性氧化铁纳米颗粒25和上转换荧光颗粒26-28. 与这些纳米探针相比，HNPs的优势在于长时间内不会发生漂白、成像穿透深度增加，以及波长可调以增强相对于自发荧光的对比度。其特有的稀疏细胞标记（即 在 图 3D 通过该方法获得的每100 µm边...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢欧洲第七框架研究项目NAMDIATREAM（NMP4-LA-2010-246479，http://www.namdiatream.eu）和法国—瑞士INTERREG IV NAOMI项目提供的部分资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 显微镜培养箱 | OKO LAB | UNO 套件（顶置式） | 37 °C，5% CO2，加湿环境 |
| 多光子显微镜 | Nikon | AR1-MP | |
| 快速扫描，四个非光电倍增管解扫描探测器 | |||
| SHG 和自发荧光滤光片 | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| 显微镜物镜 | Nikon | ||
| CFI Plan Fluor 10X | NA 0.30，WD 16 mm | ||
| CFI Plan Apo 20X | NA 0.75，WD 1.0 mm，VC | ||
| CFI Apo 40X | NA 1.25，WD 0.18 mm λS，纳米晶体镀层 | ||
| ROCK 抑制剂 | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout 血清 | Invitrogen | 10828 | |
| MEM 非必需氨基酸 | Invitrogen | 1140 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM | Invitrogen | 25030 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140 | |
| β-巯基乙醇 | Sigma | M7522 | |
| 胶原酶 IV | Gibco | 17104-019 | |
| 滚刮工具 | StemPro EZPassage，Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell 系统 | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone 血清 | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| 明胶 | Sigma | G9391 | |
| 6 孔板 | Falcon | 353046 | |
| 24 孔板 | Nunclon | 142475 | |
| 聚四氟乙烯（PTFE）滤膜 | Millipore | NA76/25 | |
| 插入式培养插件 | Millipore | PICM03050 |
参考文献
- Bonacina, L., et al. Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy. Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).
- Nakayama, Y., et al. Tunable nanowire nonlinear optical probe. Nature. 447, 1098-1101 (2007).
- Aufray, M., et al. New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis. J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).
- Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging. Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).
- Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).
- Baumner, R., et al. Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles. Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).
- Le Xuan, L., et al. Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy. Small. 4, 1332-1336 (2008).
- Sandeau, N., et al. Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal. Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).
- Johnson, J. C., et al. Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires. Nano Lett. 2, 279-283 (2002).
- Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine. J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).
- Bonacina, L. Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy. Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology. Bioessays. 34, 351-360 (2012).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. 2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Magouroux, T., et al. High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers. Small. 8, 2752-2756 (2012).
- Staedler, D., et al. Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility. Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).
- Extermann, J., et al. Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy. Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).
- Chen, I. H., et al. Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources. Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).
- Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells. Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).
- Kaur, S., Singhal, B. When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology. J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).
- Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).
- Zimmer, J. P., et al. Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging. J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).
- Vallee, J. P., et al. Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats. Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).
- Idris, N. M., et al. Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles. Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).
- Haase, M., Schafer, H. Upconverting nanoparticles. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 5808-5829 (2011).
- Cheng, L., et al. Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control. Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
