用于量化基因表达各阶段病毒功能的痘苗病毒报告病毒

摘要

我们描述了一种荧光报告型痘苗病毒的使用方法，该病毒可通过光谱上可区分的报告荧光蛋白的时相特异性表达，实现对病毒感染性和基因表达的实时检测。我们详细介绍了一种基于孔板的方法，用于精确定位小分子抑制剂作用下病毒复制受干扰的具体阶段。

摘要

痘病毒是一类双链DNA病毒，包含多种对人类具有致病性的病毒，例如猴痘病毒、传染性软疣病毒和传染性脓疱病病毒。该病毒家族还包括天花病毒——天花病毒（Variola）。由于痘病毒复制过程复杂，目前对其基因表达策略仍有许多问题尚未阐明。本文介绍了重组痘苗病毒的设计与应用，该技术能够在高通量条件下实时检测病毒基因表达的单个或多个阶段。该方法利用光谱特性不同的荧光蛋白作为报告分子，分别标记病毒复制的三个阶段。这些病毒在保持各阶段特异性表达模式的同时，具有高信噪比，可用于基于孔板的检测以及对病毒传播和复制过程的显微观察。这些工具可用于抗病毒药物筛选、病毒与宿主相互作用研究以及进化生物学研究。

引言

传统上，病毒表达的研究采用分子生物学技术例如 Northern 印迹，Western 印迹，微阵列杂交 等等。) ¹尽管这些方法能够提供有关单个 mRNA 或蛋白质表达变化分类的详细信息，但通常难以适用于实时和高通量的检测流程。以往在痘病毒研究中已应用基于荧光报告分子的替代方法；然而，这些方法的开发和使用基于不同的研究目的。其中一些方法旨在筛选重组病毒 ^2,3这些技术在重组痘苗病毒克隆中外源DNA正确整合并表达时，可表达EGFP。类似地，已有多种稳定表达可溶性EGFP或由天然痘苗病毒启动子驱动的GFP标记蛋白的痘苗病毒株被广泛使用。这些病毒株通常用于基于抗体的中和试验、化学抑制实验或抗病毒效果比较中，定量检测病毒的进入与复制情况。 ^4–6尽管这些病毒已被证明具有一定的应用价值，但由于其使用了单一且具有模糊性的早期/晚期病毒启动子，因而难以提供关于抑制作用位点的详细信息。此外，以往的方法还采用了信噪比较差的EGFP蛋白。

由于痘病毒复制的复杂性以及目前尚无可用的工具来检测病毒基因表达的实时变化，我们开发了一系列单阶段和多阶段报告病毒^7,8。如先前发表的研究所述，这些病毒在感染的早期、中期或晚期阶段，利用天然的痘苗病毒启动子表达一种、两种或三种光谱上可区分的荧光蛋白。这些病毒可用于荧光显微镜下监测病毒....

方案

1. 铺板细胞

1. 将HeLa细胞从培养板上解离，并用生长培养基（DMEM，2 mM L-谷氨酰胺，10%胎牛血清）稀释至约2.0 × 10⁵ 个细胞/ml。取100 μl/孔加入黑色壁、透明平底的96孔板中（每孔20,000个细胞）。
2. 将细胞在37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育24小时，直至形成汇合单层。

2. 感染细胞

1. 稀释病毒并感染细胞。
   1. 解冻TrpV（三重病毒；早期Venus、中期mCherry、晚期TagBFP）和PLV（无启动子Venus）荧光病毒，并使用超声处理5分钟以分散病毒颗粒。或者，可将粗制病毒原液与含0.25 mg/ml胰蛋白酶的感染培养基按1:1比例混合，在37 °C孵育30分钟。
   2. 将粗制病毒原液用37 °C感染培养基（DMEM，2 mM L-谷氨酰胺，2% FBS）稀释。对于高MOI感染（10 PFU/细胞），将病毒原液稀释至1.0 × 10⁷ PFU/ml，假设为 5 x 10⁴ 每孔细胞数和接种体积为50 μl。每种处理需设置3个复孔用TrpV感染，另设3个复孔用PLV感染，以校正每种处理特有的背景荧光。
   3. 在感染培养基中加入50 μl/孔的稀释病毒进行感染，此时间点定义为感染后0小时（0 hpi）。
   ....

结果

作为这些病毒典型用途的一个示例，三重荧光报告病毒被用于比较几种明确的痘病毒抑制剂的作用抑制位点。

将HeLa细胞接种于经组织培养处理的黑色壁透明平底96孔板中，过夜培养。使用三重报告病毒（TrpV；表1）或无启动子Venus（PLV）对汇合的单层细胞进行感染，感染复数（MOI）为10，具体操作依据孔板图（图1）进行。向感染培养基中加入处理试剂，终浓度分别为0.1% DMSO、3.6 μM（1 μg/ml）AraC、50 μM（11.7 μg/ml）IBT、5 μM（1.9 μg/ml）ST-246或60 μM（50 μg/ml）利福平，每组设三个重复。以0.1% DMSO作为溶剂对照，因为所有抑制剂储备液均以DMSO配制，使用时终体积比为1 μl/ml。将培养板放回37 °C培养箱，继续培养至感染后18小时（18 hpi）。通过向每孔加入100 μl 8%多聚甲醛固定细胞，固定15分钟，随后将板置于PBS中避光保存，直至使用酶标仪检测。采用Tecan Infinite M1000酶标仪及i-control软件（v1.......

讨论

 本文介绍了多阶段痘苗病毒报告病毒（TrpV）的实际应用，该病毒可对病毒复制提供可重复的实时反馈测量。通过使用明确的痘病毒抑制剂，我们证明了TrpV的反应方式与各抑制剂已知的作用机制一致。尽管TrpV病毒能够提供关于病毒各阶段进展的最全面信息，但两阶段（IREV、LREV）和单阶段（EV、IV、LV）病毒也可类似地使用，充分利用Venus荧光蛋白优异的折叠能力、稳定性以及更高的信噪比。

本方案中的概念验证实验表明，可通过一种简单、高通量的板式实验，检测已知的痘病毒抑制剂所影响的病毒基因表达阶段。该实验方法还可进一步扩展，用于对未知的化合物文库进行快速、全面的筛选。可通过在低感染复数（MOI）下，利用病毒接种经小分子处理的细胞，从而特异性地鉴定出可阻断病毒生命周期任一阶段的化合物。随后，可使用TrpV在多个MOI条件下对这些抑制剂进行筛选，以确定其抑制的病毒生命周期阶段，包括病毒进入（无基因表达）、早期、中期或晚期基因表达，以及组装阶段（完全基因表达但无病毒扩散）。我们已利用该技术成功鉴定出一种新的抗痘病毒抑制剂，其.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	11995-065
胎牛血清 - 优级，热灭活（FBS）	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-谷氨酰胺（L-glut）	Gibco	25030-081
96孔平底透明黑色聚苯乙烯TC处理微孔板	康宁	3603
384孔平底透明底部黑色聚苯乙烯TC处理微孔板	康宁	3712
胰蛋白酶，2倍浓度，无菌，经辐照	沃辛顿生化公司	TRLVMF
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010-023
二甲基亚砜，细胞培养级（DMSO）	American Bioanalytical	AB03091
1-β阿糖胞苷  （阿糖胞苷），分子量 = 280 g/mol	SigmaAldrich 公司	C6645
异吲哚啉二酮 β -噻吩甲酰肼（IBT），分子量= 234 g/mol	Fisher Scientific	NC9075202
利福平，分子量 = 823 g/mol	SigmaAldrich 公司	R3501
ST-246，分子量 = 376 g/mol	SIGA Labs，科瓦利斯，俄勒冈州
8% 甲醛（Paraformaldehyde）水溶液	电子显微镜科学公司	157-8
TempPlate RT 透明光学膜	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM 低血清培养基	Gibco	31985-070