用于量化基因表达各阶段病毒功能的痘苗病毒报告病毒

摘要

我们描述了一种荧光报告型痘苗病毒的使用方法，该病毒可通过光谱上可区分的报告荧光蛋白的时相特异性表达，实现对病毒感染性和基因表达的实时检测。我们详细介绍了一种基于孔板的方法，用于精确定位小分子抑制剂作用下病毒复制受干扰的具体阶段。

摘要

痘病毒是一类双链DNA病毒，包含多种对人类具有致病性的病毒，例如猴痘病毒、传染性软疣病毒和传染性脓疱病病毒。该病毒家族还包括天花病毒——天花病毒（Variola）。由于痘病毒复制过程复杂，目前对其基因表达策略仍有许多问题尚未阐明。本文介绍了重组痘苗病毒的设计与应用，该技术能够在高通量条件下实时检测病毒基因表达的单个或多个阶段。该方法利用光谱特性不同的荧光蛋白作为报告分子，分别标记病毒复制的三个阶段。这些病毒在保持各阶段特异性表达模式的同时，具有高信噪比，可用于基于孔板的检测以及对病毒传播和复制过程的显微观察。这些工具可用于抗病毒药物筛选、病毒与宿主相互作用研究以及进化生物学研究。

引言

传统上，病毒表达的研究采用分子生物学技术例如 Northern 印迹，Western 印迹，微阵列杂交 等等。) ¹尽管这些方法能够提供有关单个 mRNA 或蛋白质表达变化分类的详细信息，但通常难以适用于实时和高通量的检测流程。以往在痘病毒研究中已应用基于荧光报告分子的替代方法；然而，这些方法的开发和使用基于不同的研究目的。其中一些方法旨在筛选重组病毒 ^2,3这些技术在重组痘苗病毒克隆中外源DNA正确整合并表达时，可表达EGFP。类似地，已有多种稳定表达可溶性EGFP或由天然痘苗病毒启动子驱动的GFP标记蛋白的痘苗病毒株被广泛使用。这些病毒株通常用于基于抗体的中和试验、化学抑制实验或抗病毒效果比较中，定量检测病毒的进入与复制情况。 ^4–6尽管这些病毒已被证明具有一定的应用价值，但由于其使用了单一且具有模糊性的早期/晚期病毒启动子，因而难以提供关于抑制作用位点的详细信息。此外，以往的方法还采用了信噪比较差的EGFP蛋白。

由于痘病毒复制的复杂性以及目前尚无可用的工具来检测病毒基因表达的实时变化，我们开发了一系列单阶段和多阶段报告病毒^7,8。如先前发表的研究所述，这些病毒在感染的早期、中期或晚期阶段，利用天然的痘苗病毒启动子表达一种、两种或三种光谱上可区分的荧光蛋白。这些病毒可用于荧光显微镜下监测病毒复制进程，同样也适用于基于微孔板和读板仪的高通量检测。这些病毒可直接替代野生型病毒使用，其生长动力学相似，并能达到相当的滴度⁷。在设计和构建这些病毒的过程中，我们精心选择了具有高信噪比、优异折叠效率的荧光蛋白（Venus、mCherry 和 TagBFP），以实现对表达变化的可靠定量和快速响应。此外，所选用的病毒启动子组合能够实现高保真、明确的阶段特异性表达，可分别反映早期（C11R 启动子）、中期（G8R 启动子）和晚期（F17R 启动子）基因表达的完整范围，避免了传统早期/晚期模糊启动子带来的不确定性。

这些病毒可作为研究痘苗病毒这一典型痘病毒生命周期的工具。尽管对痘苗病毒的研究已有很长历史，但关于宿主与病毒相互作用的许多方面仍不清楚。痘苗病毒结构复杂，可产生超过200种独特的蛋白质，其中许多具有免疫调节功能并可拮抗宿主防御机制。感染发生后，痘苗病毒立即启动早期mRNA转录。这一过程由RNA聚合酶及转录因子介导，这些因子在病毒颗粒组装期间即已加载至病毒基因组上，并处于暂停状态，直至后续感染时被激活。早期基因表达主要产生抑制宿主免疫系统的蛋白质（如mRNA脱帽酶、双链RNA结合蛋白、诱饵受体蛋白，以及凋亡、应激反应和Toll、IL、NF-κB信号通路的抑制因子）和参与基因组复制的蛋白。早期表达还包括产生介导中期基因表达所需的转录因子。中期基因表达则进一步产生晚期阶段所需的转录因子。这一级联式表达过程最终导致感染晚期结构蛋白和病毒酶类蛋白的合成，这些蛋白对于成熟痘苗病毒颗粒的完整组装至关重要。

我们构建的一系列荧光报告病毒有助于快速推进对痘病毒生物学特性的理解。在病毒学领域，最常用且耗时较长的方法之一是病毒生长实验。该方法通常包括感染细胞、实施一系列处理、通过裂解感染细胞收获病毒，并通过噬斑实验定量测定最终的病毒滴度。使用本文所述的报告病毒，可对病毒生长进行实时监测，并能方便地平行比较多种不同处理条件下的病毒增殖情况。我们预计这一系列试剂将广泛应用于各种实验方案中，以检测药物处理、RNA干扰敲低或宿主范围限制等因素对病毒基因表达的影响。

该方法还能实现比以往更大规模的高内涵分析，从而对特定目标阶段进行高通量抗病毒药物筛选。尽管已鉴定出多种用于对抗痘病毒感染的潜在治疗方法，但目前美国食品药品监督管理局（FDA）唯一批准的有效治疗药物仅为无环磷酰核苷类似物西多福韦（Cidofovir）以及痘苗病毒免疫球蛋白治疗^9,10。尽管天花已于1977年被根除¹¹，痘病毒仍对人类健康构成重大威胁¹²。由于停止对天花病毒进行广泛疫苗接种，人群对其他痘病毒的易感性随之增加¹³。例如，此前因接种疫苗而受到保护的中非地区，目前正面临猴痘病毒感染病例的激增¹⁴。此外，人们对天花病毒可能被蓄意释放所引发的潜在风险也高度关注。由于现有疗法极为有限，开发新型治疗方法已成为当务之急。这些报告病毒可用于快速、高通量地筛选小分子抑制剂，以抑制病毒复制的特定阶段。发现作用于目前尚未被抑制的病毒表达阶段的抑制剂，将有助于开发更具效力的联合疗法。

通过观察各个阶段基因表达的变化，可以深入了解痘苗病毒的细胞生物学特性。对感染的宿主细胞进行化学或遗传学操作所导致的病毒减毒，通常以病毒滴度降低来表示。然而，通过比较病毒表达级联反应各个阶段的变化，可以更全面地理解特定处理对病毒适应性的影响。这些数据已被证明与传统的病毒滴度结果具有良好的相关性，同时还能提供更为详细的机制信息以及高通量分析能力⁷。

方案

1. 铺板细胞

1. 将HeLa细胞从培养板上解离，并用生长培养基（DMEM，2 mM L-谷氨酰胺，10%胎牛血清）稀释至约2.0 × 10⁵ 个细胞/ml。取100 μl/孔加入黑色壁、透明平底的96孔板中（每孔20,000个细胞）。
2. 将细胞在37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育24小时，直至形成汇合单层。

2. 感染细胞

1. 稀释病毒并感染细胞。
   1. 解冻TrpV（三重病毒；早期Venus、中期mCherry、晚期TagBFP）和PLV（无启动子Venus）荧光病毒，并使用超声处理5分钟以分散病毒颗粒。或者，可将粗制病毒原液与含0.25 mg/ml胰蛋白酶的感染培养基按1:1比例混合，在37 °C孵育30分钟。
   2. 将粗制病毒原液用37 °C感染培养基（DMEM，2 mM L-谷氨酰胺，2% FBS）稀释。对于高MOI感染（10 PFU/细胞），将病毒原液稀释至1.0 × 10⁷ PFU/ml，假设为 5 x 10⁴ 每孔细胞数和接种体积为50 μl。每种处理需设置3个复孔用TrpV感染，另设3个复孔用PLV感染，以校正每种处理特有的背景荧光。
   3. 在感染培养基中加入50 μl/孔的稀释病毒进行感染，此时间点定义为感染后0小时（0 hpi）。
2. 将所需处理化合物稀释至感染培养基中。所有处理均应配制一份2倍浓度的母液混合物，并将其加入至重复孔中。例如 总体积350 μl，用于六块96孔板，每孔50 μl。
   1. 将实验化合物稀释至感染培养基中。
   2. 稀释用溶剂对照例如 PBS、DMSO）加入感染培养基中。注意：溶剂对照组的终浓度应与实验化合物所用的浓度相同（例如 如果您的IBT储备液是用DMSO配制的，并以1 μl/ml的终浓度使用，则应使用1 μl/ml的DMSO作为溶剂对照。
   3. 将对照化合物稀释至感染培养基中。推荐的对照化合物包括：3.6 μM（1 μg/ml）1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶（AraC）、50 μM（11.7 μg/ml）异靛素β-硫代半卡巴腙（IBT）、60 μM（50 μg/ml）利福平（Rifampicin）或5 μM（1.9 μg/ml）ST-246。 ^8,15,16参见代表性结果部分以了解预期效果。注意：配制该稀释液时浓度应为所需最终浓度的两倍（2×），因其将与孔中现有体积以1:1比例混合。
3. 病毒加入后立即加入50 μl含有所需处理因素和对照的感染培养基，该培养基按步骤2.2稀释制备。注意：若需检测早期表达前的抑制作用，可将化合物直接加入稀释后的病毒接种物（步骤2.1.2）中，或在感染前（步骤2.1.3之前）加入宿主细胞中。
4. 在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育6-24小时₂.

3. 固定细胞

1. 通过向每孔中已有的感染培养基加入 100 μl 8% 多聚甲醛固定细胞。室温避光孵育 15 分钟。注意：建议直接将 2 倍浓度的多聚甲醛（8%）加入感染培养基中，以防止在固定前将高滴度培养基直接倾倒至废液皿时产生具有传染性的痘苗病毒气溶胶。
2. 将培养板倒置放入废液皿中，去除固定液。
3. 加入 100 μl 室温 PBS。
4. 用光学透明粘性封板膜密封培养板。注意：若不立即检测，培养板可在 4 °C 条件下储存。检测前务必使密封的培养板恢复至室温，以防止冷凝水影响分光光度计读数。

4. 定量病毒生长

1. 在515:530 nm（Venus）、587:610 nm（mCherry）和415:457 nm（TagBFP）处测定终点荧光（激发波长:发射波长，单位为nm）。每个孔需使用各通道优化的增益设置进行四次测量并取平均值。注意：合适的发射波长可能因所用酶标仪的具体型号和滤光片特性而异。可通过执行发射波长扫描实验，确定各通道中TrpV与PLV之间差异最大的波长点，以经验方式确定最佳波长。
2. 对原始数据进行归一化处理，以便于不同实验之间的比较。
   1. 针对每个通道，计算重复孔中TrpV和PLV的平均值。
   2. 将每种处理条件下TrpV感染组的平均测量值减去相应PLV感染对照组的平均背景值。
   3. 将各背景校正后的数值除以仅含载体（vehicle-only）处理组的数值，进行数据归一化。
   4. 当实验重复多次后，可对各通道数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA）及多重比较事后检验，以判断任一处理组是否与仅含载体处理组之间存在统计学上的显著差异。

5. 替代方案： 动力学平板检测

1. 执行所有步骤，直至加入处理物（步骤 2.3）。
2. 用粘性封板膜密封培养板，并置于已平衡至 37 °C 的酶标仪腔室内。注意：必须特别注意保持培养板始终处于 37 °C，以避免细胞受到非必要应激和冷凝水产生。对于动力学检测，尤其重要的是使用缓冲培养基（碳酸氢钠和 HEPES），以在无需添加 5% CO₂ 的条件下维持合适的 pH 值。
3. 手动设置酶标仪增益，以防止后续时间点信号饱和。注意：可通过在相似条件下进行终点检测来准确优化增益。
4. 在感染后 8–24 小时内每小时采集一次读数，并使用与终点检测相似的程序进行归一化处理（步骤 4.2）。
5. 可采用与前述终点检测相似的方法，对各个时间点进行统计学显著性分析。

结果

作为这些病毒典型用途的一个示例，三重荧光报告病毒被用于比较几种明确的痘病毒抑制剂的作用抑制位点。

将HeLa细胞接种于经组织培养处理的黑色壁透明平底96孔板中，过夜培养。使用三重报告病毒（TrpV；表1）或无启动子Venus（PLV）对汇合的单层细胞进行感染，感染复数（MOI）为10，具体操作依据孔板图（图1）进行。向感染培养基中加入处理试剂，终浓度分别为0.1% DMSO、3.6 μM（1 μg/ml）AraC、50 μM（11.7 μg/ml）IBT、5 μM（1.9 μg/ml）ST-246或60 μM（50 μg/ml）利福平，每组设三个重复。以0.1% DMSO作为溶剂对照，因为所有抑制剂储备液均以DMSO配制，使用时终体积比为1 μl/ml。将培养板放回37 °C培养箱，继续培养至感染后18小时（18 hpi）。通过向每孔加入100 μl 8%多聚甲醛固定细胞，固定15分钟，随后将板置于PBS中避光保存，直至使用酶标仪检测。采用Tecan Infinite M1000酶标仪及i-control软件（v1...

讨论

 本文介绍了多阶段痘苗病毒报告病毒（TrpV）的实际应用，该病毒可对病毒复制提供可重复的实时反馈测量。通过使用明确的痘病毒抑制剂，我们证明了TrpV的反应方式与各抑制剂已知的作用机制一致。尽管TrpV病毒能够提供关于病毒各阶段进展的最全面信息，但两阶段（IREV、LREV）和单阶段（EV、IV、LV）病毒也可类似地使用，充分利用Venus荧光蛋白优异的折叠能力、稳定性以及更高的信噪比。

本方案中的概念验证实验表明，可通过一种简单、高通量的板式实验，检测已知的痘病毒抑制剂所影响的病毒基因表达阶段。该实验方法还可进一步扩展，用于对未知的化合物文库进行快速、全面的筛选。可通过在低感染复数（MOI）下，利用病毒接种经小分子处理的细胞，从而特异性地鉴定出可阻断病毒生命周期任一阶段的化合物。随后，可使用TrpV在多个MOI条件下对这些抑制剂进行筛选，以确定其抑制的病毒生命周期阶段，包括病毒进入（无基因表达）、早期、中期或晚期基因表达，以及组装阶段（完全基因表达但无病毒扩散）。我们已利用该技术成功鉴定出一种新的抗痘病毒抑制剂，其...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	11995-065
胎牛血清 - 优级，热灭活（FBS）	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-谷氨酰胺（L-glut）	Gibco	25030-081
96孔平底透明黑色聚苯乙烯TC处理微孔板	康宁	3603
384孔平底透明底部黑色聚苯乙烯TC处理微孔板	康宁	3712
胰蛋白酶，2倍浓度，无菌，经辐照	沃辛顿生化公司	TRLVMF
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010-023
二甲基亚砜，细胞培养级（DMSO）	American Bioanalytical	AB03091
1-β阿糖胞苷  （阿糖胞苷），分子量 = 280 g/mol	SigmaAldrich 公司	C6645
异吲哚啉二酮 β -噻吩甲酰肼（IBT），分子量= 234 g/mol	Fisher Scientific	NC9075202
利福平，分子量 = 823 g/mol	SigmaAldrich 公司	R3501
ST-246，分子量 = 376 g/mol	SIGA Labs，科瓦利斯，俄勒冈州
8% 甲醛（Paraformaldehyde）水溶液	电子显微镜科学公司	157-8
TempPlate RT 透明光学膜	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM 低血清培养基	Gibco	31985-070