通过有限蛋白酶消化和天然PAGE监测抗病毒模式识别受体RIG-I和PKR的激活

摘要

针对病毒感染的先天防御反应由模式识别受体（PRRs）触发。两种胞质PRRs——RIG-I和PKR——可结合病毒特征性RNA，发生构象改变、寡聚化，并激活抗病毒信号通路。本文描述的方法可方便地监测这些胞质PRRs的构象转换和寡聚化过程。

摘要

宿主对病毒感染的防御依赖于先天免疫系统中的模式识别受体（PRRs）对病原体的快速识别。在细胞质中，PRRs中的RIG-I和PKR可结合特定的病毒RNA配体。这一过程首先介导受体构象改变和寡聚化，进而激活抗病毒干扰素反应。尽管检测宿主抗病毒基因表达的方法已较为成熟，但直接监测RIG-I和PKR激活状态的方法尚不完善，且应用较少。

本文中，我们描述了两种方法，用于监测感染已知的干扰素诱导剂——裂谷热病毒突变株克隆13（Cl 13）后RIG-I和PKR的激活情况。通过有限胰蛋白酶消化，可分析模式识别受体（PRRs）蛋白酶敏感性的变化，从而反映其构象改变。模拟感染细胞裂解物的胰蛋白酶消化结果显示RIG-I和PKR迅速降解，而Cl 13感染则导致出现一种抗蛋白酶的RIG-I片段。PKR同样表现出病毒诱导的部分抗胰蛋白酶消化特性，该特性与其在Thr 446位点的标志性磷酸化一致。RIG-I和PKR寡聚体的形成通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）得以验证。感染后，RIG-I和PKR的寡聚复合物显著积累，而在模拟感染样本中，这两种蛋白则以单体形式存在。

将有限蛋白酶消化和天然PAGE电泳分别与蛋白质印迹分析相结合，可灵敏且直接地检测RIG-I和PKR激活过程中的两个不同步骤。这些技术操作相对简便、快速，且无需昂贵的仪器设备。

引言

在抗病毒宿主防御中，一个关键事件是所谓的模式识别受体（PRRs）对病原体的快速识别^1,2。细胞内对RNA病毒感染的检测依赖于两种胞质RNA解旋酶：RIG-I（视黄酸诱导基因I）和MDA5（黑色素瘤分化相关蛋白5）^3-5。RIG-I由两个N端的胱天蛋白酶募集结构域（CARDs）、一个中央的DECH-box型RNA解旋酶结构域以及一个C端结构域（CTD）组成^4,6。其中CTD和解旋酶结构域负责识别非自身（病毒）RNA，而CARDs则介导下游信号传导，从而建立抗病毒的宿主状态。

如果RIG-I处于静息状态，即在缺乏特异性RNA配体的情况下，其第二个CARD结构域会与中央解旋酶结构域相互作用，使RIG-I保持自抑制构象^7-11。RIG-I可结合带有5'-三磷酸基团（5'PPP）的短双链（ds）RNA、长双链RNA以及富含polyU/UC的RNA，这些是多种RNA病毒基因组中存在的典型特征结构^12-16。RIG-I活化的两个主要特征是构象转变为闭合状态^6,17以及发生同源寡聚化^6,18,19。构象转变可增强RNA结合能力，暴露CARD结构域以启动下游信号传导，并重建具有活性的ATP酶位点^8,9,11,20。寡聚化RIG-I复合物的形成有助于更有效地招募下游信号接头分子，从而构建抗病毒信号转导平台¹¹。RIG-I调控的信号通路最终激活转录因子IRF-3，上调干扰素（IFN-α/β）基因的表达，进而诱导干扰素刺激基因（ISGs）的表达，实现完整的抗病毒反应^21,22。其中研究最为清楚的ISG之一是RNA依赖性蛋白激酶（PKR）²³。PKR属于真核翻译起始因子2α（eIF2α）激酶家族，由N端双链RNA结合结构域和C端激酶结构域组成。激酶结构域构成PKR活化所必需的二聚化界面，并执行该蛋白的催化功能。PKR与病毒双链RNA结合后发生构象改变，允许其在Thr 446等多个位点发生二聚化及自磷酸化。随后PKR介导eIF2α的磷酸化，从而阻断病毒mRNA的翻译^23-27。

RIG-I 和 PKR 均会发生显著的结构重排，形成寡聚复合物，并通过磷酸化/去磷酸化以及泛素化进行翻译后修饰^{10,11,19,23,24,26-29}。为了更清楚地了解哪些病毒RNA结构能够激活 RIG-I 和 PKR（以及病毒拮抗因子可能在哪个阶段进行干扰），精确确定其激活状态至关重要。先前已有研究报道，这两种模式识别受体（PRR）在激活后会产生抗胰蛋白酶消化的蛋白片段^6,17,30，并形成高级寡聚体^6,18,19。然而，尽管关于这些抗病毒宿主应答关键因子的文献极为丰富^1,2,24，直接检测方法的应用却相对少见。为了促进这些方法的更广泛应用，本文提供了简便且灵敏的实验方案，可用于可靠地分析 RIG-I 和 PKR 的激活状态。采用具有干扰素产生能力的人源细胞系 A549，以已知的 RIG-I 和 PKR 激活剂——减毒裂谷热病毒突变株克隆 13（Cl 13）^31,32进行感染。经过简单的细胞裂解处理后，利用有限胰蛋白酶消化结合蛋白质印迹（Western blot）分析检测感染细胞提取物中蛋白构象的转变，并通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（blue native PAGE）结合 Western blot 分析检测寡聚体的形成。

方案

1. 感染用 A549 细胞的接种

1. 在含有细胞培养基（DMEM，添加10% FCS、526.6 mg/l L-谷氨酰胺、50.000 U/l 青霉素和50 mg/l 链霉素）的T75培养瓶中，于37 °C和5% CO₂条件下培养A549细胞。
2. 开始收获细胞前，将细胞培养基、PBS和0.05%胰蛋白酶-EDTA置于37 °C水浴中预热。
3. 吸除培养基，用10 ml PBS洗涤细胞，随后吸除PBS。
4. 加入3 ml胰蛋白酶-EDTA，均匀覆盖培养瓶底部，将培养瓶转移至37 °C、5% CO₂的培养箱中。
5. 待所有细胞脱落后，加入7 ml细胞培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至15 ml Falcon离心管中。
6. 在室温下以800 × g离心5分钟，弃上清，用10 ml新鲜细胞培养基重悬细胞沉淀。
7. 使用细胞计数板对细胞进行计数。
8. 将2.5 × 10⁶个细胞加入5 ml细胞培养基中，分别接种至两个T25培养瓶中，于37 °C和5% CO₂条件下培养16小时。其中一个培养瓶作为模拟对照，另一个用于Cl 13病毒感染。

2. 使用裂谷热病毒克隆 13（Cl 13）进行感染

1. 注意：Cl 13 是一种减毒病毒突变体，在德国可在 BSL-2 条件下操作。请参考相关国家指南。其他典型的干扰素诱导剂包括仙台病毒（Cantell 株）或新城疫病毒。
2. 预热 PBS、无血清培养基以及含 5% FCS 的细胞培养基。
3. 用无血清培养基配制浓度为 1.25 × 10⁷ PFU/ml 的 Cl 13 病毒液，用于以感染复数（MOI）5 的条件感染 2.5 × 10⁶ 个 A549 细胞。为避免移液误差，应准备略多（约 10%）于实际所需量的病毒液。
4. 按照步骤 1.3 所述方法用 PBS 洗涤细胞。
5. 向细胞中加入 1 ml Cl 13 稀释液或无血清培养基（未感染对照组，模拟感染），在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 1 小时。每 15 分钟轻柔晃动培养瓶一次，以确保 Cl 13 稀释液或无血清培养基均匀分布。
6. 感染 1 小时后，移除接种物，加入 5 ml 预热的含 5% FCS 的细胞培养基，在 37 °C、5% CO₂ 条件下继续孵育 5 小时。

3. 细胞裂解物的制备

1. 在 4 °C 下配制 PBS / 0.5% Triton X-100。不要添加丝氨酸蛋白酶抑制剂。
2. 用预冷的 PBS 洗涤细胞，并加入 10 ml 新鲜 PBS。
3. 刮下细胞，将细胞悬液转移至离心管中，在室温下以 800 × g 离心 5 分钟。
4. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 30 µl PBS / 0.5% Triton X-100 中。将裂解液转移至新的 1.5 ml 离心管，并在 4 °C 下孵育至少 10 分钟。
5. 在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 10 分钟，将澄清的细胞裂解液（上清液）转移至新的离心管中。
6. 采用 Bradford 法测定蛋白浓度，具体步骤参见其他文献³³。
7. 可在 -20 °C 保存，或直接进行胰蛋白酶消化（4.1）或非变性 PAGE（5.1）。

4. 模式识别受体构象变化的测定

1. 细胞裂解液的 TPCK-胰蛋白酶处理
   1. 用 PBS 将甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮处理的（TPCK 处理的）胰蛋白酶稀释至终工作浓度为 2 µg/µl。
   2. 在两个新离心管中，用 PBS 将每种蛋白裂解液（mock 或 Cl 13）调整至终体积为 9 µl、终蛋白浓度为 25 µg。因此应共准备四管，每管含 25 µg 裂解蛋白，其中 mock 感染两次，Cl 13 感染两次。一组作为输入对照（未处理），另一组用于 TPCK-胰蛋白酶处理。
   3. 向各细胞裂解液中加入 1 µl PBS（未处理）或 1 µl 浓度为 2 µg/µl 的 TPCK-胰蛋白酶（终浓度：0.2 µg/µl），并通过移液混匀反应体系。切勿反复冻融 TPCK-胰蛋白酶分装样品，以免影响消化效率。
   4. 在 37 °C 孵育裂解液 25 分钟。加入 5 倍变性上样缓冲液（250 mM Tris-HCl pH 6.8，10% SDS，50% 甘油，25% β-巯基乙醇，0.5% 溴酚蓝）并 95 °C 煮沸 5 分钟以终止反应。注意：胰蛋白酶孵育时间不可延长。若未检测到蛋白酶抗性片段，则必须缩短胰蛋白酶消化时间。
   5. 煮沸后，样品可在 -20 °C 保存。
2. SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）及蛋白质印迹
   1. 将样品上样至含 5% 浓缩胶和 12% 分离胶的十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶中，每块凝胶以 25 mA 恒流电泳，直至溴酚蓝迁移出凝胶底部。
   2. 用甲醇活化聚偏二氟乙烯（PVDF）膜 30 秒，随后将其放入转移缓冲液（48 mM Tris，39 mM 甘氨酸，1.3 mM SDS，20% 甲醇）中。
   3. 使用半干式转膜系统进行转膜，于 10 V 条件下转移 1 小时。取出膜，用去离子水短暂漂洗，然后晾干。
   4. 将膜短暂浸入甲醇中重新活化，随后用 TBS 洗涤 5 分钟。用含 10% 脱脂奶粉的 TBS 室温封闭 1 小时，或 4 °C 过夜。用 TBS 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
   5. 按照表 1 推荐条件配制一抗稀释液，室温孵育 1 小时，或 4 °C 过夜。
   6. 用 TBS-T 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。加入以 1:20,000 比例稀释于含 1% 脱脂奶粉 TBS 中的相应辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育 45 分钟。
   7. 用 TBS-T 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟，最后再用 TBS 洗涤一次。
   8. 使用商用化学发光检测试剂盒和数字凝胶成像系统进行信号检测。
3. 考马斯亮蓝 G-250 染色
   1. 按 4.2.1 所述进行 SDS-PAGE。将样品上样至 SDS 聚丙烯酰胺凝胶，每块凝胶以 25 mA 恒流电泳，直至溴酚蓝迁移出凝胶底部。
   2. 在室温下进行考马斯亮蓝 G-250 染色。所有孵育步骤均需持续振荡。
   3. 将凝胶转移至含 40% 甲醇和 10% 乙酸的固定液中，固定 30 分钟。
   4. 更换为脱色液（25% 乙醇和 8% 乙酸），孵育 5 分钟。
   5. 用含 0.2% 考马斯亮蓝 G-250、40% 甲醇和 10% 乙酸的染色液染色 1 小时。
   6. 用脱色液进行脱色处理，并在 10 分钟、30 分钟和 60 分钟后更换脱色液。
   7. 将凝胶保存于含 25% 乙醇、8% 乙酸和 4% 甘油的溶液中，4 °C 保存。
   8. 按 4.2.8 所述进行成像与分析。

5. 模式识别受体寡聚状态的分析

1. 非变性PAGE
   1. 将50 µg细胞裂解液用PBS稀释至终体积10 µl，并加入5×非变性上样缓冲液（250 mM Tris-HCl pH 6.8、1% 脱氧胆酸钠、50% 甘油、0.5% 溴酚蓝），使终浓度为1×。
   2. 立即将样品上样至非变性聚丙烯酰胺凝胶，其中浓缩胶为5%，分离胶为8%。任何延迟均会导致天然复合物损失³⁴。
   3. 在4 °C条件下，以50 mM Tris-NaOH pH 9.0、384 mM 甘氨酸作为阳极缓冲液，50 mM Tris pH 8.3、384 mM 甘氨酸、1% 脱氧胆酸钠作为阴极缓冲液，每块凝胶20 mA恒流电泳。电泳1.5–2小时后结束（溴酚蓝条带约在45分钟前已离开凝胶）。
2. 蛋白质印迹（Western Blotting）
   1. 将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜用甲醇活化30秒，随后放入托宾缓冲液（25 mM Tris、192 mM 甘氨酸、0.1% SDS、20% 甲醇）中。
   2. 按照制造商说明组装湿转装置，并用托宾缓冲液充满转膜槽。
   3. 在4 °C条件下，以250 mA恒流转膜1.5小时。
   4. 转膜完成后，按4.2.3节及后续步骤进行操作。

结果

RIG-I 或 PKR 对病毒激动剂的识别会触发构象转换^6,17,30和寡聚化^6,18,27。我们分别通过有限蛋白酶消化和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测了这两种活化标志。

人A549细胞被裂谷热病毒克隆株13（Cl 13）感染，该病毒株的特点是干扰素拮抗蛋白NSs存在突变^35,36。由于缺乏功能性NSs蛋白，克隆株13可强烈诱导RIG-I和PKR，从而在细胞内建立强烈的抗病毒状态^12,31,32,37。

模拟感染细胞裂解物的胰蛋白酶消化导致RIG-I迅速降解，而Cl 13感染则产生一个30 kDa的抗胰蛋白酶消化的RIG-I片段图1A。此外，PKR在感染样品中也表现出对胰蛋白酶消化的部分抗性，这与其磷酸化状态一致图1A。为监测胰蛋白酶消化的效率和特异性，凝胶使用考马斯亮蓝G-250染色。未经处理的样品显示上样蛋白量相等图1B。将模...

讨论

感知病毒的存在并激活抗病毒I型干扰素系统对于成功的先天免疫应答至关重要²²。病毒的检测由模式识别受体（PRRs）如RIG-I和PKR介导，从而能够快速启动并激活抗病毒防御机制。本文中，我们描述了两种直接评估RIG-I和PKR激活状态的方法。

利用有限蛋白酶消化来监测RIG-I和PKR构象变化的方法，最初分别由M. Gale Jr. 和T. Fujita^6,17以及J. L. Cole³⁰的研究团队提出。该方法是一种灵敏的手段，用于评估因构象改变而导致的胰蛋白酶处理敏感性变化。通过胰蛋白酶消化实验，我们发现模拟感染样本中的RIG-I和PKR迅速降解，而病毒感染细胞裂解物经胰蛋白酶处理后则产生抗胰蛋白酶的RIG-I片段。类似地，在Cl 13病毒感染条件下也检测到抗胰蛋白酶的PKR片段。该现象伴随PKR在Thr 446位点的磷酸化，后者是广泛使用的PKR活化标志。通过考马斯亮蓝染色比较模拟感染与Cl 13病毒感染细胞裂解物的胰蛋白酶消化结果，显示总体蛋白质水平下降程度相似。这表明抗性片段的形成是RIG-I和PKR等蛋白质所...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 (DMEM)	Gibco	21969-035
OptiMEM	Gibco	31985-47
L-谷氨酰胺	PAA	25030-024
青霉素-链霉素	PAA	15070-063
胎牛血清 (FCS)	PAA	10270
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054
化学试剂
L-1-对甲苯磺酰胺-2-苯乙基氯甲基酮处理的 (TPCK) 胰蛋白酶	Sigma Aldrich	T1426
抗体
小鼠单克隆抗 RIG-I 抗体 (ALME-1)	Enzo Life Sciences	ALX-804-849-C100	WB: 1:500，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS
小鼠单克隆抗 PKR 抗体 (B10)	Santa Cruz	sc-6282	WB: 1:500，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS
兔单克隆抗磷酸化 PKR 抗体 (Thr446)	Epitomics	1120-1	WB: 1:1,000，溶于含 5% BSA 的 TBS
兔多克隆抗 IRF-3 抗体	Santa Cruz	sc-9082	WB: 1:500，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS
兔单克隆抗磷酸化 IRF-3 抗体 (Ser386)	IBL	og-413	WB: 1:100，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS
兔抗裂谷热病毒高免血清 "C2" (MP-12)	由 Alejandro Brun CISA-INIA 惠赠		WB: 1:2,000，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS
小鼠单克隆抗 β-肌动蛋白抗体 (8H10D10)	Cell Signalling	3700	WB: 1:1,000，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS
辣根过氧化物酶标记的多克隆山羊抗兔 IgG	Thermo Fisher	0031460 1892914	WB: 1:20,000，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS
辣根过氧化物酶标记的多克隆山羊抗小鼠 IgG	Thermo Fisher	0031430 1892913	WB: 1:20,000，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS