BEST：条形码标记的四分体测序

摘要

条形码标记的四分体测序技术（BEST）取代了分离、裂解和排列四分体的手动操作流程。BEST 通过荧光激活细胞分选将四分体分离至琼脂平板上，利用玻璃珠振荡分离孢子，并通过分子条形码确定哪些随机排列的菌落来源于同一个原始四分体。

摘要

四分体分析是酵母遗传学中的重要工具，但其繁琐的手工操作过程限制了该方法的大规模应用。条形码标记的四分体测序技术（Barcode Enabled Sequencing of Tetrads, BEST）¹ 取代了分离、破壁和排列四分体的手工操作流程。BEST 利用一种孢子形成特异性的 GFP 融合蛋白来分离四分体，该蛋白使得四分体可通过荧光激活细胞分选直接接种至琼脂平板上，在平板上通过酶消化子囊，并利用玻璃珠涂布使孢子破裂并随机排列。随后，单倍体菌落被确定其姐妹孢子关系。 即 通过基因分型过程中读取的分子条形码，获取来自同一四分体的孢子信息。通过消除人工解剖的瓶颈，可在数分钟内分离出数百甚至数千个四分体。本文详细描述了在酵母中进行BEST实验所需的操作步骤 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）从杂合二倍体菌株开始，通过分离单倍体减数分裂后代的菌落进行。

引言

减数分裂基因作图，通常称为四分体分析，是酵母遗传学的核心技术。简而言之，两个单倍体菌株（每个菌株含有每条染色体的一个拷贝）杂交形成一个杂合二倍体菌株，该菌株含有每条染色体的两个拷贝，分别来自两个亲本。通过缺乏氮源使二倍体细胞饥饿，可诱导其进行减数分裂（产孢），在此过程中染色体复制、发生重组，并最终分裂为四个带有来自双亲等位基因新组合的单倍体细胞（孢子或分离子）。一次减数分裂产生的四个孢子可通过一种称为四分体分离的手动方法进行分离和获取。

传统的四分体分离技术^2,3自1937年首次发表以来变化不大⁴，其目的主要包括三个。首先，必须将经历减数分裂后形成的四分体细胞从大量体细胞背景中分离出来。在传统分析中，研究人员通过显微镜在琼脂平板上肉眼识别四分体，并使用显微操作仪将四分体转移至平板上无细胞的区域。其次，必须将四分体中的四个孢子进行物理分离，以防止孢子间的交配。四分体中的孢子由子囊（即原始二倍体细胞细胞壁的残留结构）以及一系列孢子间桥接结构共同连接在一起⁵。在传统的四分体分析中，子囊通过酶解法去除，研究人员再使用显微操作仪打断孢子间桥接结构并将孢子逐一分开。最后，将各个孢子以网格状排列，以保持它们之间的来源关系，i.e. 每排四个子代均来自同一个原始四分体的姐妹孢子。一位经验丰富的酵母研究人员通常可在约15分钟内完成10个四分体（一般认为每个杂交实验至少需分析此数量）的分离操作。

我们开发了一种新的高通量四分体基因分型方法，称之为Barcode Enabled Sequencing of Tetrads（BEST，条形码辅助的四分体测序）¹。BEST在现有高通量遗传学方法的基础上进行了拓展，能够生成并进行基因分型大量子代，这些子代以单个细胞形式被分离、基因分型和保存，从而可重建全部四个减数分裂产物之间的姐妹孢子关系。该方法通过三种主要策略实现（图1）。第一种策略是引入一种报告基因构建体，该构建体可使经历减数分裂的细胞表达GFP标记，并可通过荧光激活细胞分选（FACS）进行分离。第二种策略是引入一个高度复杂的DNA条形码（一段包含15个随机核苷酸的序列），该条形码以可传递至四分体中全部四个孢子的形式存在，通过重组子代的DNA测序读取该条形码，从而识别来自同一四分体的姐妹孢子。第三种策略是基因分型步骤，BEST可兼容多种基因分型平台，这些平台可同时捕获一组基因组标记以及四分体特异性的条形码。我们采用了一种限制性位点相关DNA标签测序（RAD-seq）⁶方法，该方法将基因组测序定向至特定的限制性酶切位点¹，从而稳定地捕获子代菌株基因组中2–3%的区域以及质粒携带的条形码。通过恢复四分体之间的关系，并结合杂交实验获得的实测基因分型数据，可准确推断缺失的信息，包括测序覆盖度较低的标记状态以及无法存活（因而无法分离）个体的完整基因型。本文中，我们描述了该方法在最常用的减数分裂作图微生物——酵母S. cerevisiae中的应用。例如，通过替换为物种特异性的试剂（如将不同的孢子形成特异性蛋白与GFP融合），该方法可轻松转移至其他微生物，包括那些减数分裂作图目前极为耗时或尚不可行的生物体系。

图1. BEST 方法。 (A) pCL2_BC 质粒是一种含有孢子发生特异性 GFP 融合蛋白、G418 抗性以及15碱基随机条形码的2微米质粒。该质粒文库的构建方法详见 Ludlow et al¹。(B) 将带有条形码的质粒混合物转化至杂交所得的二倍体菌株中。(C) 转化子在选择性培养基上生长，收集约10,000个转化菌落并进行孢子形成。在减数分裂过程中，每个四分孢子中的单个孢子均会继承一份带条形码的质粒拷贝。(D) 通过流式细胞分选（FACS）将四分孢子从未孢子化的细胞中分离，并收集到琼脂平板上，随后对其进行酶解和破壁处理，使各个孢子能够独立形成菌落。(E) 随后将菌落挑取至96孔板中，进行表型分析和基因分型。在基因分型过程中，读取质粒上的条形码序列，用于识别每个四分孢子中的四个成员。本图改编自 Ludlow et al¹。 请点击此处查看该图的高清版本。

方案

1. 菌株构建与表征

1. 通过单倍体菌株杂交并筛选二倍体，构建杂合二倍体菌株用于杂交实验² 或使用天然杂合品系。所用品系不应携带GFP。
2. 确认该菌株无法在YPD培养基上生长² + 200 µg/ml G418
3. 确认该菌株能够产孢。BEST 方法适用于产孢效率较低的杂交实验，但产孢频率较低会增加流式细胞分选（FACS）所需的时间。
   1. 在5 ml YPD培养基中接种菌株，过夜培养，并在摇床中振荡培养 30 °C.
   2. 用 PBS（pH 7.4）将 0.5 ml 过夜培养物洗涤三次。
   3. 离心收集洗涤后的细胞，弃上清液，重悬于2 ml孢子形成培养基中⁷.
   4. 在室温下振荡细胞，并使用配备40X物镜的相差光学显微镜每天观察四分体形成情况。
4. 通过常规解剖法估算杂交孢子的生活力^2,3 约20个四分体。不同菌株背景之间杂交的孢子活力差异很大且难以预测。然而 先验的 孢子活力的预期可用于在耗费人力和成本较高的菌株保存与基因分型步骤之前，评估BEST实验的效率。因此，强烈推荐进行此步骤。

2. 用条形码质粒文库转化二倍体细胞

1. 使用 Gietz 和 Woods 描述的转化方案，将 pCL2_BC 条形码质粒插入杂合二倍体菌株中⁸ 并作如下修改。
   1. 细胞与转化混合物共孵育后 30 °C 孵育20分钟后，向转化混合物中加入DMSO至终体积浓度为8%。研究发现，在某些菌株背景下，添加DMSO可提高转化效率。⁹.
   2. 热激步骤后，短暂离心收集细胞，弃去转化混合物，并用YPD培养基轻轻洗涤细胞。随后，将细胞重悬于1 mL YPD培养基中，在室温下静置恢复3小时。
2. 通过将转化子涂布于YPD + G418培养基上进行筛选200 µg/ml) 琼脂平板。为确保获得复杂的质粒条形码文库，需收集大量菌落， 例如 5 个平板，每个平板约有 2,500 个菌落。
3. 当菌落可见时（在 30 °C），用液体YPD + G418小心地将转化子从平板上刮下并收集于同一管中（200 µg/ml) + 15% 甘油。涡旋混匀该细胞悬液，转移至冻存管中，于 -80 °C 冻存80° C为每个平板制备单独的冻存菌种。这些冻存菌种将作为第3.1步的起始菌株，也可根据需要在日后用于产生更多的四分体。

3. 孢子化转化细胞文库以获得条形码四分体

1. 通过在 30 °C 下以 200 µg/ml G418 的 YPD 培养基中振荡培养 5 ml 过夜（O/N），复苏 2.3 步骤中制备的冻存菌株。
2. 用 PBS（pH 7.4）将过夜培养物中的细胞洗涤 3 次，然后重悬于含 200 µg/ml G418 的孢子形成培养基⁷中。
3. 在室温（RT）下振荡培养孢子形成体系，并每日监测孢子形成进程，直至不再有新的四分体产生。
4. 当培养物中出现形态完整的四分体且二分体数量较少时，停止振荡培养，于室温下静置至少 7 天。尽管某些杂交可在四分体形成后立即进行平板消化与破壁处理（按 7.3 步骤所述评估），但其他杂交则必须经过额外孵育（本实验中为 7–10 天）。因此，强烈建议执行此步骤。

4. 建立用于四分体分选的FACS门控

在pCL2_BC质粒上表达的减数分裂期SPS2-GFP融合蛋白，可通过荧光检测并从孢子形成培养物中分离四分体。以下方案适用于FACSAria II流式细胞分选仪。

图2. FACS门控策略。 采用一系列四个连续门控步骤以分离四分体。图（A）和（B）中的门用于减少团块数量。图（C）中的门用于选择荧光事件。图（D）中的直方图具有两个峰：左侧峰中的事件主要为四分体（左插图），右侧峰中的事件通常为带有出芽结构的四分体（右插图）。对该直方图应用最终门控，以选择主要为四分体的事件（红色条形区域）。本图改编自Ludlow, et al¹。

1. 将孢子化的培养物上样至流式细胞分选仪，并设置两个前向散射和侧向散射门，以排除碎片、成团细胞以及每个液滴中包含多个细胞的情况（图 2A 和 图 2B）。
2. 应观察到一群荧光细胞，当使用 SPS2-GFP 报告基因构建体时，这些细胞包括二分体和四分体¹⁰。设置 GFP 与 FSC 的散点图门控，以包含这些荧光事件（图 2C）。
3. 根据菌株背景的不同，可能需要增加一个额外的门控以去除包含四分体和其他细胞的聚集体。如果需要，检查荧光事件的 FSC 直方图，并设定一个包含较低 FSC 事件的门控（图 2D，门控事件以红色显示）。
4. 通过将约 1,500 个四分体分选到显微镜载玻片上，并在 400X 放大倍数下使用相差显微镜计数四分体与非四分体的比例，来评估门控策略的效率。仅计数约 200 个已分选事件即可准确估算四分体百分比，但分选约 1,500 个可减少在载玻片上寻找细胞所花费的时间。或者，可在步骤 4.5 中评估四分体与非四分体的比例。
5. 定期通过将 25 个四分体分选到显微镜载玻片上，并在 400X 放大倍数下使用相差显微镜检查液滴中的细胞，以验证分选仪报告事件数量的准确性。液滴中应恰好含有 25 个四分体。重复 3–4 次以评估流式细胞仪的变异程度。

5. 将四分体分选到琼脂平板上

图 3. 将琼脂平板放置于FACS分选仪上的示意图。 为了将四分体分选到置于标准（圆形）琼脂平板中央的一小滴zymolyase溶液中，首先将一个标准（100 mm矩形）96孔板放置在细胞分选仪的载物台上，并将分选仪设置为将四分体沉积至特定孔中（本例中为D5孔）。随后，将圆形琼脂平板放置在96孔板上方，并进行对齐，使zymolyase溶液液滴正好位于指定孔的正上方。

1. 将所需数量的 YPD + G418 培养基预热200 µg/ml）板至少 1.5 小时，在一个 37 °C 位于FACS分选仪附近的培养箱
2. 分选方案的一个关键特征是能够将经FACS分选的四分体准确地靶向至含有溶壁酶溶液的琼脂平板上的特定位置。为此，将一个作为“标记”的96孔板放置在分选仪的自动细胞沉积单元（ACDU）上。设计一种分选布局，将25个四分体分选至96孔板格式中的一个孔内。选择位于板中央附近的孔， 例如 D5 孔 图3 显示一个已放入细胞分选仪的培养皿和96孔板。每块板分选25个四分体可获得分离良好的菌落。
3. 从堆叠的10个琼脂平板中取出 37 °C 孵育器到分选仪
4. 取一个琼脂平板，用移液器吸取 25 μl 将 1 mg/ml 的zymolyase溶液（溶于0.7 M山梨醇）滴加到平板中心附近的琼脂表面。然后，将该平板放置于标记用的96孔板上，使zymolyase液滴对准第5.2步中的目标孔。 例如 D5 孔
5. 开始分选，并将25个四分孢子沉积到琼脂平板上zymolyase液滴的中央。然后，移走并盖上平板。
6. 重复步骤 5.4 和 5.5，直至每块平板上的酵解酶液滴中均已分选入 25 个四分体。
7. 将含有四分体的培养皿堆叠物放回 37 °C 培养箱
8. 重复步骤 5.3 至 5.7，直至所有培养皿中均出现四分体。

6. 分离孢子

1. 将每叠含有四分孢子的琼脂平板在 37 °C 下孵育 1.5 小时。
2. 从培养箱中取出平板，每板加入 15–25 颗无菌的 3 mm 玻璃珠，将平板叠放（或分为两叠，每叠 5 块）一起振荡 3–5 分钟。最佳的孢子分离效果是通过将平板 rigidly 从一侧移至另一侧或从前向后实现。切勿以使玻璃珠在平板外缘“旋转”的方式移动平板。操作完成后，将玻璃珠留在平板上。
3. 将带有玻璃珠的平板叠放，珠面朝上，置于 30 °C 培养箱中。从 37 °C 培养箱中取出下一叠平板，重复步骤 6.2。
4. 在 30 °C 下过夜孵育平板。

7. 收集菌落

1. 在 30 °C 条件下过夜培养后，平板上应已形成微小菌落。从培养箱中取出平板时需小心，避免扰动玻璃珠。
2. 将平板小心快速地倒置在足够深的容器上方，以去除玻璃珠。容器应足够深，以防止玻璃珠弹起并接触琼脂表面。倒置时轻敲平板底部，有助于松动粘附在平板上的玻璃珠。这些玻璃珠可通过肥皂彻底清洗、去离子水充分冲洗，并经高压灭菌后重复使用。
3. 计数每个平板上的菌落数量，并利用菌落数估算孢子分离与回收的效率。例如，对于活力接近 100% 的杂交样本，每平板 25 个四分体可能产生每平板总计约 100 个菌落。
4. 从菌落数量足够多的平板（高活力杂交样本中菌落数 >65）中，将每个菌落的细胞转移至含有 YPD 液体培养基 + G418 的 96 孔板的独立孔中。同时记录哪些孔中的菌落来自同一琼脂平板；该信息将用于辅助四分体分配软件的分析。
5. 利用 96 孔液体培养板接种用于基因分型的培养物，并用于制备冷冻甘油菌种保存株。关于 RAD-tag 测序及序列分析的详细信息可参见 Ludlow et al¹。

结果

BEST 方法可显著提高从四分体中分离孢子的速度。以该方法可实现的通量为例，一名研究人员在 3 小时内完成了 149 个琼脂平板的 FACS 分选和孢子分离（步骤 5.1 至 6.3）¹。获得相当数量的产物（约 3,725 个四分体）将需要超过 90 小时的手工解剖操作。然而，与许多高通量方法类似，该方法的当前版本在效率上相较于手工解剖存在一定损失。这种损失表现为回收菌落数量减少，低于根据手工解剖（步骤 1.4）测定的杂交孢子活力所计算出的预期值。假设孢子损失的原因（讨论部分）是随机影响孢子的，则可估算出回收的菌落中，分别有 1、2、3 或 4 个孢子被回收的四分体所占的比例（图 4）。

图4. 四分体水平上方法效率的模拟。 孢子（以菌落形式）回收失败可能由以下原因导致：孢子无活力、孢子黏附于玻璃珠、孢子之间未能有效分离等。本研究采用二项分布，根据成功回收的孢子占总孢子的比例，计算出产生4、3、2或1个菌落的四分体（至少有一个孢子成功回收）的预期比例。该图可作为最终能够组装成三孢子或四孢子四分体的菌株数量的粗略参考。随着每块平板上菌落数量的增加，完整四分体的回收数量也随之增加。

在上述实验中，将一次杂交产生的25个四分孢子（根据手动解剖确定其孢子活力接近100%¹）接种于149块琼脂平板上。本实验中，每块平板上观察到的菌落数量最多为80个，表明有20个孢子未能形成独立的菌落。每块平板上的平均菌落数为62个。选取包含65个或更多菌落的61块平板上的菌落进行收集并测序。在通过测序质量控制的3,700个菌株中，72%可通过计算归入3-或4-孢子四分体。

讨论

遗传学研究的许多领域，从复杂性状定位¹¹到DNA重组机制的研究¹²，都需要产生极大量的后代并进行高通量的DNA测序。将传统方法的优势与高通量DNA测序能力相结合的技术，有望实现以往难以开展的研究。尽管已有若干高通量酵母遗传学方法被成功应用于特定问题，但每种方法均存在局限性，尚无法达到传统四分体分析所具有的广泛适用性。BEST通过采用高通量方法，结合四分体分离与酵母杂交后代的基因分型，解决了这些挑战。结合多重RAD标签测序技术，BEST以低成本的方式获取每个后代菌株的基因型信息，同时利用独特的四分体条形码保留四分体之间的亲缘关系。  在目前所有已使用的高通量方法中，BEST最接近于手动分离酵母杂交实验所提供的信息。

BEST 具有两个关键特征。第一个特征是利用 FACS 快速将四分体从培养物中未发生孢子形成的细胞中分离出来（实验方案步骤 5-6）。能够分离出数千个荧光事件（四分体）是 BEST 在通量上获得最大提升的关键。这种自动化操作对于孢子形成效率较低的杂交实验具有更大的优势，因为手动解剖需要更多时间来肉眼识别稀有事件。第二个关键特征是使用一种高度复杂的分子条形码（实验方案步骤 2），该条形码会传递给每个四分体中的四个姐妹孢子。由于这些条形码可用于通过计算重建那些随机分布在琼脂平板上的孢子之间的四分体关系，因此无需手动将细胞排列成有序的网格阵列。最后，由于分子条形码与孢子形成特异的 GFP 报告基因在物理上连锁（位于同一质粒上），FACS 分选仅会选择保留了分子条形码的四分体。

影响培养物在孢子形成培养基中孵育时间长短的因素有两个。首先，由于孢子形成特异性报告基因（SPS2-GFP）在减数分裂早期即开始表达，仅依靠GFP信号无法区分已完成减数分裂的四孢子四分体与尚未完成减数分裂的细胞（即 二分体）。虽然可通过额外的流式细胞术门控策略减少荧光标记的不完整四分体数量，但最简便的方法是直接观察孢子形成培养物（步骤3.3），并在新的四分体停止形成后立即进行后续操作。在我们的实验中，被分选的二分体频率低于1%。其次，对于某些杂交组合，在室温下静置（步骤3.4）延长在孢子形成培养基中的孵育时间，可显著提高涂布时玻璃珠对四分体的分离效果（方案步骤6）。事实上，该步骤对于某些杂交组合的孢子分离是必不可少的。

与所有高通量方法一样，BEST 比相应的传统方法“噪声”更高。与传统的四分体解剖相比，BEST 效率的适度降低可能由多种因素共同导致。其一，原本具有活力的孢子在实验过程中可能发生更多丢失，这可能是由于在涂布过程中孢子黏附于玻璃珠，或因操作过程中的机械应力导致孢子死亡增加所致。其二，减数分裂过程中可能发生质粒的简单丢失。 其三，由于基因型混合的菌落导致可用于分析的菌落数量实际减少，在我们前期的杂交实验中，此类菌落约占菌落总数的 ~5%¹。这些菌落很可能源于姐妹孢子未能成功分离。由于快速荧光分选和孢子分离技术能够收集到数量巨大的四分体，因此 BEST 完全有能力克服此类规模的效率下降问题。尽管未来版本的 BEST 可能会进一步提高效率，使其接近手工解剖的水平，但更有可能的是，当前 DNA 测序能力的指数级增长将迅速弥补这一程度的可用菌株损失。无论如何，BEST 所能实现的大规模四分体分析能力，将使得目前通过手工方法无法开展的研究成为可能。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FACSAria II（特殊订购型号）	BD Biosciences		其他细胞分选仪也可用于本实验。关键因素包括：（1）具备适用于所用荧光报告分子的激光/检测系统（本实验中为488 nm激光激发EGFP），（2）能够分选单个事件，（3）能够将细胞分选至显微镜载玻片以评估分选质量，以及（4）能够将细胞分选至培养皿
自动细胞沉积装置（适用于FACSAria II）	BD Biosciences	643155（若单独购买，不与FACSAria仪器一同采购）
Zymolyase 100T	Seikagaku Biobusiness
G418	A.G. Scientific		http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html