本文介绍了我们已建立的利用仙台病毒将人类体细胞重编程为无外源基因的人类诱导多能干细胞的方法，该方法具有稳定的结果和更高的效率。
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摘要
摘要
几年前，人类诱导性多能干细胞（iPSCs）的建立为生物医学领域开启了新时代。人类iPSCs的潜在应用包括模拟人类遗传性疾病的发病机制、基因校正后的自体细胞治疗，以及通过提供患者特异性且与症状相关的细胞来源实现个体化药物筛选。然而，该领域仍需克服若干障碍，例如在人类iPSCs生成后清除残留的重编程因子转基因表达。更重要的是，未分化的人类iPSCs中残留的转基因表达可能干扰正常的分化过程，并误导对疾病相关表型的解读 体外 表型。因此，人们已采用多种方法开发出无整合和/或无外源基因的人类诱导多能干细胞（iPSCs），这些方法包括腺病毒、piggyBac系统、微环载体、附加体型载体、直接蛋白质递送以及合成mRNA。然而，在大多数情况下，使用无整合方法进行重编程的效率相当低。
本文介绍了一种利用基于仙台病毒（RNA病毒）的重编程系统分离人类诱导多能干细胞（iPSCs）的方法。该重编程方法具有结果稳定、效率高且成本效益好的特点。
引言
人类胚胎干细胞（hESCs）具有自我更新的能力 体外 具有多能性，有望用于疾病建模、药物筛选，以及开发基于细胞的疗法以治疗疾病和组织损伤。然而，由于存在免疫学、肿瘤学及伦理学方面的障碍，hESCs 在细胞替代治疗中的应用受到限制，且 为了研究与疾病相关的基因，可通过胚胎植入前遗传学诊断（PGD）技术分离疾病特异性的hESCs，但该方法在技术上仍具挑战性，且胚胎捐赠极为稀少。这些问题推动了干细胞生物学的发展，进而促进了诱导性多能干细胞（hiPSCs）的建立。
人类诱导多能干细胞（iPSCs）由人类成体体细胞经基因重编程获得，具有类似于人胚胎干细胞（hESCs）的多能干细胞特性，因此成为再生医学中极具价值的细胞来源，可用于药物筛选、疾病建模以及患者特异性的细胞治疗1,2。
迄今为止，已有多种方法可用于生成人类诱导多能干细胞（iPSCs），包括病毒介导法（逆转录病毒和腺病毒）3、非病毒介导法（BAC系统和载体转染）4 基因转导，以及蛋白质递送系统5-7。
尽管病毒介导的基因递送可确保一定程度的效率，但病毒载体可能会留下遗传痕迹，因为它们会以不受控制的方式整合到宿主染色体中以表达重编程基因。即使转录因子的病毒整合可能激活或失活宿主基因8，也可能导致意外的遗传异常以及致瘤风险5,9。另一方面，已有报道将蛋白质或RNA直接导入体细胞的方法，但这些方法存在一些缺点，例如操作繁琐、需要反复转染以及重编程效率较低7,10。即使是附加体型和非整合型腺病毒、腺相关病毒以及质粒载体，其效率仍然相对较低11。由于这些原因，选择具有高效诱导多能干细胞（iPSC）生成能力且遗传异常较少的非整合性重编程方法是合理的。在本研究中，我们采用基于仙台病毒的重编程方法。该方法已知不会整合到宿主基因组中，并能稳定地产生不含转基因整合的人类iPSC。
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方案
1. 细胞和培养基的准备（第1天）
- 使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基培养并扩增人成纤维细胞。
- 在转导前一天，将人成纤维细胞（图 1）以适当的密度接种至24孔板中，每孔接种一个密度梯度。
注意：建议采用以下系列稀释浓度（200K、100K、50K、25K、12.5K和6.25K），因为不同细胞类型的贴壁能力存在差异。 - 将细胞在37 °C、5% CO2的培养箱中继续孵育一天，确保细胞已完全贴壁并充分伸展。
2. 进行转导（第2天）
- 转导当天，检查细胞密度并选择密度最适的孔（图2）。建议选择三种不同密度：高密度（80~90%）、中密度（50~70%）和低密度（20~40%）。
- 转导前至少1小时 ，吸除成纤维细胞培养基，并更换为300 μl新鲜的成纤维细胞培养基。
- 从-80 °C冰箱中取出一组4管不同的仙台病毒，同时置于37 °C水浴中数秒以快速解冻，随后立即从水浴中取出。接着在室温下继续解冻；以6,000 × g离心10秒，之后置于冰上备用。切勿反复冻融病毒，以免滴度下降。
- 根据说明，将四管仙台病毒（Oct-4、Klf-4、c-Myc 和 Sox-2）分别取适量体积加入同一微量离心管中。通过轻柔吹打确保溶液充分混匀。
例如，若每孔24孔板接种50,000个细胞用于转导：
（滴度依据Life Technologies提供的分析证书，不同批次可能有所差异）
Tube hOct-4 = 6.0 × 107 CIU，3 MOI = 5 μl
Tube hSox-2 = 6.5 × 107 CIU，3 MOI = 4.6 μl
Tube hKlf-4 = 6.3 × 107 CIU，3 MOI = 4.8 μl
Tube hc-Myc = 7.8 × 107 CIU，3 MOI = 3.8 μl
总计 = 每孔（50,000个细胞）24孔板加入四种病毒因子混合液共18.2 μl - 根据细胞密度，向孔中加入2X、1X或0.5X体积的病毒混合液。轻轻前后左右晃动培养板以混匀（2X：36.4 μl病毒混合液，1X：18.2 μl，0.5X：9.1 μl）。
- 将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。
3. 更换培养基（第3天） &第5天
- 24 小时 转导后，将培养基更换为500 μl新鲜的成纤维细胞培养基。
- 第5天，更换为新鲜的成纤维细胞培养基。
4. 准备共培养用的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养皿（第8天）
- 在将转导的成纤维细胞传代至MEF饲养细胞前一天，于60 mm培养皿中用含10% FBS的DMEM培养基制备MEF细胞。
注意： 每个 60 mm培养皿中使用5 x 105个MEF细胞。
5. 开始将转导细胞与MEF饲养细胞共培养（第9天）
- 接种转导细胞前，吸出含10% FBS的DMEM培养基，更换为新鲜的含10% FBS的DMEM培养基至MEF饲养层培养皿中。
- 移除24孔板中转导纤维细胞的培养基，用D-PBS洗涤细胞一次。向24孔板中的纤维细胞加入200 μl 0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液。胰蛋白酶/EDTA作用时间少于5分钟 ，当细胞开始从培养板脱落时，用生长培养基收集细胞至15 ml锥形管中，随后以6,000 × g离心4分钟。
注意：建议将2X、1X和0.5X病毒转导的纤维细胞合并使用。 - 弃去上清液，用4–5 ml新鲜纤维细胞培养基重悬细胞沉淀，以中和胰蛋白酶作用。随后以135 × g离心4分钟。
- 将细胞按系列稀释密度接种，并开始在MEF上使用纤维细胞培养基进行共培养：例如每60 mm培养皿接种1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64和1/128稀释度。根据转导第一周内的细胞死亡率，可能无需稀释至1/2或1/128密度。保留剩余细胞用于提取总RNA，作为转基因RT-PCR的阳性对照。
- 将60 mm培养皿置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。
6. 更换人胚胎干细胞培养基并监测细胞（第10天）
- 第二天，将成纤维细胞培养基更换为含10 μM Y-27632的人胚胎干细胞（ES）培养基。此后每天更换一次培养基，使用人ES培养基：800 ml DMEM/F12 + 200 ml Knockout血清替代物 + 10 ml L-谷氨酰胺 + 10 ml 10 mM MEM最低必需非必需氨基酸溶液 + 1 ml 2-巯基乙醇 + 10 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子。
- 每天用新鲜的人ES培养基更换培养液。一周后，在显微镜下每2~3天检查一次培养皿，观察是否形成类似胚胎干细胞集落的细胞团块。根据细胞类型的不同，培养所需时间可能有所差异，直至观察到集落出现。
7. 挑选诱导性多能干细胞克隆并扩增细胞（第20天起）
- 转导后三周，应出现生长良好的克隆，可用于挑取。
- 挑取克隆的前一天，在24孔板中准备MEF饲养层。
注意： 我们使用12.5 × 105个MEF接种一个24孔板。 - 次日，将MEF培养皿中的培养基由成纤维细胞培养基更换为含10 μM Y-27632的人胚胎干细胞培养基。在显微镜下于挑取操作台中逐个手动挑取克隆，通过移液将其制成较小的细胞团块，并转移至新制备的MEF培养皿中。尽量挑取多个克隆。
- 最初将24孔板中的每孔细胞传代并扩增至6孔板，随后由6孔板扩增至60 mm培养皿，再进行进一步传代培养。
8. 人类iPSCs的表征（传代10次后）
- 免疫荧光
- 将人iPSC接种于24孔板中，培养4-5天，每天更换培养基。
- 开始免疫荧光实验时，先用 D-PBS 洗涤培养板一次。然后立即用 0.4% 多聚甲醛固定细胞 30 分钟。随后用 D-PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
- 用 PBS 配制的 0.1% Triton X-100 溶液在室温下处理固定细胞 15 分钟。
- 吸去透化溶液（0.1% Triton X-100 溶液），然后加入 0.5% BSA 封闭液，孵育 1 小时 在室温下
- 使用抗人抗体在0.5% BSA溶液中检测Nanog、Oct-4、SSEA（阶段特异性胚胎抗原）和TRA-1-81（肿瘤排斥抗原）（抗体稀释比例参见材料表）。孵育一抗2小时。 在室温下孵育。然后用 D-PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
- 1小时后使用荧光显微镜检查 孵育Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG抗体作为第二抗体nd 抗体以1:2,000比例溶于0.5% BSA溶液中，室温下孵育。使用DAPI对每孔MEF饲养层细胞和hiPSCs的所有细胞核进行染色。
- 转基因确认的RT-PCR
- 使用RNA提取试剂从细胞沉淀中提取总mRNA。
- 对总RNA的等分试样（1 μg）进行逆转录，获得cDNA，用于逆转录酶介导的PCR扩增。
- 配制PCR反应体系，包含2 μl cDNA模板、10 μl 2X PCR预混液、2 μl 2 pmol引物（正向引物1 μl，反向引物1 μl）和6 μl去离子水。为检测基因表达，使用下表所列引物进行RT-PCR扩增。 表1.
- 以GAPDH基因为对照进行RT-PCR，以评估扩增反应的效率。通过1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行可视化和分析。
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结果
通常情况下，成纤维细胞在经仙台病毒转导后的数天内不会表现出任何形态学变化，但五天后，它们开始呈现不同的形态（图1）。如图1右侧所示，细胞不再具有典型的成纤维细胞形态，而是呈现圆形，且细胞核比细胞质更大。即使转导是在细胞融合度达到80%时进行的，一旦细胞开始重编程，培养孔中的细胞看起来融合度会降低。当大多数培养孔中均开始出现此类形态学变化时，即可将转导后的成纤维细胞接种至MEF饲养层培养皿中。
在本实验方案中，我们缩小了细胞培养规模，并提供了多种重编程条件选择，例如采用不同的成纤维细胞密度和病毒滴度，以及后续不同的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）传代比例，这些调整将提高人诱导多能干细胞（hiPSCs）的生成效率（图2）。在转导前，可根据培养孔中细胞的不同汇合度（低、中、高）选择合适的孔进行后续仙台病毒转导；在培养板中分别以红色、绿色和黄色表示。
在MEF饲养层上开始重编程的初期，很难区分被转导的细胞类型，但共培养一周后，部分重编程的...
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讨论
将人类体细胞重编程为诱导多能干细胞（hiPSCs）在基础生物学、个体化医学和移植领域具有前所未有的前景12。早期的人类iPSC制备依赖于DNA病毒，这类病毒存在整合至宿主基因组的风险，可能导致不良的遗传突变，从而限制其在药物开发和移植治疗等临床应用中的进一步使用13。基于这一原因，已有大量研究致力于通过多种替代方法建立无载体和无外源基因整合的人类iPSC系统，但与此同时，获得“无足迹”人类iPSC的效率也需被充分考虑。例如，与其他方法相比，RNA病毒引起的遗传异常程度较低14，尽管目前尚无全基因组测序的研究公开发表，以证实副粘病毒（仙台病毒）介导的iPSC生成具有“基因组安全性”。本文介绍一种利用仙台病毒高效且经济地生成hiPSC的方法。所获得的人类iPSC不含外源基因，且在增殖能力和发育潜能方面保持了与人类胚胎干细胞（hESCs）相似的细胞和分子特性。
我们能够使用同一套仙台病毒同时对多种来源的成纤维细胞（>4种）进行重编程。在我们的方法中，采用了不同的细胞汇合度和病毒剂量组合。这种“混合与匹配”的组合技术...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢李实验室成员对本文手稿提出的宝贵意见。李实验室的工作得到了纽约干细胞基金会罗伯特森研究员奖和马里兰干细胞研究基金（TEDCO）资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CytoTune-iPS 重编程试剂盒 | Invitrogen | A1378002 | |
| CF-6、MEFs、新霉素抗性、丝裂霉素C处理 | 全球干细胞 | GSC-6105M | 5 × 105/6 厘米或 12.5 × 10524孔板 |
| 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 1×（含EDTA 4Na） | Invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 培养基 | Invitrogen | 11330-032 | |
| 24孔细胞培养板，平底，带盖 | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 μM（储备液：10 mM） |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng（储存液：100 μg） |
| 无血清替代物 | Gibco | 10828028 | |
| 杜尔贝科'改良型伊格尔培养基（D-MEM，DMEM）（1×），液体（高葡萄糖） | Invitrogen | 11965118 | |
| 胎牛血清 | 赛默飞世尔科技 费门塔斯 | SH30071.03 | |
| L-谷氨酰胺-200 mM（100倍浓缩液），液体 | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM非必需氨基酸溶液，100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
| 2-巯基乙醇（1,000X），液体 | GIBCO | 21985023 | 1/1,000 |
| 豪泽相位对比血细胞计数板 | 豪泽科学 | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0.1% 明胶溶液 | Millipore | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| 抗 Tra-1-81 | 细胞信号传导 | 4745S | 1/200 |
| 小鼠单克隆 Oct4 抗体 | 圣克鲁斯 | SC-5279 | 1/1,000 |
| Nanog | R&研发 | AF1997 | 1/1,000 |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 | Invitrogen | 948492 | 1/2,000 |
| DPBS（Dulbecco）'磷酸盐缓冲液（1×，不含钙） &和镁 | Cellgro | 21-031-CV | |
| QuantiTect 反转录试剂盒 | QIAGEN | 205313 | |
| PCR预混液 [2X] | 赛默飞世尔科技 费门塔斯 | K0171 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | |
| 挑选罩 | NuAire | NU-301 | |
| 解剖镜 | 尼康 | SMZ745 |
参考文献
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