我们描述了一系列方法,用于在小鼠胚胎发育第9.5天(E9.5)及之后阶段,向胚胎内注射染料、DNA载体、病毒和细胞,以监测来源于胚胎或 pluripotent 细胞的内源性细胞及移植细胞的命运和表型。
方法文章
* These authors contributed equally
我们描述了一系列方法,用于在小鼠胚胎发育第9.5天(E9.5)及之后阶段,向胚胎内注射染料、DNA载体、病毒和细胞,以监测来源于胚胎或 pluripotent 细胞的内源性细胞及移植细胞的命运和表型。
测试胚胎干细胞或多能干细胞衍生物的命运 体外 方案已导致有争议的结果,这些结果不一定反映其 体内 潜能。理想情况下,这些细胞应被置于适当的胚胎环境中,以获得其确定的表型。此外,利用染料或逆转录病毒载体标记细胞后在小鼠中进行的细胞谱系示踪研究,大多仅局限于器官发育尚不完善的早期小鼠胚胎。为克服这些局限性,我们设计了标准的以及超声介导的显微注射方案,可在小鼠胚胎发育至E9.5及更晚阶段时,将多种试剂靶向注射至心脏的特定区域。 胚胎外植体或胚胎随后进行培养或继续发育 在子宫内这些试剂包括荧光染料、病毒、shRNA 或干细胞来源的前体细胞。我们的方法能够在监测标记和/或注射细胞的迁移与命运的同时,保持器官的功能。这些技术可拓展至其他器官,将有助于解决发育生物学中的关键生物学问题。
十多年前,人类胚胎干细胞(HuESCs)已从人类囊胚中分离获得1自那时起,这些细胞已成为人类发育生物学中诸多未解问题的重要研究领域。人类胚胎干细胞(HuESCs)也为再生医学带来了希望。近年来,研究人员已从患者特异性的体细胞中成功生成人类诱导多能干细胞(iPSCs),为遗传性疾病的研究提供了新的模型2许多 体外 胚胎干细胞或诱导性多能干细胞向多种细胞谱系(包括心肌谱系)分化的实验方案3,已有报道。通常通过RNA和蛋白质表达分析、免疫染色和/或 体外 功能测试。然而,多能干细胞的衍生物必须被置于适当的胚胎环境中,以检测其是否完全获得与相应胚胎细胞相同的细胞命运,以及是否能够真实重现其胚胎对应细胞的发育过程 体内 功能会响应区域信号。尽管组织工程学前景广阔,但目前尚无法提供所有已知和未知的适当信号 体内 发育中的胚胎组织4,5.
利用染料或逆转录病毒载体对胚胎(包括小鼠胚胎)细胞进行标记,为心脏发育过程中细胞谱系的胚胎起源提供了重要信息6例如,将染料注入小鼠胚胎的心包腔 离体,随后 体外 离体心脏培养,用于标记心外膜细胞及其后代7然而,染料标记和逆转录病毒细胞标记主要应用于器官发育尚不完善的早期小鼠胚胎,或更易于操作的鸡胚胎8. 一个例外是大脑,在胚胎中更容易进行靶向操作9,10这种方法尚未应用于跳动的胚胎小鼠心脏。
为了补充使用染料或病毒进行的直接标记,并在更晚期的小鼠胚胎及成年小鼠中进行谱系示踪,研究人员已将细胞标记方法与利用Cre/Lox技术的转基因小鼠分析相结合。然而,Cre/Lox方法11存在一些局限性,这些局限性源于用于驱动重组酶表达的基因组调控区域在时空特异性方面的限制,以及Cre/Lox重组效率的不确定性12。此外,该方法无法完全回答由细胞迁移驱动的细胞命运获得这一特定问题,因为它只能在启动Cre表达的调控区域被激活后标记前体细胞。同时 ,由于明显的伦理问题,该方法也无法应用于人类胚胎。
鉴于这些局限性,我们设计了一系列新的实验方案,用于在胚胎发育E9.5及之后阶段,将多种细胞标记试剂(如荧光染料、病毒、shRNA等基因表达调控因子、基于DNA的细胞标记载体或细胞本身)注射到小鼠胚胎心脏的特定区域。
DNA/细胞注射采用体视显微镜和一种简单的显微注射装置相结合的方法 离体 胚胎培养至48小时,或分离心脏或胚胎外植体培养48–72小时。我们还报道了一种通过超声介导的显微注射技术在小鼠胚胎心脏中的应用方案 在子宫内 该技术可实现对胚胎发育过程的监测13 并可实现对注射物和/或标记细胞的长期随访。
我们发现,这些方法能够保持器官的功能,并提供比常规方法更具代表性的环境 体外 测试干细胞潜能,同时提供了追踪标记或注射细胞迁移以监测其命运的机会。最终,这将有助于更深入地理解区域组织的模式形成及关键生物学过程。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
1. 准备
动物实验操作
获得动物伦理委员会的批准,并遵循机构关于病毒、人胚胎干细胞(HuESC)和/或诱导多能干细胞(iPSC)(如适用)操作、小鼠操作、获取小鼠胚胎以及实施小鼠手术的指导方针。对于定时交配,发现阴栓当天记为胚胎发育第(E)0.5天,即交配后0.5天。
2. 收集E9.5和E10.5胚胎用于 离体 注射
3. 在体视显微镜下进行 DNA 或细胞注射
4. 胚胎、离体心脏及外植体培养
5. 心脏超声引导注射 我n 子宫内
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
使用上述注射方案,可将细胞标记和/或注射至小鼠胚胎心脏中。作为概念验证,本文展示了多个示例,说明了注射方案及 离体 AVC外植体、离体心脏或全胚胎培养相结合(图1).
图1展示了细胞注射前胚胎的制备过程。将E9.5胚胎从蜕膜中取出,同时保持卵黄囊的完整性(图1A)。在心脏上方切开卵黄囊(图1B)。将移液管靠近(图1C)并注入细胞。心脏保持原有形态(图1D)并持续搏动。
为了研究发育生物学中更具体的生物学问题,例如上皮-间质转化(EMT),将针对调控心内膜细胞向内皮-间质转化所需蛋白的shRNA注射到E9.5期房室管(AVC)外植体中(图2A)。对照胚胎则注射空骨架载体。同样,在E10.5期将由HuES细胞衍生的、在Sox9启动子控制下表达GFP的内皮前瓣膜细...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
上述描述的心内 ex vivo 注射方案旨在维持中期(E9.5–E11.5)小鼠胚胎心肌功能至少48小时。这些注射方法可实现对DNA或细胞的特定空间靶向注射。图1-3 中展示的少数示例验证了该技术可用于阐明发生在特定心脏区域(如心内膜或心外膜细胞的上皮-间质转化,EMT)的发育过程的 ex vivo 和 in vivo 分子机制。尤为重要的是,这些方案提供了一个在合适的胚胎环境中追踪注射细胞(如人胚胎细胞或人胚胎干细胞衍生物)迁移与命运的机会,这是此前尚未解决的挑战。in vivo 标记(如 图3 中的心外膜细胞)可通过染料或病毒的饱和或梯度稀释,实现对细胞(亚)群的短期和长期谱系示踪,而无需依赖Cre/lox技术(尽管联合使用这些技术也可能具有应用价值)。
在应用这些方案时观察到几个关键步骤。首先,胚胎对光极为敏感。因此,建议在体视显微镜下练习注射方案,以便每枚胚胎的操作可在15分钟内高效且高重复性地完成。同样,整个超声介导的注射过程应控制在...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者无任何利益冲突需要披露。
作者感谢Leducq基金会(MITRAL)和法国国家研究局(ANR Specistem资助)对本研究的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>装置/硬件 | |||
| 40 MHz 换能器 | VisualSonics | MS550S | |
| 显微注射仪 | VisualSonics | ||
| 显微注射仪 | Eppendorf | 5242 | |
| 显微操作仪 | Eppendorf | 5171 | |
| 氮 | 需要加压注射器 | ||
| 轨道系统 | VisualSonics | ||
| 旋转器 | 在培养箱内旋转含有胚胎的玻璃管 | ||
| 标准培养箱 | 5% CO2, 37 °C | ||
| 体视显微镜 | 蔡司 | 发现。V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| <强>显微注射 | |||
| 硼硅酸盐毛细管 | 世界精密仪器公司 | KTW-120-6 | 1.2-μm 外径 |
| 移液管拉制仪 | Sutter | Model P87 | |
| 显微注射针 | Origio-Humagen | C060609 | 外径/内径 1.14 毫米/53 毫米,配 50/35 μm OD/ID 尖端 |
| 汉密尔顿注射器 | |||
| 培养皿 | 10厘米直径 | ||
| 矿物油 | Sigma | M8410 | |
| 硅膜 | Visualsonics | 4.3 x 4.3 厘米 | |
| 培乐多 | |||
| 异氟烷 | Vet One | ||
| 脱毛剂 | Nair | ||
| 眼用润滑剂 | Optixcare | 31779 | |
| 导电凝胶(Signa) | Parker | ||
| 缝合 | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| 超声耦合凝胶 | Aquasonic | ||
| 布托啡诺(盐酸布托啡诺) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg 生理盐水 |
| <强>其他 | |||
| 硅弹性体 | 道康宁 | Sylgard 184 | |
| 玻璃培养皿 | Fine Science Tools | 60 mm 直径 | |
| 昆虫针 | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| <强>培养基与培养试剂 | |||
| OptiMEM 培养基 | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 培养基 | Sigma | M7167 | |
| 杜尔贝科’s Eagle 培养基 | Lonza | BE12-640F | 高葡萄糖和50%大鼠血清 |
| M16 培养基 | Sigma | M7292 | |
| 大鼠血清 | 让维埃 | ODI 7158 | |
| 青霉素/链霉素 | Life Technologies | 15140-12 | |
| 氧气 40% | 气液 | 需要为胚胎培养基供氧 | |
| 胎牛血清 | Fisher | RVJ35882 | |
| Matrigel | BD | 356230 | |
| I型胶原蛋白 | BD | 354236 | 用于组织块培养的培养皿包被 |
| 培养皿 | 杜彻/橙色 | 131020 | |
| <强>注射剂 | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25 mg/ml DMSO。-20℃保存 °C. 使用前用生理盐水稀释1:100-200。 |
| 表达PGK-GFP的慢病毒 | ~8E9 转导单位/ml DMEM | ||
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表
申请许可