利用聚焦离子束制备冷冻电子显微镜样品

摘要

冷冻电子显微镜，包括扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM），广泛用于含水量较高的生物样品或其他材料的表征¹。利用扫描电镜/聚焦离子束（FIB）可识别样品中感兴趣的结构特征，并切割出一片薄而电子束可穿透的薄片，用于转移至冷冻透射电镜中进行进一步分析。

摘要

本文介绍了一种用于制备黑曲霉（Aspergillus niger）孢子冷冻透射电镜（cryo-TEM）样品的实验方案，该方法可轻松适用于多种微生物或溶液样品。我们使用自行设计的低温转移站和改装的冷冻扫描电镜（cryo-SEM）样品制备腔²。首先从培养物中取出孢子，在液氮雪泥中快速冷冻，并在冷冻扫描电镜中观察以选定感兴趣区域。随后利用聚焦离子束（FIB）切取一薄层样品，将其黏附至透射电镜载网，并进一步减薄至电子束可穿透的厚度。接着将载网转移至冷冻透射电镜样品 holder，并送入透射电镜中进行高分辨率观察。由于引入了冷却的纳米操纵探针和低温转移站，本方案实质上是将常规用于透射电镜样品制备的聚焦离子束技术在低温条件下进行的直接延伸。因此，该方法具有诸多优势：对现有仪器、装置和操作流程的改动需求较小，易于实施，应用范围广泛，原则上与冷冻透射电镜样品制备的应用范围相同。其局限性在于，在关键步骤中需要熟练操作样品，以避免或尽量减少污染。

引言

本方案采用冷冻聚焦离子束/扫描电子显微镜（cryo-FIB/SEM）技术，从样品中先前通过扫描电镜（SEM）高精度定位的特定区域制备透射电子显微镜（TEM）样品。生物样品的电子显微镜（扫描或透射）分析是科研与诊断中的常规技术。扫描电镜操作相对快速简便，结果易于解读，但仅能获取样品表面信息，分辨率为约1.5 nm。透射电镜具有更高分辨率，但实施难度较大，图像分析较为复杂，尽管可获得样品内部的体相信息，但样品必须减薄至电子束可穿透的程度（厚度小于约500 nm）。另一个问题是，这些仪器所需的真空环境通常无法被含水样品耐受。大多数情况下，生物样品必须经过化学固定（例如用水溶性聚合物替代水分）或干燥处理。在这两种情况下，样品的形态和结构均可能发生显著改变。对含水样品进行冷冻透射电镜制样可诱导最少的化学变化，所获得的样品状态尽可能接近其天然状态，尤其是在实现水的玻璃化冰形成时^1-6。

聚焦离子束（FIB）因其多种优势而被广泛用于透射电子显微镜（TEM）样品的制备⁷。主要优势包括：使用近法向入射的高能离子可最大限度地减少材料相关差异刻蚀速率的影响；可从块体样品中以亚微米级精度选择提取区域；仅需提取极少量的材料。近年来的一些技术进展使得FIB也可用于低温条件下的TEM样品制备^2,8-10。与主要用于软物质样品的传统冷冻超薄切片技术^11,12相比，FIB具有多项优势，例如避免了切片薄片时的机械变形、不存在刀痕，并且能够制备包含硬/软界面或组分的复合样品。

方案

注意：本方案中提供的所有参数均适用于此处指明的仪器及型号。若使用其他厂商或型号的设备，部分参数（文中以 * 标注）可能有所不同。

1. FIB/SEM 仪器的启动

1. 安装定制的冷纳米操纵器（NM）针尖时，不要将铜编织带连接到防污染器（AC）上。而是确保编织带连接到绝缘点上方的NM其余部分，以防止在修尖步骤（1.2）期间产生电荷积累。
   1. 关闭SEM腔室，抽至高真空并成像NM针尖。
   2. 如果针尖钝化、弯曲或因先前使用而受到污染，则使用离子束进行修尖：在针尖侧面选择多边形铣削模式，使铣削后针尖尖端直径减小至1 µm或更小。
   3. 当针尖侧面被铣削去除后，从SEM腔室外手动将整个NM杆旋转90°。
   4. 调整多边形铣削模式以适应旋转后的针尖，并从不同角度重复铣削操作。
2. 当针尖已被修尖至小于1 µm后，缩回NM，并插入气体注入系统（GIS）的针管；重新定位针管，使其位于工作距离上方约1 mm处（而非通常的175 µm）。
3. 若使用Pt前驱体，将其工作温度调整为24–26 °C（而非通常的40 °C）。这些步骤是实现Pt低温沉积¹³所必需的。
4. 打开SEM腔室，并通过安装低温样品台和防污染器（AC）将FIB/SEM系统准备为低温模式。
5. 将NM切换至插入位置，并将其铜编织带连接至防污染器（AC）。注意切勿意外触碰NM针尖。系统在NM插入状态下进行冷却，以确保铜编织带在低温下因柔韧性下降而不会影响NM的移动。
6. 用干燥氮气对冷却管道进行数分钟的吹扫。
7. 将低温制样腔室和主样品腔室抽至高真空。
8. 向杜瓦瓶中加入液氮以冷却两个腔室。等待直至达到目标温度。

2. 样品冷冻

1. 1. 将两个用于FIB样品的透射电镜（TEM）载网安装到SEM转移 holder 上，并使用螺丝刀拧紧相应的螺丝以固定。
   2. 安装适用于该样品的样品台，并加入部分样品。根据样品类型，可使用低温胶或夹具固定样品。应尽可能使用少量样品，以确保最佳冷冻效果。
   3. 将SEM转移 holder 安装到真空转移装置（VTD）上。
2. 1. 向制浆站中加入液氮并抽气，以获得氮冰浆。
   2. 打开制浆站，将SEM转移 holder 浸入冷冻。再次抽气，直至沸腾结束并重新形成冰浆。需要注意的是，乙烷或丙烷冰浆或高压冷冻是更适合实现样品玻璃化的技术。
3. 1. 将SEM转移 holder 收回至VTD的真空腔室内并密封。
   2. 释放制浆站和低温制样室气闸的真空。
   3. 对齐VTD密封端与低温制样室的气闸接口，并开始抽气。
   4. 当达到良好真空水平时，推动气闸销以打开VTD和外层气闸的密封；插入SEM转移 holder。制样室内的滑动接触处有标记，指示用于溅射和断裂的样品位置。
4. 如有需要，可对样品进行以下处理：使用低温刀进行断裂；通过升高温度（通常为-100 °C）进行升华；或使用低温溅射仪镀Au/Pd或Pt（300 V，10 mA，60秒，形成2–3 nm厚的Au/Pd覆盖层）*。玻璃化样品不应进行升华处理，以免发生重结晶。
5. 1. 使用低温刀打开TEM载网槽的保护盖。
   2. 将样品室内的低温台升至接收高度（16 mm*）。
   3. 关闭FIB/SEM的高压（HT），并打开内层气闸。
   4. 使用VTD将SEM holder 转移至样品室。调暗室内灯光可能有助于此步骤操作。
   5. 当SEM holder 进入低温台后，通过推压并旋转解除VTD连接。
   6. 将VTD推杆完全收回至VTD真空腔内，关闭内层气闸、外层气闸及VTD密封。此时可释放外层气闸以取下VTD密封。此最后一步非必需，但建议执行，以防VTD推杆意外脱落，造成VTD或气闸损坏。

3. 离子束刻蚀

1. 打开两根柱子的高电压，并设置适当的成像参数（电子束加速电压：10 kV，离子束加速电压：30 kV；光斑尺寸：3；工作距离：5 mm；成像时离子束电流：10–100 pA，切削时：1–3 nA）*。
2. 使用电子束寻找目标特征，并采集图像以记录样品在提取薄片前的状态。
3. 一旦确定了待提取的感兴趣区域（ROI），应通过离子束刻蚀进行标记，除非样品本身的形貌特征足以在铂沉积后仍能轻松识别该感兴趣区域。为提高精度，可采用Pettersson所述的方法。 等.¹⁴ 标记应足够深、足够宽，且间隔足够远，以便在被非选择性的低温铂沉积层覆盖后仍清晰可见（该沉积层将覆盖数毫米范围）² 样品表面的
4. 将前驱气体加热至24-26 °C，并将GIS针调节至高于样品表面约1 mm的高度（参见步骤1.3）。
5. 使用电子束成像时，打开气体阀门数秒钟。冷冻铂（cryo-Pt）沉积速率可达100–500 nm/sec或更高，具体速率取决于GIS针头的距离、样品表面粗糙度及用户系统的特性。建议进行数次测试沉积以确定最佳参数。
6. 原始冷冻铂沉积非常粗糙且不均匀。在低倍率（例如2,000X）下，使用1,000 pA离子束对感兴趣区域（ROI）进行沉积固化。与冷冻沉积不同，此固化步骤具有位点选择性，仅应在感兴趣区域内进行。首次冷冻沉积的目的是保护样品表面免受离子束损伤，并在离子减薄过程中减少帘幕效应。¹³.
7. 将样品倾斜至52° 使表面与离子束垂直。在目标区域（ROI）两侧铣出两个阶梯状沟槽。沟槽的典型尺寸为20-30 µm 沿平行于待提取薄层（X）的方向，10-15 µm，方向垂直（Y方向），深度呈可变的倾斜状（Z方向），最深点靠近ROI区域。倾斜角度应为45–55°在某些仪器中，阶梯状沟槽只能从顶部开始铣削至最深点。若如此，先在感兴趣区域（ROI）下方进行铣削，然后将图像旋转180度° 并在另一侧铣削第二个区域。如果已知材料的溅射速率，则可选择铣削深度。对于大多数冷冻水合样品，可采用冰的溅射速率⁷.
8. 将样品重新倾斜回 0° 使用离子束切削薄片的侧面和底面，确保切痕贯穿整个薄片（切痕应出现在上一步加工出的台阶状斜面上）。仅保留两个微小的连接桥，将薄片与样品其余部分相连。
9. 插入GIS针（此操作可能会轻微移动样品）。移动纳米操纵针（NM），使其尖端与薄片物理接触，最好接触侧面。确保纳米操纵针不妨碍离子束对两个小连接桥的观察。
10. 1. 打开GIS阀门数秒，并通过电子束连续成像监测低温沉积过程。
    2. 当额外加入1-2 µ在铂层已低温沉积后，关闭阀门。
    3. 仅对铂（见步骤 2.6）进行固化处理 µm 围绕 NM 与层片接触点的周围区域。
    4. 使用高离子束电流将薄片切离。应铣去连接的两个桥接部分，以及可能在薄片与样品其余部分之间形成新的接触点的任何多余铂层。此时不要收回气体注入系统（GIS）针头。
11. 小心操作纳米操纵器（NM），将薄片从沟槽中取出，并移动至少500 µ样品表面上方 m 处。仅在此步骤之后，收回 GIS 针头。
12. 降低样品台几毫米，移动样品台直至看到一个透射电镜（TEM）载网。将载网上的附件区域移至工作位置，并插入气体注入系统（GIS）针头。
13. 1. 小心移动纳米操纵器（NM），使附着的薄片与透射电镜（TEM）载网上的附着区域实现物理接触。薄片、TEM载网与纳米操纵器之间不应存在任何压力或张力。
    2. 打开气体阀门数秒，冷冻沉积额外的1-2 µ铂的m层。
    3. 仅对铂（见步骤 2.6）进行固化处理 µm 位于薄层与透射电镜载网接触点周围。
14. 使用高离子束电流将薄片从纳米操纵器（NM）上切割下来。可通过铣削去除纳米操纵器尖端或样品侧面来实现。在第一种情况下，下次使用前需按照步骤1.2所述重新 sharpen 纳米操纵器尖端。
15. 可选步骤：在此阶段，可使用VTD将SEM转移杆转移至充满液氮的杜瓦瓶中过夜储存。如果样品表面已存在冰晶和/或液氮暴露于潮湿空气中，则此转移和过夜储存过程可能导致冰在薄片表面形成；但此类污染将在下一步中于相对较短时间内被清除。由于前述步骤可能已耗时数小时，此时进行过夜储存可能是合适的；但在后续步骤之后则不建议进行此类过夜储存，因为此后若产生冰污染，将仅能通过升华去除（而若需维持样品的玻璃化状态，则无法进行升华处理）。
16. 将样品倾斜至52° 并使用离子束将其减薄至电子透明程度⁷建议先使用较高且较粗糙的束流去除大部分材料，然后逐步降低束流进行表面精细抛光，最终也可降低加速电压。样品薄片的最终厚度应根据样品组成而定：在100–200 kV透射电子显微镜（TEM）中进行超微结构分析时，厚度应为100–200 nm或更薄；在300 kV TEM中进行断层扫描时，厚度可增至500 nm。在减薄过程中，样品内部应力可能导致薄片卷曲或弯曲。此时应限制减薄区域。例如，在以下情况中即出现此类问题： 图11 和 12.

4. 冷冻转移至透射电子显微镜

1. 1. 用干燥的氮气对冷冻转移站吹扫几分钟。
   2. 向透射电镜AC的杜瓦瓶以及冷冻转移站中加入液氮。
   3. 将冷冻转移用透射电镜样品杆插入冷冻转移站的相应插槽中，并为其杜瓦瓶加注液氮。等待各组件达到所需温度（约15分钟）。如有可能，应连接冷冻转移透射电镜样品杆的控制器，以在转移过程中监测温度。需要注意的是，透射电镜样品杆的尖端（温度传感器所在位置）会与冷冻转移站接触，因此其冷却速度远快于样品杆其余部分。因此建议事先测量整个冷冻转移透射电镜样品杆完全冷却所需的时间，并确保系统至少热平衡该时长。
   4. 用液氮填充一个低温杯，并将透射电镜样品夹紧工具、螺丝刀和镊子浸入其中，使其尖端冷却至所需温度。所有工具的另一端应做好隔热处理，以防操作人员手部发生冻伤。
2. 将VTD与外侧气闸对齐。将冷台升至转移高度（16 mm*）。关闭高压。
3. 1. 打开VTD密封盖、外侧气闸和内侧气闸。
   2. 使用VTD推杆插入扫描电镜转移杆，通过推入并顺时针旋转将其锁定。
   3. 将扫描电镜转移杆缩回至冷冻制样室中。
   4. 使用冷刀关闭透射电镜载网的保护盖。此步骤对于减少转移过程中可能的冰污染至关重要。
   5. 使用VTD推杆将样品移入VTD的真空腔室中。
   6. 关闭气闸并密封。
4. 对外侧气闸进行放气并拆下VTD。将VTD连接至冷冻转移站的扫描电镜接口。在持续通入干燥氮气的同时，使用站上的销钉打开VTD的密封，并将扫描电镜转移杆滑入冷冻转移站的杜瓦瓶中。
5. 1. 加入足够的液氮，使冷冻转移站中的液面高度刚好浸没样品。
   2. 使用预先冷却的螺丝刀打开其中一个保护盖，并松开固定透射电镜载网的对应螺丝 。
   3. 使用预先冷却的镊子夹取透射电镜载网，并将其放入透射电镜样品杆中。
   4. 使用冷却的六角环将透射电镜载网固定在透射电镜样品杆上。
   5. 关闭冷冻转移透射电镜样品杆的快门。样品转移步骤至关重要，可能因氮气导致视野模糊而影响对微小透射电镜样品的观察。
   6. 将冷冻转移站从抽气系统断开，并连同冷冻转移透射电镜样品杆的加热控制器一起移至透射电镜附近。
   7. 启动透射电镜的涡轮分子泵，对通往透射电镜气闸的背压管线进行抽气。
   8. 将透射电镜样品台设置为-70°的倾转角*。
   9. 设置气闸最短抽气时间（30–60秒），仅进行一次干燥氮气吹扫循环。
6. 确保冷冻转移透射电镜样品杆上的保护快门处于关闭状态。从冷冻转移站中取出样品杆，并将其插入已倾斜的测角仪中（液氮会从透射电镜样品杆的杜瓦瓶中溢出）。抽气循环将自动开始。循环完成后，将测角仪恢复至0°倾转，同时用手扶住透射电镜样品杆，防止其随测角仪旋转。将样品杆完全插入透射电镜中。在此步骤中，冷冻转移透射电镜样品杆应连接其加热控制器以监测温度。将样品杆插入透射电镜的具体操作可能因不同型号的透射电镜而异，因此建议联系设备制造商获取相应的标准操作流程。
7. 重新为冷冻转移透射电镜样品杆的杜瓦瓶补充液氮。等待透射电镜内部真空度达到可接受水平。

结果

本研究中使用了以下设备：配备纳米操纵器和冷冻制样室的双束聚焦离子束/扫描电子显微镜（FIB/SEM）；配备冷冻转移杆的透射电子显微镜（TEM）；以及一台原型冷冻转移站。冷冻制样室的防污染器（AC）叶片和纳米操纵器（NM）尖端由Gatan公司进行了改装。与标准冷冻制样室相比，AC叶片尺寸更大，可为NM尖端提供更强的散热能力。此外，AC上安装有夹具，用于连接铜编织带，以实现与NM尖端之间的热交换。FIB/SEM的气动系统也经过改造，使得即使在样品室通入空气的情况下，NM仍可插入并保持在位。需要注意的是，本研究所采用的参数最适合上述所列设备；若使用其他类型的设备，这些参数可能需要相应调整。在执行本方案时，应遵循处理低温物质、液氮及真空系统的常规安全操作规范。

该方法已在多种类型的样品上进行了测试，均取得了良好效果，样品范围涵盖含有纳米颗粒的溶液或聚合物基质，以及单细胞生物和线虫。文中以经四氧化锇和高锰酸钾染色的A. niger孢子为例，通过图1-12展示了该操作流程的各个步骤。首先通过扫描电镜（SEM）对孢子成像（图1），以确定提取位置。在本例中，任意孢子的横截面即可满足要求，但也可将感兴趣区域（ROI）的提取位置精确至亚微米级别，例如在距细胞膜特定距离处切割特定细胞。确定目标结构后，首先进行冷冻铂沉积（图2），以保护样品免受离子束铣削过程中的电子束损伤。随后将样品倾斜至52°，开始进行铣削的初步步骤（图3）：在薄片两侧溅射出两条沟槽。然后将样品转回原位并进一步铣削，仅保留两个微小的连接桥与主体材料相连（图4）。将冷却的纳米操纵器与薄片接触（图5），再通过一次冷冻铂沉积将其牢固焊接（图6）。随后铣除两个微小连接桥，纳米操纵器将薄片移至透射电镜（TEM）载网的附着区域（图7），并通过最终的冷冻铂沉积完成固定（图8）。之后将纳米操纵器与薄片分离（图9），再利用离子束将薄片减薄至电子束可穿透的厚度（图10和11）。最后将薄片转移至透射电镜中（图12），即可进行高分辨率成像、光谱分析、断层扫描及其他相关技术检测。

图1. A. niger 孢子在铂沉积前的冷冻扫描电镜图像。

图 2. 图 1 中相同区域在铂沉积后但固化前的形貌。

图3．同一区域（见图2）在铂沉积和固化后的倾斜52º冷冻扫描电镜（Cryo-SEM）图像，正在进行沟槽铣削（见步骤3.7）。

图4．准备进行提取的薄片。

图5．冷纳米操纵探针尖端与薄片接触。

图6。第二次铂低温沉积用于将纳米操纵器与薄片焊接在一起。

图7。使用冷纳米操纵器将薄片转移至透射电子显微镜（TEM）载网的附着区域。

图8。再次使用冷冻沉积法将薄片附着于透射电子显微镜（TEM）载网上。

图9。该薄片已从纳米操纵器上切割分离，现可进行储存或进一步减薄至电子束可穿透的厚度。

图10．薄化过程中的一个中间步骤，横切面中可见少量孢子。

图11．样品最终减薄后的冷冻扫描电镜图像；由于薄片已开始卷曲，大部分其他孢子已被研磨去除。

图12．薄层的复合冷冻透射电子显微镜图像。薄层中包含部分铝制样品台（黑色箭头）。

讨论

该方案是对室温下材料科学中常用的FIB/TEM样品制备方法在低温条件下的一个相对直接的适应性改进。该方法制备的TEM样品无机械变形和刀痕（这是超薄切片技术的主要缺陷），但如果样品表面不均匀，仍可能出现帘状效应。可通过低温沉积一层覆盖层（本研究中使用的是Pt）并使其固化至表面平整无特征来减轻此现象¹³。对于硬度差异极大的组分，该方法同样可实现样品制备，且无需担心在制备过程中因应力导致断裂。内部应力仍可能导致薄片发生弯曲或卷曲，此时需减小切片区的尺寸。与其它方法相比，其缺点在于离子束辐照可能改变生物结构，并可能导致离子植入样品中。这些缺点在材料科学的室温样品制备中同样存在¹⁵。通过在最低离子加速电压（500–1,000 V）下完成最终的抛光步骤，可减轻上述影响。这一极为温和的抛光步骤可去除薄片表面的损伤层。

由于冷冻沉积的特性（步骤 3.5、3.10 和 3.13），样品的大部分区域将被覆盖，从而阻碍对原始表面的观察。这可能导致难以追踪目标区域（ROI），除非按照步骤 3.3 的建议使用多个标记。

在步骤4.5和4.7中，薄层样品有接触空气的风险。必须避免这种情况，否则空气中的水分会在样品表面形成冰晶，可能严重遮蔽关键结构特征。这些操作应尽快完成，但同时在转移过程中操作不当又可能导致样品丢失。建议用户在对真实样品进行操作前，先使用空的透射电镜载网反复练习这些步骤。

在材料科学领域，聚焦离子束（FIB）仪器在其商业化后的十年内已成为透射电子显微镜（TEM）样品制备的主要方法。由于该技术几乎可用于任何类型的样品，因此无需针对不同样品类型调整制备方法。我们坚信，得益于本文详述的操作流程，同样的发展也将在低温条件下实现。尽管较大样品的应用仍受限于将其以玻璃化状态进行低温保存的能力，但浸入式冷冻或高压冷冻^3,5等技术可能为解决这一问题提供最佳方案。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Strata DB 235	FEI		FIB/SEM
Omniprobe 100	Oxford Instruments		纳米操纵器
Alto 2500	Gatan		冷冻制样室
Cryo-holder model 626	Gatan		冷冻转移透射电镜样品杆
Tecnai F30	FEI		透射电镜（TEM）