生物膜的微阵列用刮墨刀型组合方式形成

Summary

支持的脂质双层和天然膜颗粒是方便的系统，可以近似细胞膜的性质和在各种分析战略中。这里，我们证明了制备微阵列支持的脂质双层包被的SiO ₂的有孔玻璃珠，磷脂囊泡或天然膜颗粒组成的方法。

Abstract

脂质双层膜形成细胞的质膜和限定亚细胞器的边界。在自然界中，这些膜有许多种脂质的多相混合物，含有膜结合蛋白，并装饰有碳水化合物。在一些实验中，最好是去耦从这些天然细胞膜的脂质双层的生物物理或生物化学特性。这种情况下要求使用的模型系统如巨泡，脂质体或支撑脂质双层（SLBs中）。 SLBs中的阵列是用于感测应用和模仿细胞 - 细胞相互作用特别有吸引力的。在这里，我们描述了形成SLB阵列的新方法。亚微米直径的SiO ₂小珠首先用脂质双层，以形成球形的SLBs（SSLBs）。然后使小球沉积到微制造亚微米直径的微孔阵列。制备工艺采用了"刮刀"，以清洁衬底表面，而要走背后的落户为微孔SSLBs克。这种方法需要的微孔基质的无化学修饰，也没有对SSLB任何特定的靶向配体。微孔是由单个珠子占据，因为井径调到只是比珠直径。典型地，孔的75％以上都被占用，而其余的保持为空。在缓冲SSLB阵列显示大于一个星期的长期稳定性。多种类型SSLBs可以放置在一个单独的阵列通过串行沉积和阵列可以用于检测，这表明我们通过表征霍乱毒素与神经节苷脂的相互作用。我们还表明，磷脂泡囊，而不珠载体和生物膜从蜂窝源可以排列具有相同的方法和细胞特异性膜脂质可以被识别。

Introduction

脂双层膜的性质是基本的结构。细胞质膜和细胞器的膜构成的，即包括许多分子，是生命所必需的脂质双层中。许多维持生命过程发生的细胞的表面上，或通过与脂质双层膜相关分子介导的。事实上，许多药品目标进程或分子被发现，或在膜^1,2。因此，有必要对解析调查过程，如在膜表面发生的化学反应或非共价结合事件。因为天然的膜可能难以分离和/或接口的传感器，许多研究人员采用简化模型膜，进行分析研究。一些模型膜系统在文献中有描述，从巨囊，可以是几十到几百微米的直径，以脂质体具有纳米级尺寸的^3,4。 ALTERNatively，沉积在固体载体上的平面脂双层， 即 ，支持的脂质双层（SLBs中），可以形成多种不同的表面和已被广泛应用于生物物理，生物化学，和分析应用程序^5。耦合SLBs的电气或光学材料通过使用不同的分析技术使膜生物化学和生物物理学研究。荧光显微镜^6，7电化学，光学光谱^8，扫描探针显微镜^9，表面等离子体共振^10，和质谱¹¹都被用来研究的SLBs的结构和性能。

SLB阵列提供额外的多功能性传感器的多重检测^12,13的设计。其他应用程序使用SLB阵列来模拟免疫细胞¹⁴之间形成的交界处。为SLB阵列的制备方法从microflu变化IDIC接近¹⁵到那些采用SLB相邻斑块之间的物理障碍^。16其他团体使用的印刷方法^17，光化学图案¹⁸以及各种纳米工程学接近¹⁹创建SLB阵列。

在本文中和所附的视频为大家演示了SLB-涂SiO ₂的珠子存入微孔²⁰的有序排列形成阵列负载均衡的方法。我们指的是SLB-涂上_二氧化硅珠为球形支持的脂质双层（SSLBs）。这种技术是创建从天然来源^21，从中我们也显示例子的结果得出磷脂囊泡和生物膜的数组早期工作的延伸。其他方法排列生物膜颗粒或小泡都依赖于特定的靶向配体的模式上，与包含在囊泡表面的互补关联的配体表面。例子包括生物素 -抗生物素蛋白关联^22,23和DNA杂交方案^24。我们的方法只需要一个微孔阵列，没有必要定位或识别部分。 SSLBs的大小是由SiO ₂的珠载体，它具有低的聚分散度的直径限定。通过调节微孔的直径只比SSLB直径大，只有一个单一的SSLB稳定于各微孔。聚（二甲基硅氧烷）（PDMS）刮刀然后从表面移除，但在固定微孔所有SSLBs。微孔和所得SSLB阵列具有高密度（〜10 ⁵ SSLBs ^个 / mm ^2）与3微米的中心到中心的间距和六边形周期性。通过串联使用不同脂质组合物沉积SSLBs，它可以创建多组阵列与随机定位SSLBs。以证明SSLB阵列的感测能力，我们使用了一个并入SSLBs神经节苷脂（GM1）霍乱毒素（CTX）的相互作用。同天然膜颗粒，我们能够检测细胞特异性脂质中含有的膜材料从两个不同的细胞类型的多组分阵列。

Protocol

1，微细加工的微孔阵列基板

1. 从一个4英寸的硅晶片上热生长氧化物为100nm。
2. 旋SPR-955 0.7光刻胶的晶片上以4000rpm进行30秒。
3. 烘烤的加热板上，在115℃下进行90秒。
4. 曝光光刻胶。
   1. 使用会产生1微米的孔排列成六边形阵列具有3微米的周期，其中该阵列包括有2毫米×2毫米区域的掩模。
   2. 使用6毫米的步长和200毫焦耳/厘米²的曝光在一个i-线步进曝光晶片。
5. 烘烤的加热板上，在115℃下进行90秒。
6. 开发利用旋开发商沉积在晶圆上2水坑的CD-26的90秒的总开发时间。
7. 用超纯水去离子水和干与N ₂彻底冲洗。
8. 在反应性离子蚀刻机蚀刻氧化物为6分钟，使用50 sccm的氩，CF ₄ 25 sccm的，和50sccm的CHF的₃ FLO机翼在75毫托的压力。
9. 在ICP深沟槽反应性离子蚀刻机2分钟，以63 sccm的或C _{4 F 8，27} sccm的SF ₆气体，40sccm的氩气和10标准立方厘米的为14毫托的压力下O ₂的流动蚀刻硅。
10. 漂洗在丙酮，甲醇和异丙醇，以除去抗蚀剂。
11. 这里的H ₂ SO ₄浴:H _{2 O 2} 1:1 10分钟来清洁表面。
12. 用超纯水去离子水和干与N ₂彻底冲洗。
13. 沉积的Al ₂ 1,080 A O ₃通过原子层沉积在250°C。

2，制备聚（二甲基硅氧烷）刮刀

1. 如果可能的话，工作在洁净室。在可能的最清洁的环境，否则工作。
2. 得到的塑料培养皿（或其它清洁的一次性容器）与≥13毫米两侧。
3. 在那道菜，倒出来5克PDMS固化剂，接着加入50克的PDMS浅ë剂（或用1:10的比例，将大部分填补了培养皿中的任何东西）。用一次性塑料吸管或棒调匀。
4. 通过将混合的PDMS中的腔与真空管线，施加真空，直至气泡出来的混合物（约30分钟）除去气泡。
5. 如果不是已经在培养皿，倒入PDMS在培养皿中，避免产生气泡。
6. 一夜之间治愈的电炉在> 50°C（用于更短的时间高热量也适用）。
7. 随着新/干净的刀片，小心地切一块长方形约2.5×2.5厘米，保持顶面尽可能的干净。剥出用干净的镊子。通过按下刀片中的一个运动，以使上边缘尽可能尖锐（这将是在所述刮墨刀的过程中使用的边缘）修剪过的一个边缘（下降到1.5厘米）。
8. 干净，用丙酮，甲醇，异丙醇，和超纯去离子水，然后吹干用干净的氮气。存放在一个干净的培养皿中。

囊泡3。准备

1. 收集的25毫克/毫升的蛋磷脂酰胆碱（PC）的脂质储备溶液和1 mg / ml的1,2 -二棕榈酰-sn-甘油基-3 -磷酸乙醇胺-N - （丽丝胺罗丹明B磺酰基）铵盐（ρ-DPPE）的氯仿以及0.5毫克/毫升的库存单唾液酸神经节苷脂GM1的氯仿/甲醇溶液（2:1体积/体积）。
2. 在一个小的玻璃瓶中作出，结果在97％（摩尔）的PC，2％（摩尔）神经节苷脂GM1和1％（摩尔）的Rho-DPPE，加入18.9微升的25毫克/毫升的PC，39.6微升的0.5毫克/毫升GM1和7.9微升的混合物1毫克/毫升的Rho-DPPE使用玻璃注射器。
3. 注:为Nair 等人 ²⁵的补充材料包含一个极好的可定制的Excel电子表格计算脂质创建任何所需组成的囊泡所需的金额。
4. 放置小瓶在真空干燥器中，并除去溶剂，留下在真空下6小时的小瓶中。
5. 使0.1的水溶液M氯化钠。加入0.5毫升的0.1M NaCl溶液到含有干燥的脂质膜的小瓶。
6. 允许水性脂质混合物休息过夜。
7. 简要地涡旋混合，以创建一个小泡悬浮液中，然后超声处理20分钟，在浴中超声破碎仪在室温下。
8. 通过聚碳酸酯膜具有100nm的孔径挤出囊悬浮液。通过过滤器通过17倍的囊泡停牌。
9. 储存在玻璃小瓶中挤出的膜泡在4℃下

球面支持的脂质双层膜4。形成

1. 收集700纳米直径的SiO ₂的珠子。珠粒被提供在蒸馏水中以原料浓度为1.4×10 ¹¹珠/毫升。
2. 在1.5ml Eppendorf管中，加入107微升的珠子储备溶液以893微升0.1M的氯化钠制备1毫升珠粒悬浮液以1.5×10 ¹⁰珠/ ml的浓度。
3. VORTEX暂停，以确保它是很好英里固定的。
4. 离心该悬浮液在1700×g离心20分钟，然后弃上清。重悬珠在1ml的0.1M NaCl洗涤。重复此步骤两次彻底清洗珠。
5. 以形成SSLBs，在1.5ml的Eppendorf管中加入25微升的SiO ₂珠悬浮于200微升的1毫克/毫升的小泡悬浮液中。涡旋混合，静置1小时，在室温下进行。在这个阶段SSLB浓度应为1.7×10 ⁹ SSLBs /毫升。
6. 离心机在1700×g离心20分钟以沉淀SSLBs。粒料应出现粉红色由于对珠的Rho-DPPE囊泡的破裂。
7. 丢弃在225微升磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH值= 7.4的上清，重悬。重复步骤4.6-4.7两次从SSLB悬挂删除任何未破裂的小泡​​。

SSLB阵列5。大会

1. 导致矩形件4-6麦克风微孔阵列的顺劈片每件罗威尔阵列。
2. 旋涡混合SSLB暂停，然后将10微升SSLB悬挂的每个微孔阵列上。免得休息1小时，以允许SSLBs沉淀到表面上。
3. 用PBS轻轻从洗瓶清洗微孔阵列芯片上，然后浸入在浅盘制备的PBS浴。
4. 而淹没，轻轻将PDMS刮刀冲洗微孔阵列芯片上，并轻轻沿表面滑动5倍，除去未微孔中固定SSLBs。
5. 在PBS浴握微孔阵列芯片镊子，轻轻摇晃，以消除任何多余的SSLBs。
6. 从吸水扒浴快速去除芯片，并放置在一个新鲜的PBS浴备用。确保芯片的顶表面保持湿润以保留SSLBs。

注意:上述的组装方法，可用于创建天然膜颗粒的阵列，如髓鞘颗粒从小鼠脑，或坡分离spholipid无泡在SiO ₂珠的支持。详细维滕贝格等 ²¹这一工作描述和代表性的结果如下所示。

6。霍乱毒素结合分析

1. 准备一个2毫克/毫升的溶液的牛血清白蛋白（BSA）的PBS中。
2. 准备与Alexa 488缀合的霍乱毒素B亚单位的在PBS中的2毫克/毫升牛血清白蛋白的所需浓度的溶液。
3. 从PBS浴中取出SSLB阵列芯片和灯芯大多数的PBS溶液相差使用实验室擦拭。留在芯片上刚好够的PBS，以保持SSLB阵列的水分。
4. 为了防止非特异性结合，加入200μl的2毫克/毫升BSA溶液的SSLB阵列芯片。让我们休息1小时的加湿盒。
5. 用微量的SSLB阵列芯片的顶部取出200微升的解决方案。
6. 加入200μl的霍乱毒素解决SSLB阵列芯片，并让其余的1小时在加湿盒。
7. 用PBS轻轻从洗瓶清洗SSLB阵列芯片以除去任何未结合的霍乱毒素。
8. 威克用实验室走多余的PBS擦拭。前盖成像芯片装有24mm×40mm的盖玻片。
9. 使用过滤器一个堂堂正正的显微镜图像阵列设置适合感兴趣的荧光。
10. 分析使用ImageJ软件的自动颗粒分析函数数组中的各个SSLBs的荧光强度。
11. 编译个别SSLBs平均荧光强度成汇总SSLBs的一个给定的数组中找到的强度直方图。

Results

当SiO ₂的珠粒与囊泡磷脂，荧光脂质和其他脂类如神经节苷脂组成的溶液混合时，囊泡破裂，在SiO ₂胎圈表面上以形成SSLBs，如在图1a中示意性示出。洗涤SSLBs后，一滴SSLB溶液置于一个微孔阵列上，并且小珠静置至表面。 （ 图1B1）这也可以与磷脂小泡或天然膜颗粒，其显示在图1B2中的悬浮液进行。吸附到微孔阵列基板磷脂囊泡的荧光图像显示在图1B3。然后将PDMS刮刀制成轻轻滑过表面，以去除任何SSLBs（ 图1C1），水疱或天然膜颗粒（ 图1C2）未融入微孔。这将导致一个SSLB阵列，其中每微孔包含最多一个SSLB（ 图1D1）或数组，其中多个囊泡或天然膜颗粒在每个微孔（ 图1D2）。荧光标记的囊泡组成的微阵列的图像被显示在图1D3。

Discussion

在这项工作中，我们表明，单分散的SiO ₂珠粒涂有支持的脂质双层可排列成微孔阵列，而不需要在脂质双层或在基板表面的靶向配体，并且阵列可用于表征毒素-脂质相互作用。计算CTx/GM1结合的解离常数，我们绝不逊色，给定的值在文献悬殊，与先前的报告Winter 等 ，其中脂质包被的磁珠胶体组装用于计算的有关解离常数30纳米。由数据拟合的山，WAUD结合的模式，我们确定CTx/GM1互动是多价的可能，这与以前的报告^28。霍乱毒素的B（神经节苷脂结合）亚单位的存在是为五聚体，以每五个单元能够结合GM1分子^29;因此，这并不奇怪，不止一个亚基可以结合特定的差异GM1的SLBs的³⁰ usive流动性。

的化学官能化的珠子阵列已经用于其它分析研究^31。在这些类型的实验中，有孔玻璃珠，通常固定在在蚀刻的光纤的端部产生微孔。多重荧光测定法可通过将有孔玻璃珠的亚群，并同时将它们固定到光纤³²的端部进行在此配置。在我们的多重检测（ 图3C-...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 英寸硅片	大学晶圆	425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 光刻胶	MicroChem	SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 显影	MicroChem	CD-26
i-line 步进机	佳能	2500 i3 步进机
Vision 320 反应离子蚀刻机	Advanced Vacuum	Vision 320 RIE
深沟槽反应离子蚀刻机	等离子体 Therm	SLR-770
原子层沉积系统	剑桥纳米技术	Savannah
Dow Corning Sylgard 184 聚（二甲基硅氧烷）套件	Ellsworth 粘合剂	184 SIL ELAST 套件 0.5KG
蛋磷脂酰胆碱	Avanti 极性脂质	840051C
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（lissamine 罗丹明 B 磺酰基）铵盐	Avanti 极性脂质	810158C
单唾液神经节苷 GM1	Avanti 极性脂质	860065P
二氧化硅珠	Bangs Laboratories	SS03N/4666	磁珠容器上的包装上标明磁珠的直径为 900 nm。然而，经过光散射和电子显微镜检查，我们确定珠子的直径约为 700 nm。
霍乱毒素 B 亚基，Alexa 488 偶联物	Molecular Probes	C-34775
抗寡牙细胞抗体 IgM O4，NorthernLights 557 偶联物	R&D Systems	NL1326R
FM1-43	Molecular Probes	T-3136
Eppendorf MiniSpin 离心机	Fisher Scientific	05-401-09