用于大鼠心力衰竭的细胞治疗：心肌梗死双侧开胸术及细胞与生物基质的心外膜植入

摘要

在啮齿类动物模型中，通过结扎左前降支（LAD）诱导心肌梗死后，传统上需要两次开胸手术来植入生物移植物。为了降低死亡率，并为与细胞相关的固体和明胶状生物材料的固定提供最佳条件，目前已开发出微创手术方法。

摘要

心脏细胞治疗日益受到关注，而与细胞联合使用的生物材料植入已成为优化心肌细胞递送的关键问题。冠状动脉左前降支（LAD）结扎所致的心肌梗死（MI）啮齿类动物模型已被广泛采用。 通过 开胸手术；二次心脏开胸手术 通过 传统上，心包膜治疗的实施需进行胸骨切开术。自左前降支（LAD）结扎模型描述以来，术后死亡率已从35%降至13%，但二次手术仍具有较高风险。为改善术后恢复，减轻疼痛并降低感染风险，现提出微创外科手术方法。 进行了两次开胸手术，第一次用于左前降支结扎，第二次用于心外膜给药治疗。将细胞与固态或凝胶型基质组成的生物移植物施用于梗死区域。 LAD 结扎导致心脏功能丧失，经术后 2 周和 6 周的超声心动图检查证实。对心脏切片进行 Goldner 三色染色证实了透壁瘢痕的形成。第一次和第二次手术的死亡率均低于 10% 术后死亡率 

引言

自20世纪90年代末以来^th 21世纪以来，心血管疾病始终是工业化国家的头号杀手。其中，冠状动脉疾病为主要病因。其急性期导致心肌梗死（MI），随后发生不良性心室重构，逐步进展至慢性阶段并发展为严重心力衰竭。尽管近年来在技术和治疗方面取得了显著进展，但因心力衰竭持续进展所致的发病率和死亡率仍在上升¹在此背景下，细胞治疗作为一种新的治疗选择，日益受到关注，旨在阻止疾病向心力衰竭进展，并促进心肌最近被发现的再生能力。实验和临床研究已提供了有力证据，表明多种细胞类型经心脏移植后可产生有益效果。主要结果包括心肌收缩功能改善、左心室重构减轻、梗死面积缩小以及梗死区域血管密度增加。然而，细胞注射后细胞留存数量较低仍是主要缺陷。将细胞与生物基质联合使用以提高细胞递送效率² 最近激发了研究人员和临床医生的兴趣。

结扎左前降支冠状动脉（LAD）是小动物模型中诱导心肌梗死（MI）的参考方法，可导致透壁性梗死并形成成熟瘢痕。在MI慢性期实施细胞治疗需要进行第二次手术干预。通常采用胸骨正中切开术，以便将细胞直接注射至心肌内或在心外膜植入生物移植物。此类侵入性外科操作会增加死亡率、术后恢复时间、疼痛程度以及感染风险。本文介绍的微创方法不仅可避免上述偏倚，还能为心脏治疗提供最佳可及性。该技术可在心脏跳动状态下完成心肌梗死造模及细胞与凝胶型生物基质复合物的心外膜植入。 通过 左肋间开胸术

方案

注意：Lewis 雄性和雌性大鼠，体重 200–220 g，在标准实验室条件下饲养（12 小时光照/12 小时黑暗循环， 随意 水和食物，IVC笼具）。所有动物的处理均遵循FELASA建议及瑞士动物保护法的要求。

1. 细胞制备：从骨髓中分离间充质干细胞

1. 用 5% 异氟烷和 O₂ 麻醉大鼠₂ 5 L/min 的流速在诱导室中麻醉 5 分钟。将动物的鼻部放入连接麻醉系统的鼻罩中。通过脚趾或尾部夹捏反应确认麻醉效果。
2. 用剪刀从踝关节到髋关节处剪开并去除腿部皮肤。去除肌肉组织，切断股动脉以使动物放血。暴露髋关节并脱位股骨头，注意不要损伤股骨头。将骨骼置于含无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的50 ml塑料管中。
3. 去除骨骼上的所有肌肉和韧带，注意不要破坏骨骼。注意：必须保持骨骼完整，以避免灌注液渗漏或被乙醇污染。将剥离干净的骨骼置于70%乙醇中冲洗5分钟。
4. 在无菌超净工作台内，用剪刀剪去骨骼的两端。从骨骼末端注入无菌 PBS 冲洗骨髓。将骨髓收集至 15 ml 离心管中。300 × g 离心 7 分钟。
5. 弃去上清液。将沉淀重悬于3 ml红细胞裂解缓冲液中，室温孵育1分钟，然后以300 × g离心7分钟。在150 ml培养瓶中加入无菌细胞培养基（395 ml IMDM培养基、5 ml青霉素/链霉素、100 ml FBS），接种细胞。
6. 第二天更换培养基以去除非贴壁细胞。
   1. 每两天更换一次培养基，持续2-3周，直至获得所需细胞数量。
   2. 或者，根据需要并按照其他文献所述方法，将细胞接种到固体基质上以制备生物移植物³.
7. 心脏植入当天，在心外膜应用前立即准备细胞或收获生物移植物。
   1. 使用Accutase细胞消化液收集细胞。计数细胞。取适量细胞悬液，加入1.5 ml离心管中以获得所需数量的细胞。在300 × g条件下离心7分钟，弃去上清液。
   2. 或者，从细胞培养基中收获生物移植物，用无菌 PBS 洗涤，并置于不含血清的新鲜培养基中保存。

2. 首次开胸术与左前降支结扎

1. 称重大鼠。将加热垫调至37 °C。在诱导室中使用5%异氟烷和5 L/min的100% O₂对大鼠进行麻醉，持续5-7分钟。通过脚趾或尾部夹捏测试确认麻醉状态。将大鼠置于加热垫上。
2. 使用14 G静脉导管对动物进行气管插管。将插管导管连接至啮齿类动物呼吸机，设定参数为：氧气流量2.5 L/min，异氟烷浓度2.5%，潮气量2 ml，呼吸频率90次/分钟。
3. 配制剂量为0.1 mg/kg的丁丙诺啡溶液。皮下注射该溶液的三分之一。剃除左侧胸部的毛发，并用1%聚维酮碘溶液消毒。
4. 在第四肋间空间，垂直于胸骨切开皮肤。分离三层胸壁肌肉（胸大肌、上行胸肌和腹外斜肌）。打开第四肋间空间（第4与第5肋骨之间）。
5. 使用小型牵开器撑开肋骨以暴露心脏。小心打开心包膜。定位左前降支冠状动脉（LAD），并在距心房下方4 mm处用7.0缝线结扎。
6. 使用3.0缝线以两针缝合关闭肋间空间。将两针分别置于胸骨的近端和远端。首先收紧远端缝线。夹闭呼吸机排气管2秒，以使胸腔充气并避免发生气胸。随后收紧第二根缝线。将肌肉层复位（无需缝合）。使用5.0缝线缝合皮肤。
7. 用1%聚维酮碘溶液对缝合部位进行消毒。皮下注射剩余的丁丙诺啡溶液。关闭麻醉系统，拔除气管插管。
8. 将大鼠置于笼内，在保温灯下保持1-2小时。在笼内放置温度计，并调节保温灯与笼子之间的距离，以防过热。之后将大鼠送回IVC系统。术后每6-12小时皮下注射丁丙诺啡0.05-0.1 mg/kg，持续48小时。

3. 通过第二次开胸手术经心外膜给予治疗 via

1. 重复步骤 2.1–2.3。
2. 在第五肋间间隙处，垂直于胸骨切开皮肤。分离三层胸壁肌肉（胸大肌、上胸部肌和腹外斜肌）。打开第五肋间间隙（第5与第6肋骨之间）。
3. 使用小型牵开器撑开肋骨以暴露心脏。若存在粘连，用精细镊子小心去除。
4. 定位结扎线下方呈现苍白区域的心肌梗死区。注意：必要时，可在心尖处插入一段10 cm长的缝线（7.0），轻轻牵拉由止血钳松散固定的缝线，以更好地显露左心室。
5. 应用以下任一种处理方式：
   1. 将生物移植物置于心脏表面。使用已在室温预热10分钟的预充式纤维蛋白封闭剂注射器，通过25 G鲁尔针头在生物移植物下方滴加一滴（50–100 μl）纤维蛋白封闭剂。确认生物移植物已完全密封。
   2. 或者，用移液器吸头将收集的细胞沉淀直接施加于心脏表面结扎线下方的苍白区域，并在细胞沉淀上滴加一滴（50–100 μl）纤维蛋白封闭剂。
6. 从心尖处移除缝线段。
7. 重复步骤 2.6–2.8。

结果

所有动物在开胸术后1小时内均恢复。伤口愈合迅速，未观察到感染或水肿现象。

双侧左胸切开术可为心脏提供最佳入路（图1）。疼痛和术后死亡率均较低。动物术后恢复迅速，并逐渐增重（图2。首次开胸术的Kaplan-Meier生存率为96%。在104只大鼠中，有4只在治疗实施后24小时内死亡 通过 第二次开胸术。动物接受第二次开胸术但未接受治疗（假手术）时，Kaplan-Meier生存率分别为100%，使用MSC与纤维蛋白胶组为96%，而直接将MSC注射至心肌内的动物生存率为86%图3).

在LAD结扎术后2周进行M型超声心动图评估，显示左心室缩短分数（FS）从44 ±3%下降至22 ±4%。在104只动物中，LAD结扎术后2周记录的FS频率分布结果证明了该方法的可重复性（图4），其变异系数（CV）为17%。此外，在LAD结扎术后2周和6周进行的超声心动图检查显示，射血分数（EF）降低，...

讨论

永久性结扎左前降支（LAD）会导致不可逆的心肌损伤。首个动物模型于1960年被报道⁴。自那时起，该模型一直被视为慢性心肌梗死（MI）的标准且合适的模型。其稳定性和可重复性使得能够对心肌梗死的治疗方法进行实验性评估⁵。在初始描述之后改进的操作方法报道的手术死亡率降至35-13%⁶。

正如预期，LAD结扎在2周内即引起心功能受损。在长达6周的观察期内，心功能进一步下降，并伴有透壁性纤维化瘢痕。此外，结扎术后6周可明显观察到包括左心室扩张在内的左心室重构。

首次与第二次手术之间选择了2周的间隔。在此条件下，由于粘连较少，便于进行第二次开胸手术；而术后1周时粘连过于明显，难以在理想条件下实施二次手术。此外，2周的时间窗口有利于治疗的实施，既可避开缺血所诱发炎症反应的早期高峰，又能在致密纤维化组织形成及心室扩张进展之前进行干预治疗。

尽管 目前，侧开胸术是小型动物LAD结扎的标准手术方法，而细胞治疗应用通常...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Polysorb 3-0 缝合线	Covidien	UL 204
Polysorb 5-0 缝合线	Covidien	UL 202
Surgipro II 7-0 缝合线	Covidien	VP904X
Catheter Insyte 14 G 导管	BD	381267
Inspira Advanced Volume Controlled Ventilator 呼吸机	Harvard Apparatus	557058
Dumont #7 镊子	FST Germany	11274-20
纤维蛋白封闭剂	Baxter	1501441	TISSEEL 胶，冷冻保存于 -20 °C
Castroviejo 眼科开睑器	Harvard Apparatus	72-8925	用作肋骨牵开器
IMDM GlutaMAX 培养基	Gibco	31980
青霉素/链霉素	Gibco	15140
FBS	PAA Clone	A15-101
骨剪	Fine Science Tools	16044-10
红细胞裂解液	Gentra Systems	D-50k1
Accutase 细胞解离液	Stem Cell Technology	7920