方法文章

利用气相色谱法分析大鼠肝组织在妊娠期间脂肪酸组成的变化

DOI：

10.3791/51445

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2014年3月13日

 ,  ,  ,  , 
1Human Development & Health Academic Unit, Faculty of Medicine, University of Southampton

本文内容

摘要

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妊娠会导致母体组织中脂肪酸组成发生显著变化。可通过气相色谱法获取脂质谱，从而对妊娠期间饲喂不同高脂和低脂饮食的大鼠个体脂质类别中的脂肪酸进行鉴定和定量分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

气相色谱法（GC）是一种高灵敏度的方法，用于鉴定和定量组织、细胞以及血浆/血清中脂质的脂肪酸含量，具有高准确性和高重复性。在代谢与营养研究中，GC 可用于评估干预措施后或生理状态变化（如妊娠）期间脂肪酸浓度的变化。使用氨基丙基硅胶柱的固相萃取（SPE）可实现主要脂类的分离，包括甘油三酯、不同类型的磷脂和胆固醇酯（CE）。结合 SPE 的 GC 技术被用于分析饲喂不同高脂和低脂饮食的未孕和妊娠大鼠肝脏中 CE 组分脂肪酸组成的变化。饮食与妊娠之间存在显著的交互作用，影响肝脏 CE 中 omega-3 和 omega-6 脂肪酸的含量，表明妊娠雌性对饮食调控的反应与未孕雌性不同。

引言

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气相色谱法（GC）是一种成熟的技术，用于鉴定并定量分析脂肪酸在脂质库和细胞膜中的掺入情况1,2 在补充剂使用或肥胖（及相关疾病如糖尿病）或妊娠等生理条件下3-5它也适用于分析食品中脂肪的种类和含量。这在表征实验饮食以及确保食品工业符合相关法规时具有重要意义。例如，气相色谱法可用于确认膳食补充剂等产品中脂肪酸的种类和含量，以确保标签信息准确并符合法规要求。6,7.  脂肪酸分析可为健康与疾病状态下的脂质代谢、饮食改变的影响以及生理状态变化的作用提供有价值的见解8利用气相色谱法研究妊娠期间的样本，为脂肪酸和复杂脂质稳态的变化提供了重要信息3.

在色谱分离之前，通常使用氯仿和甲醇的溶剂混合物，基于脂质在其中的溶解性，从样品中提取脂质。加入氯化钠以促进混合物分离为水相和含脂质的有机相9,10。通过固相萃取（SPE）可将感兴趣的复杂脂质类别从总脂质提取物中分离出来。该分离技术依据脂质的极性或结合亲和力来洗脱不同的脂质类别。三酰甘油（TAG）和胆固醇酯（CE）首先作为合并组分被洗脱；随后通过逐步提高洗脱溶剂的极性，依次洗脱磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）以及非酯化脂肪酸（NEFA）。将TAG与CE分离时，利用TAG仅与新的SPE小柱结合的特性，使CE先被洗脱，随后通过提高洗脱溶剂的极....

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方案

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1. 动物实验操作

  1. 所有动物实验均应遵循英国内政部《动物（科学程序）法案》（1986年）的规定进行。
  2. 将10周龄的Wistar大鼠按一雄一雌配对交配，通过观察阴道栓的出现确认妊娠，并将发现阴道栓当日记为妊娠第1天，同时开始给予实验饮食。对于未交配的雌性大鼠，每只单独饲养，并开始给予实验饮食。
  3. 给予实验饮食20天后，采用CO2窒息法处死大鼠，随后进行颈椎脱位。
  4. 使用解剖镊和剪刀暴露腹腔，剪断连接肝脏与膈肌、腹前壁、胃及十二指肠的韧带，完整切除肝脏。用PBS冲洗肝脏后，置于液氮中速冻，随后储存在-80 °C条件下。

2. 总脂质提取物的制备9

  1. 向所有溶剂中加入分子筛（填充至溶剂容器体积的1/10 ），以制备“无水”溶剂。所有溶剂操作均应在通风橱内进行。
  2. 取约100 mg冷冻肝脏组织并称重。将组织置于冰桶中的试管内，加入0.8 ml冰浴预冷的0.9% NaCl溶液，匀浆处理组织。
  3. 加入用1 ml/mg无水氯仿:甲醇（2:1, v/v）溶解的内标物，其中含 作为抗氧化剂的丁基化羟基甲苯（BHT；50 mg/L）。对于100 mg大鼠肝脏组织，加入100 μg胆固醇酯标准品（胆固醇十七烷酸酯 17:0）。注意

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结果

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该方法的成功取决于严格遵循实验步骤，并使用洁净的溶剂和试剂，以减少色谱图中可能出现的“噪音”和污染。样品若被污染，分析难度将增加，从而降低曲线下面积计算的准确性。若成功遵循本方案，应获得具有良好对称性、峰形清晰且基线噪音极低的色谱图，如图3所示。若发生污染，色谱图将出现额外峰，并表现出非对称（偏斜）的峰形，如图4所示。当分析由胆固醇酯（CE）衍生的脂肪酸甲酯（FAME）时，若未去除胆固醇（见图1），将导致游离胆固醇的污染（去除方法见方案5）。

使用预先配制的校准混合物可实现对样品中脂肪酸甲酯（FAME）的鉴定。校准混合物采用与样品相同的仪器设置进行检测，以便将色谱图与样品进行比较，并根据保留时间准确识别各色谱峰，如图2所示。

采用峰面积来计算特定脂肪酸占总量的百分比。数据收集完成后，建议如图5所示对数据进行异常值检查。若发现异常样本，可进一步调查，并在必要时重.......

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讨论

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气相色谱法是一种用于脂肪酸分析的准确技术，其高重复性使其适用于临床分析。 必须选用合适的气相色谱柱，以便鉴定目标脂肪酸，现有色谱柱在固定相极性、柱长和内径方面存在差异。在该分析方法中使用熔融石英毛细管柱，由于其表面惰性强、分辨率好，因而具有良好的热稳定性和保留时间的高重复性8。

本方案中的关键步骤包括下相和上相的收集步骤（方案步骤 2.7 和 4.8）。在收集过程中，应尽可能完全收集目标相，同时避免混入任何非目标相的污染。样品中若存在杂质，将导致色谱结果不理想，如图 2所示。在固相萃取（SPE）过程中收集胆固醇酯（CE）时，必须在用正己烷洗涤后始终保持萃取柱被溶剂充分饱和（步骤 3.15），以确保样品充分渗透柱体，从而实现胆固醇酯与甘油三酯（TAG）的有效分离。进一步分离以去除游离胆固醇至关重要，可避免色谱图中出现干扰峰，如图 1所示。 此外，对于需要在真空条件下去除液体的步骤，也必须严格遵循操作，确保柱内液体被彻底.......

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披露

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作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

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作者谨此感谢 Meritxell Romeu-Nadal 对大鼠研究的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
甲醇Fisher ScientificM/4056/17'CAUTION' 蒸气 - HPLC 级
氯仿Fisher ScientificC/4966/17'CAUTION' 蒸气 - HPLC 级
BHTSigma- AldrichW218405'CAUTION' 粉尘蒸气 - 无水
NaClSigma- AldrichS9888无水
己烷Fisher ScientificH/0406/17'CAUTION' 蒸气 - HPLC 级
冰乙酸Sigma- Aldrich695084'CAUTION' 腐蚀性 - 99.85%
硫酸Sigma- Aldrich339741'CAUTION' 腐蚀性 - 99.999%
碳酸钾Sigma- Aldrich20961999% ACS 试剂级
碳酸氢钾Sigma- Aldrich23720599.7% ACS 试剂级
乙酸乙酯Fisher Scientific10204340'CAUTION' 蒸气 - 99+% GLC 指定
甲苯Fisher ScientificT/2300/15'CAUTION' 蒸气
乙醚Sigma- Aldrich309966'CAUTION' 蒸气
氮气（无氧）钢瓶BOC44-w'CAUTION' 压缩气体 - 有爆炸风险
氨基丙基硅胶 SPE 小柱Agilent12102014小柱 - 填料质量 100 mg
硅胶 SPE 小柱Agilent14102010小柱 - 填料质量 100 mg
分子筛Sigma- Aldrich334324颗粒，AW-300，1.6 mm
玻璃巴斯德吸管Fisher ScientificFB50251

参考文献

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  1. Browning, L. M., et al. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into lipid pools when given as supplements providing doses equivalent to typical intakes of oily fish. Am. J. Clin. Nutr. 96 (4), 748-758 (2012).
  2. Cao, J., Schwichtenberg, K. A., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y.

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