通过有限蛋白酶消化和天然PAGE监测抗病毒模式识别受体RIG-I和PKR的激活

摘要

针对病毒感染的先天防御反应由模式识别受体（PRRs）触发。两种胞质PRRs——RIG-I和PKR——可结合病毒特征性RNA，发生构象改变、寡聚化，并激活抗病毒信号通路。本文描述的方法可方便地监测这些胞质PRRs的构象转换和寡聚化过程。

摘要

宿主对病毒感染的防御依赖于先天免疫系统中的模式识别受体（PRRs）对病原体的快速识别。在细胞质中，PRRs中的RIG-I和PKR可结合特定的病毒RNA配体。这一过程首先介导受体构象改变和寡聚化，进而激活抗病毒干扰素反应。尽管检测宿主抗病毒基因表达的方法已较为成熟，但直接监测RIG-I和PKR激活状态的方法尚不完善，且应用较少。

本文中，我们描述了两种方法，用于监测感染已知的干扰素诱导剂——裂谷热病毒突变株克隆13（Cl 13）后RIG-I和PKR的激活情况。通过有限胰蛋白酶消化，可分析模式识别受体（PRRs）蛋白酶敏感性的变化，从而反映其构象改变。模拟感染细胞裂解物的胰蛋白酶消化结果显示RIG-I和PKR迅速降解，而Cl 13感染则导致出现一种抗蛋白酶的RIG-I片段。PKR同样表现出病毒诱导的部分抗胰蛋白酶消化特性，该特性与其在Thr 446位点的标志性磷酸化一致。RIG-I和PKR寡聚体的形成通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）得以验证。感染后，RIG-I和PKR的寡聚复合物显著积累，而在模拟感染样本中，这两种蛋白则以单体形式存在。

将有限蛋白酶消化和天然PAGE电泳分别与蛋白质印迹分析相结合，可灵敏且直接地检测RIG-I和PKR激活过程中的两个不同步骤。这些技术操作相对简便、快速，且无需昂贵的仪器设备。

引言

在抗病毒宿主防御中，一个关键事件是所谓的模式识别受体（PRRs）对病原体的快速识别^1,2。细胞内对RNA病毒感染的检测依赖于两种胞质RNA解旋酶：RIG-I（视黄酸诱导基因I）和MDA5（黑色素瘤分化相关蛋白5）^3-5。RIG-I由两个N端的胱天蛋白酶募集结构域（CARDs）、一个中央的DECH-box型RNA解旋酶结构域以及一个C端结构域（CTD）组成^4,6。其中CTD和解旋酶结构域负责识别非自身（病毒）RNA，而CARDs则介导下游信号传导，从而建立抗病毒的宿主状态。

如果RIG-I处于静息状态，即在缺乏特异性RNA配体的情况下，其第二个CARD结构域会与中央解旋酶结构域相互作用，使RIG-I保持自抑制构象^7-11。RIG-I可结合带有5'-三磷酸基团（5'PPP）的短双链（ds）RNA、长双链RNA以及富含polyU/UC的RNA，这些是多种RNA病毒基因组中存在的典型特征结构^12-16。RIG-I活化的两个主要特征是构象转变为闭合状态^6,17以及发生同源寡聚化^6,18,19。构象转变可增强RNA结合能力，暴露CARD结构域以启动下游信号传导，并重建具有活性的ATP酶位点^8,9,11,20。寡聚化RIG-I复合物的形成有助于更有效地招募下游信号接头分子，从而构建抗病毒信号转导平台....

方案

1. 感染用 A549 细胞的接种

1. 在含有细胞培养基（DMEM，添加10% FCS、526.6 mg/l L-谷氨酰胺、50.000 U/l 青霉素和50 mg/l 链霉素）的T75培养瓶中，于37 °C和5% CO₂条件下培养A549细胞。
2. 开始收获细胞前，将细胞培养基、PBS和0.05%胰蛋白酶-EDTA置于37 °C水浴中预热。
3. 吸除培养基，用10 ml PBS洗涤细胞，随后吸除PBS。
4. 加入3 ml胰蛋白酶-EDTA，均匀覆盖培养瓶底部，将培养瓶转移至37 °C、5% CO₂的培养箱中。
5. 待所有细胞脱落后，加入7 ml细胞培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至15 ml Falcon离心管中。
6. 在室温下以800 × g离心5分钟，弃上清，用10 ml新鲜细胞培养基重悬细胞沉淀。
7. 使用细胞计数板对细胞进行计数。
8. 将2.5 × 10⁶个细胞加入5 ml细胞培养基中，分别接种至两个T25培养瓶中，于37 °C和5% CO₂条件下培养16小时。其中一个培养瓶作为模拟对照，另一个用于Cl 13病毒感染。

2. 使用裂谷热病毒克隆 13（Cl 13）进行感染

1. 注意：Cl 13 是一种减毒病毒突变体，....

结果

RIG-I 或 PKR 对病毒激动剂的识别会触发构象转换^6,17,30和寡聚化^6,18,27。我们分别通过有限蛋白酶消化和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测了这两种活化标志。

人A549细胞被裂谷热病毒克隆株13（Cl 13）感染，该病毒株的特点是干扰素拮抗蛋白NSs存在突变^35,36。由于缺乏功能性NSs蛋白，克隆株13可强烈诱导RIG-I和PKR，从而在细胞内建立强烈的抗病毒状态^12,31,32,37。

模拟感染细胞裂解物的胰蛋白酶消化导致RIG-I迅速降解，而Cl 13感染则产生一个30 kDa的抗胰蛋白酶消化的RIG-I片段图1A。此外，PKR在感染样品中也表现出对胰蛋白酶消化的部分抗性，这与其磷酸化状态一致图1A。为监测胰蛋白酶消化的效率和特异性，凝胶使用考马斯亮蓝G-250染色。未经处理的样品显示上样蛋白量相等图1B。将模.......

讨论

感知病毒的存在并激活抗病毒I型干扰素系统对于成功的先天免疫应答至关重要²²。病毒的检测由模式识别受体（PRRs）如RIG-I和PKR介导，从而能够快速启动并激活抗病毒防御机制。本文中，我们描述了两种直接评估RIG-I和PKR激活状态的方法。

利用有限蛋白酶消化来监测RIG-I和PKR构象变化的方法，最初分别由M. Gale Jr. 和T. Fujita^6,17以及J. L. Cole³⁰的研究团队提出。该方法是一种灵敏的手段，用于评估因构象改变而导致的胰蛋白酶处理敏感性变化。通过胰蛋白酶消化实验，我们发现模拟感染样本中的RIG-I和PKR迅速降解，而病毒感染细胞裂解物经胰蛋白酶处理后则产生抗胰蛋白酶的RIG-I片段。类似地，在Cl 13病毒感染条件下也检测到抗胰蛋白酶的PKR片段。该现象伴随PKR在Thr 446位点的磷酸化，后者是广泛使用的PKR活化标志。通过考马斯亮蓝染色比较模拟感染与Cl 13病毒感染细胞裂解物的胰蛋白酶消化结果，显示总体蛋白质水平下降程度相似。这表明抗性片段的形成是RIG-I和PKR等蛋白质所.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 (DMEM)	Gibco	21969-035
OptiMEM	Gibco	31985-47
L-谷氨酰胺	PAA	25030-024
青霉素-链霉素	PAA	15070-063
胎牛血清 (FCS)	PAA	10270
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054
化学试剂
L-1-对甲苯磺酰胺-2-苯乙基氯甲基酮处理的 (TPCK) 胰蛋白酶	Sigma Aldrich	T1426
抗体
小鼠单克隆抗 RIG-I 抗体 (ALME-1)	Enzo Life Sciences	ALX-804-849-C100	WB: 1:500，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS
小鼠单克隆抗 PKR 抗体 (B10)	Santa Cruz	sc-6282	WB: 1:500，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS
兔单克隆抗磷酸化 PKR 抗体 (Thr446)	Epitomics	1120-1	WB: 1:1,000，溶于含 5% BSA 的 TBS
兔多克隆抗 IRF-3 抗体	Santa Cruz	sc-9082	WB: 1:500，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS
兔单克隆抗磷酸化 IRF-3 抗体 (Ser386)	IBL	og-413	WB: 1:100，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS
兔抗裂谷热病毒高免血清 "C2" (MP-12)	由 Alejandro Brun CISA-INIA 惠赠		WB: 1:2,000，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS
小鼠单克隆抗 β-肌动蛋白抗体 (8H10D10)	Cell Signalling	3700	WB: 1:1,000，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS
辣根过氧化物酶标记的多克隆山羊抗兔 IgG	Thermo Fisher	0031460 1892914	WB: 1:20,000，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS
辣根过氧化物酶标记的多克隆山羊抗小鼠 IgG	Thermo Fisher	0031430 1892913	WB: 1:20,000，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS