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方法文章

体外 观察前列腺癌患者来源的循环肿瘤细胞与人血管内皮细胞之间E-选择素介导相互作用的方法

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DOI：

10.3791/51468

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2014年5月15日

 ,  , 
1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 2Department of Urology, Weill Cornell Medical College

本文内容

摘要

本报告描述了一种在生理流动条件下可视化和分析前列腺癌中循环肿瘤细胞/内皮细胞相互作用的独特方法。

摘要

转移是指肿瘤细胞从原发性肿瘤脱落并侵入血管和淋巴系统，从而得以迁移至其他部位并形成继发性病灶。 可通过使用来自不同细胞系的内皮细胞（ECs）和肿瘤细胞来研究肿瘤细胞从血管系统中穿出的过程。 早期研究是在静态条件下进行的，但已有充分文献表明，内皮细胞在生理流动条件下的行为与静态条件下显著不同。 因此，目前正采用多种流动腔装置来研究癌细胞与内皮细胞之间的相互作用。 现有的流动腔装置在使用不同细胞系或在不同剪切应力条件下的流体环境中均能提供可重复的实验结果。 然而，为了观察和研究稀有细胞（如循环肿瘤细胞，CTCs）的相互作用，必须对传统的流动腔装置进行特定改进。 CTCs是在数百万血细胞中极为稀少的一类细胞群体，因此很难获得纯度较高的CTCs群体。 目前的富集或去除技术不可避免地会导致CTCs被循环系统中其他类型的细胞所污染。 在本报告中，我们描述了一种独特的方法，可对循环前列腺癌细胞进行荧光标记，并在自行组装的流动腔系统中研究其与内皮细胞的相互作用。 该技术可进一步应用于观察前列腺CTCs与任何目标蛋白之间的相互作用。

引言

转移是一个复杂的多步骤过程，目前仍缺乏充分理解。 E-选择素/选择素配体轴通过促进血管内皮细胞与癌细胞之间的初始黏附相互作用，在肿瘤转移中发挥重要作用1,2. 内皮（E）-选择素是一种由活化的内皮细胞表达的跨膜蛋白，而不同的E-选择素配体则由肿瘤细胞表达3. 众多 体外 已成功采用多种方法来模拟肿瘤细胞与内皮细胞（ECs）之间E-选择素/选择素配体的相互作用1. 为了研究这些相互作用，目前正在采用不同的流动腔室系统来模拟血液循环系统。 在流动室装置中，平行板流动室（PPFC）常与内皮细胞（ECs）联合使用 体外 模拟模型 体内 剪切应力条件。 在此方法中，内皮细胞在35 mm培养皿上培养，待形成单层后，将内皮细胞连接至平行板流动小室（PPFC），并进行基于剪切应力的实验。 

然而，PPFC 及其他现有系统在研究源自患者的循环肿瘤细胞（CTCs）与内皮细胞（ECs）之间的黏附相互作用时存在诸多局限性，主要原因是 CTCs 是一类稀有细胞群体，它们从原发肿瘤脱落，混杂在数以百万计的血细胞中循环（每 109 个血细胞中仅有 1 个 CTC）4。因此，与可无限供应的培养细胞系不同，CTCs 数量稀少，导致 CTC 与 EC 之间的相互作用极为罕见且发生频率极低，这就需要采用合适的流道宽度，以便记录这些相互作用并进行回放分析。 此外，由于源自患者的 CTCs 并非纯细胞群体，因此需要特异性识别标志物来准确追踪 CTCs。 为解决这一问题，我们开发了一种新方法，通过利用几乎所有的前列腺癌（PCa）CTCs 均在其细胞表面表达前列腺特异性膜抗原（PSMA）这一特性，实现对 PCa CTCs 的识别5,6。 在本报告中，我们使用前列腺癌细胞系 MDA PCa2b（MDA）来展示该新系统在研究前列腺癌 CTCs 与 ECs 相互作用方面的潜在应用价值，最终旨在阐明转移的机制。

我们的方法可应用于多种基于剪切力的实验，以模拟体内血管系统7-9。 除了研究前列腺癌循环肿瘤细胞与内皮细胞（PCa CTC/EC）的相互作用外，当前的流动腔室系统还可轻松改造用于分析外周血单个核细胞或肿瘤细胞与内皮细胞的相互作用。 该流动腔室（即 microslide III (0.1)，下文简称 microslide）易于拆卸和重新组装，可在灌注条件下培养内皮细胞，并通过不同细胞因子刺激内皮细胞以诱导蛋白表达。 此外，也可将培养的内皮细胞或重组蛋白（如 E-选择素和 P-选择素）包被于 microslide 表面，并在层流条件下观察其与肿瘤细胞的相互作用10。

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方案

1. 在微载玻片上培养人脐静脉内皮细胞以观察循环肿瘤细胞与内皮细胞的相互作用

  1. 在组织培养罩内，先用 PBS 冲洗微滑片（通道宽度为 1 mm）。使用 1 ml 鲁尔锁式注射器，将 200 µl 浓度为 50 µg/ml 的纤连蛋白（溶于 PBS）轻柔地包被在微滑片上。
  2. 盖上微滑片的盖子，并在组织培养罩内静置 30 分钟。缓慢向微滑片中加样可防止通道内产生气泡。
  3. 将 200 µl 预热（37 °C）的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）生长培养基（M199 培养基，1 M HEPES，20% 胎牛血清，5 mg/ml 肝素，100 µg/ml 内皮细胞生长因子和 L-谷氨酰胺）灌注过微滑片，并在室温下孵育 20 分钟。在灌注过程中，准备 HUVEC 细胞悬液。
  4. 用 PBS 冲洗 HUVEC 细胞，加入 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，在室温下作用 1–2 分钟。将 HUVEC 细胞在 2 ml 生长培养基中以 180 × g 离心 5 分钟。
  5. 使用纽鲍尔血细胞计数板测定细胞浓度，并配制 107 个 HUVEC 细胞/100 µl 生长培养基。然后，使用 200 µl 移液器吸头小心地从微滑片的入口端移除培养基。
  6. 将微滑片置于与眼睛齐平的位置，使用 1 ml 鲁尔锁式注射器，将 200 µl 已配制好的 HUVEC 细胞悬液轻柔地灌注进入通道。此步骤需格外小心，以避免产生气泡。若出现气泡，应继续灌注稍长时间，直至气泡进入出口通道。
  7. 在微滑片的入口和出口端分别加入等量（约 80 µl）的 HUVEC 培养基。此举可防止细胞向任一方向流动。
  8. 盖上盖子，将微滑片置于培养箱（37 °C）中孵育 1.5 小时。

2. 在微载片上进行过夜人脐静脉内皮细胞培养的流室组件制备

  1. 将无菌的 20 ml 注射器、雌性和雄性鲁尔接头、管路以及注射泵放入培养箱中预热 15 分钟。
  2. 为尽量减少死体积，请使用内径为 0.04 英寸的管路。较小的管路直径有助于防止气泡形成。
  3. 用温热（37 °C）的 HUVEC 培养基（12 ml）填充 20 ml 注射器。将带有接头的管路连接到注射器上，去除气泡，并将该组件连接至微流通道板。
  4. 用 HUVEC 培养基完全充满微流通道板的进样口。将已装满的、连接有接头的 20 ml 注射器移至微流通道板旁，轻轻将接头与微流通道板连接。
  5. 将装置移入培养箱，并连接至注射泵，设置 剪切速率为 10 µl/min。将细胞在 37 °C 培养箱中孵育过夜。
  6. 次日，通过拆下连接在微流通道板进样口的接头，拆解装置。
  7. 为上调内皮细胞上 E-选择素的表达，配制新鲜的含 IL-1β（10 ng/ml）的生长培养基 4 ml。用 10 ml 注射器吸出原有培养基，从微流通道板进样口移除旧培养基，并将装有新培养基的注射器连接至芯片。
  8. 在培养箱中将注射泵设置 剪切速率为 10 µl/min，持续 4 小时。

3. 抗PSMA（J591-488）标记的前列腺癌细胞的制备

  1. 在HUVECs细胞与IL-1β孵育期间，准备抗PSMA J591-alexa488标记的PCa细胞。向MDA细胞中加入0.05%胰蛋白酶-EDTA，作用1分钟。切勿使细胞暴露于胰蛋白酶过长时间，以免影响细胞表面存在的糖肽。也可使用无酶细胞解离试剂替代胰蛋白酶。以200 × g离心5分钟。
  2. 将MDA细胞沉淀重悬于1 ml H/H缓冲液（Hanks平衡盐溶液/0.1% HSA/10 mM HEPES/1 mM CaCl2）中。在避光条件下，室温加入抗PSMA J591-alexa488抗体 ，终浓度为20 µg/ml，孵育30分钟。孵育过程中需重悬细胞。
  3. 30分钟后，将细胞悬液 以800 × g离心5分钟。吸除上清，将沉淀重悬于1 ml H/H缓冲液中。计数标记后的MDA细胞，并调整终浓度至1×106 个细胞/ml。用J591-488标记的MDA细胞悬液填充5 ml注射器，并排除气泡。

4. 来自前列腺癌患者富集的抗PSMA（J591-488）标记循环肿瘤细胞的制备

  1. 用蓝帽试管（含柠檬酸钠）从前列腺癌患者体内采集 7.5 ml 血液。用 0.1% BSA/1 mM EDTA/PBS 将血液轻柔地按 1:1 比例稀释。
  2. 在 50 ml 圆底离心管中加入 5.3 ml Ficoll-paque Plus。将稀释后的血液小心地铺在 Ficoll-paque 上层。以 400 × g 离心 30 分钟。
  3. 将所有与循环肿瘤细胞（CTC）接触的试管或枪头预先用 2% FBS/RPMI-1640/1 mM CaCl2/4 mM MgCl2（R/S 缓冲液）包被，以防止 CTC 非特异性结合到器皿表面。所有与 CTC 接触的培养基和缓冲液均需保持 4 °C。
  4. 从分层界面收集含有 CTC 的外周血单个核细胞（PBMCs）组分至另一含有 30 ml R/S 缓冲液的 50 ml 圆底离心管中。以 400 × g 离心 8 分钟。
  5. 重悬细胞沉淀，并用 R/S 缓冲液在 400 × g 下再次洗涤 8 分钟。离心后，将沉淀重悬于 H/H 缓冲液中。加入抗 PSMA J591-488 抗体 至终浓度 20 µg/ml，在室温避光条件下孵育 30 分钟。
  6. 孵育 30 分钟后，将含有 J591-488 标记 CTC 的 PBMCs 以 800 × g 离心 5 分钟。重悬于 H/H 缓冲液中。用 R/S 缓冲液预处理过的 1 ml 注射器吸取样品。

5. 显微镜、注射泵和流动腔装置的准备

  1. 打开倒置显微镜，将10倍物镜下的科勒照明调节至最佳状态。将注射泵调整至与显微镜样品台同一水平位置，并设置为1 dyn/cm2的剪切应力（约10 µl/min）。
  2. 启动蔡司Axiovision软件。在计算机屏幕上选择所用物镜。在软件的工具选项下创建一个新文件夹。
  3. 在Axiovision中打开智能实验功能，并设置参数以每30秒录制一段短视频，持续记录30分钟。
  4. 进行活细胞荧光视频拍摄时，设置图像参数为：12毫秒曝光时间、2×2 binning、增益值5。这些参数有助于使用蔡司mRm相机获得接近视频帧率（约每秒23帧）的影像。
  5. 为在计算机屏幕上以10倍物镜完整显示流动通道的全宽，需使用C型接口适配器（0.63倍f/60 mm接口）。
  6. 打开汞灯电源。
  7. 将装有细胞的注射器及连接管固定到注射泵上。
  8. 从培养箱中取出经IL-1β刺激的HUVECs细胞。将连接管与含有HUVECs的微流通道进口端连接。
  9. 将出口通道通过连接管与导管相连，并将导管末端放入培养皿或15 ml锥形管中，用于收集流出液。
  10. 以10 µl/min的流速开始向微流通道 内灌注。在落射荧光显微镜的488 nm滤光片下观察内皮细胞与标记的MDA细胞或患者来源的标记循环肿瘤细胞（CTCs）之间的相互作用。
  11. 开始以30秒为一段录制实验视频。在回放分析过程中测量细胞滚动速度。滚动速度通过将细胞移动的距离除以所需时间来计算。

6. 微载玻片的免疫染色

  1. 在MDA细胞灌注于IL-1β刺激的HUVECs上10分钟后，移除微流通道芯片（microslide）的入口和出口中的培养基。
  2. 使用200 µl枪头，将含有钙和镁的预热（37 °C）PBS加入微流通道芯片的入口，持续5分钟。将芯片盖子作为支撑物倾斜放置于实验台面上。在免疫染色过程中的所有孵育步骤均需保持芯片处于倾斜位置。
  3. 通过向入口灌注预热的2%甲醛固定HUVECs。
  4. 室温孵育20分钟，用PBS冲洗两次，每次5分钟。
  5. 在含5% BSA的PBS中加入0.1% Triton-X 100，室温孵育10分钟。
  6. 用PBS冲洗两次，每次5分钟。用含5% BSA的PBS封闭30分钟。
  7. 加入以2.5% BSA稀释的初级抗体山羊抗VE-钙黏蛋白（VE-Cadherin，1:100），4 °C过夜孵育。
  8. 次日，用PBS洗涤两次，每次5分钟。加入驴抗山羊647二抗，孵育45分钟，再用PBS洗涤两次，每次5分钟。
  9. 室温下加入人源化J591-alexa488偶联抗体，孵育1小时。
  10. 用PBS洗涤两次，每次5分钟。加入DAPI染色5分钟，再用蒸馏水洗涤5分钟。
  11. 加入PBS（或用于长期保存的Mowiol封片剂）。在共聚焦显微镜下观察微流通道芯片。

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结果

图1 显示了微载玻片上内皮细胞（ECs）单层的过夜培养结果。图1A 中的比例尺表明，使用5X物镜可观察到微载玻片100%的区域，而使用10X物镜则可观察到70%的区域（图1B）。在分析E-选择素介导的相互作用时，边缘滚动的细胞不被计入，因此可用于录像记录和回放分析的有效区域超过微载玻片的70%。根据我们的经验，最初需要一定练习才能在此装置中成功培养出在剪切应力下生长的EC单层。在建立EC在微载玻片上的生长后，我们对MDA前列腺癌细胞进行了标记。通过将MDA细胞加入健康供体血液中，并用荧光标记的抗PSMA单克隆抗体J591-488进行染色，验证了该抗体的特异性。在外周血单个核细胞（PBMCs）中未观察到PSMA免疫染色信号（数据未显示）。为排除J591-488抗体结合与内化可能改变细胞滚动行为的可能性，我们用J591-488标记MDA细胞，并在1–10 dyn/cm2 的剪切应力范围内，将其滚动行为与未标记的MDA细胞进行比较。箱形图显示了在IL-1β刺激的ECs上，未标记与J591-488标记的MDA细胞在不同剪切...

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讨论

由于循环肿瘤细胞（CTCs）在血细胞中数量极少，因此很难将其分离为纯细胞群体。 为了研究CTC与内皮细胞（EC）之间的相互作用，这种稀少且不纯的CTC群体带来了两个主要挑战：a）在血细胞中识别CTCs；b）观察CTC与EC之间的相互作用。

为了克服在血细胞中识别前列腺循环肿瘤细胞（CTC）的第一个局限性，我们利用了几乎所有的前列腺肿瘤细胞均表达PSMA6这一特性。 单克隆抗体J591-488在与细胞表面结合后可被内化，表明前列腺癌（PCa）CTC可在体外（ex vivo）进行标记，并用于研究CTC与内皮细胞（EC）之间的相互作用13。 为了实现抗体的最佳内化和最大免疫荧光信号，我们将MDA细胞分别在4 °C或37 °C条件下，与抗体孵育30分钟或1小时。 我们发现，在37 °C孵育30分钟时免疫荧光信号最强（数据未显示），且前列腺细胞的免疫荧光标记并不影响其滚动行为，与未标记的前列腺细胞相比无差异。

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披露

Bander 博士是康奈尔研究基金会（"CRF"）名下与本文所用 J591 抗体相关专利的发明人。 Bander 博士担任 BZL Biologics 公司的顾问，并持有该公司股票，CRF 已将上述专利授权该公司用于进一步的研究与开发。

致谢

本工作获得了美国国防部前列腺癌研究计划（W81XWH-12-1-0124）、美国国家癌症研究所U54CA143876项目以及Robert McCooey泌尿生殖系统肿瘤研究基金的资助。我们感谢病理学系Annarita Lorenzo博士提供VE-钙黏蛋白抗体，以及外科系Marco Seandel博士提供人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
显微载玻片Ibidi80331
纤连蛋白MilliporeFC010
塑料管Cole ParmerEW-96115-08
雄性鲁尔接头GlycoTech31-001
雌性鲁尔接头GlycoTech31-001
注射泵Chemyx IncFusion 100
鲁尔锁注射器BD Biosciences309628
M199 培养基SigmaM7653
内皮细胞有丝分裂原Biomedical TechnologiesBT-203
HBSSSigmaH9269
抗PSMA J591-488Weill Cornell Medical College-泌尿肿瘤学实验室
白细胞介素-1βPeprotech200-01B
胰蛋白酶MilliporeSM-2002-C
肝素SigmaH-3149
HUVECsWeill Cornell Medical College-外科系由 Marco Seandel 提供
VE-钙黏蛋白Santa Cruzsc-5648
10倍物镜Zeiss Plan Neofluar
无酶细胞解离试剂MilliporeS-004-C
RPMI-1640Lonza12-702-F
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-02

参考文献

  1. Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
  2. Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer. Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).
  3. Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
  4. Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  5. Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis. Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).
  6. Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. , (2013).
  7. Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).
  8. Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers. Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).
  9. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J Vis Exp. 24, (2009).
  10. Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp--/rag2-- mice. Gut. 62 (5), 741-750 (2013).
  11. Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).
  12. Remuzzi, A., Giavazzi, R. Adhesion of tumor cells under flow. Adhesion Protein Protocols. Dejana, E., Corada, M. 96, Humana Press. 153-157 (1999).
  13. Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).
  14. Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development. Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).
  15. Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion. Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).
  16. Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).

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