利用仙台病毒高效制备人诱导性多能干细胞 关键词：人诱导性多能干细胞，体细胞，仙台病毒，重编程，干细胞培养

摘要

本文介绍了我们已建立的利用仙台病毒将人类体细胞重编程为无外源基因的人类诱导多能干细胞的方法，该方法具有稳定的结果和更高的效率。

摘要

几年前，人类诱导性多能干细胞（iPSCs）的建立为生物医学领域开启了新时代。人类iPSCs的潜在应用包括模拟人类遗传性疾病的发病机制、基因校正后的自体细胞治疗，以及通过提供患者特异性且与症状相关的细胞来源实现个体化药物筛选。然而，该领域仍需克服若干障碍，例如在人类iPSCs生成后清除残留的重编程因子转基因表达。更重要的是，未分化的人类iPSCs中残留的转基因表达可能干扰正常的分化过程，并误导对疾病相关表型的解读 体外 表型。因此，人们已采用多种方法开发出无整合和/或无外源基因的人类诱导多能干细胞（iPSCs），这些方法包括腺病毒、piggyBac系统、微环载体、附加体型载体、直接蛋白质递送以及合成mRNA。然而，在大多数情况下，使用无整合方法进行重编程的效率相当低。

本文介绍了一种利用基于仙台病毒（RNA病毒）的重编程系统分离人类诱导多能干细胞（iPSCs）的方法。该重编程方法具有结果稳定、效率高且成本效益好的特点。

引言

人类胚胎干细胞（hESCs）具有自我更新的能力 体外 具有多能性，有望用于疾病建模、药物筛选，以及开发基于细胞的疗法以治疗疾病和组织损伤。然而，由于存在免疫学、肿瘤学及伦理学方面的障碍，hESCs 在细胞替代治疗中的应用受到限制，且 为了研究与疾病相关的基因，可通过胚胎植入前遗传学诊断（PGD）技术分离疾病特异性的hESCs，但该方法在技术上仍具挑战性，且胚胎捐赠极为稀少。这些问题推动了干细胞生物学的发展，进而促进了诱导性多能干细胞（hiPSCs）的建立。

人类诱导多能干细胞（iPSCs）由人类成体体细胞经基因重编程获得，具有类似于人胚胎干细胞（hESCs）的多能干细胞特性，因此成为再生医学中极具价值的细胞来源，可用于药物筛选、疾病建模以及患者特异性的细胞治疗^1,2。

迄今为止，已有多种方法可用于生成人类诱导多能干细胞（iPSCs），包括病毒介导法（逆转录病毒和腺病毒）³、非病毒介导法（BAC系统和载体转染）⁴ 基因转导，以及蛋白质递送系统^5-7。

尽管病毒介导的基因递送可确保一定程度的效率，但病毒载体可能会留下遗传痕迹，因为它们会以不受控制的方式整合到宿主染色体中以表达重编程基因。即使转录因子的病毒整合可能激活或失活宿主基因⁸，....

方案

1. 细胞和培养基的准备（第1天）

1. 使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基培养并扩增人成纤维细胞。
2. 在转导前一天，将人成纤维细胞（图 1）以适当的密度接种至24孔板中，每孔接种一个密度梯度。
   注意：建议采用以下系列稀释浓度（200K、100K、50K、25K、12.5K和6.25K），因为不同细胞类型的贴壁能力存在差异。
3. 将细胞在37 °C、5% CO₂的培养箱中继续孵育一天，确保细胞已完全贴壁并充分伸展。

2. 进行转导（第2天）

1. 转导当天，检查细胞密度并选择密度最适的孔（图2）。建议选择三种不同密度：高密度（80~90%）、中密度（50~70%）和低密度（20~40%）。
2. 转导前至少1小时 ，吸除成纤维细胞培养基，并更换为300 μl新鲜的成纤维细胞培养基。
3. 从-80 °C冰箱中取出一组4管不同的仙台病毒，同时置于37 °C水浴中数秒以快速解冻，随后立即从水浴中取出。接着在室温下继续解冻；以6,000 × g离心10秒，之后置于冰上备用。切勿反复冻融病毒，以免滴度下降。
4. 根据说明，将四管仙台病毒（Oct-4、Klf-4、c-Myc 和 Sox-2）....

结果

通常情况下，成纤维细胞在经仙台病毒转导后的数天内不会表现出任何形态学变化，但五天后，它们开始呈现不同的形态（图1）。如图1右侧所示，细胞不再具有典型的成纤维细胞形态，而是呈现圆形，且细胞核比细胞质更大。即使转导是在细胞融合度达到80%时进行的，一旦细胞开始重编程，培养孔中的细胞看起来融合度会降低。当大多数培养孔中均开始出现此类形态学变化时，即可将转导后的成纤维细胞接种至MEF饲养层培养皿中。

在本实验方案中，我们缩小了细胞培养规模，并提供了多种重编程条件选择，例如采用不同的成纤维细胞密度和病毒滴度，以及后续不同的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）传代比例，这些调整将提高人诱导多能干细胞（hiPSCs）的生成效率（图2）。在转导前，可根据培养孔中细胞的不同汇合度（低、中、高）选择合适的孔进行后续仙台病毒转导；在培养板中分别以红色、绿色和黄色表示。

在MEF饲养层上开始重编程的初期，很难区分被转导的细胞类型，但共培养一周后，部分重编程的.......

讨论

将人类体细胞重编程为诱导多能干细胞（hiPSCs）在基础生物学、个体化医学和移植领域具有前所未有的前景¹²。早期的人类iPSC制备依赖于DNA病毒，这类病毒存在整合至宿主基因组的风险，可能导致不良的遗传突变，从而限制其在药物开发和移植治疗等临床应用中的进一步使用¹³。基于这一原因，已有大量研究致力于通过多种替代方法建立无载体和无外源基因整合的人类iPSC系统，但与此同时，获得“无足迹”人类iPSC的效率也需被充分考虑。例如，与其他方法相比，RNA病毒引起的遗传异常程度较低¹⁴，尽管目前尚无全基因组测序的研究公开发表，以证实副粘病毒（仙台病毒）介导的iPSC生成具有“基因组安全性”。本文介绍一种利用仙台病毒高效且经济地生成hiPSC的方法。所获得的人类iPSC不含外源基因，且在增殖能力和发育潜能方面保持了与人类胚胎干细胞（hESCs）相似的细胞和分子特性。

我们能够使用同一套仙台病毒同时对多种来源的成纤维细胞（>4种）进行重编程。在我们的方法中，采用了不同的细胞汇合度和病毒剂量组合。这种“混合与匹配”的组合技术.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CytoTune-iPS 重编程试剂盒	Invitrogen	A1378002
CF-6、MEFs、新霉素抗性、丝裂霉素C处理	全球干细胞	GSC-6105M	5 × 105/6 厘米或 12.5 × 10524孔板
0.25% 胰蛋白酶 EDTA 1×（含EDTA 4Na）	Invitrogen	25200114
DMEM/F-12 培养基	Invitrogen	11330-032
24孔细胞培养板，平底，带盖	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 μM（储备液：10 mM）
碱性成纤维细胞生长因子	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 ng（储存液：100 μg）
无血清替代物	Gibco	10828028
杜尔贝科'改良型伊格尔培养基（D-MEM，DMEM）（1×），液体（高葡萄糖）	Invitrogen	11965118
胎牛血清	赛默飞世尔科技 费门塔斯	SH30071.03
L-谷氨酰胺-200 mM（100倍浓缩液），液体	GIBCO	25030-081	1/100
MEM非必需氨基酸溶液，100X	LIFE TECHNOLOGIES	11140050	1/100
2-巯基乙醇（1,000X），液体	GIBCO	21985023	1/1,000
豪泽相位对比血细胞计数板	豪泽科学	02-671-54
EmbryoMax 0.1% 明胶溶液	Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
抗 Tra-1-81	细胞信号传导	4745S	1/200
小鼠单克隆 Oct4 抗体	圣克鲁斯	SC-5279	1/1,000
Nanog	R&研发	AF1997	1/1,000
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠	Invitrogen	948492	1/2,000
DPBS（Dulbecco）'磷酸盐缓冲液（1×，不含钙） &和镁	Cellgro	21-031-CV
QuantiTect 反转录试剂盒	QIAGEN	205313
PCR预混液 [2X]	赛默飞世尔科技 费门塔斯	K0171
Trizol	Invitrogen	15596018
挑选罩	NuAire	NU-301
解剖镜	尼康	SMZ745