一种用于研究病原体诱导局部及全身慢性炎症的小鼠模型

摘要

动物模型在阐明宿主和病原体特异性机制以促进慢性炎症发展方面已被证明是不可或缺的工具。本文描述了一种利用人类病原体牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）进行口腔感染的小鼠模型，并详细介绍了评估局部和全身部位炎症进展的方法。

摘要

慢性炎症是导致病理性组织损伤的主要因素，也是人类多种慢性疾病（包括肿瘤性疾病、自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病）的共同特征。越来越多的证据表明，病原体诱导的慢性炎症在具有多种临床表现的慢性疾病的发生和发展中起着重要作用。由于慢性疾病的病因复杂且涉及多种因素，在人体中设计实验证明其因果关系并建立机制性联系几乎不可能。使用动物模型的一个优势在于，可以控制可能影响特定疾病进程的遗传和环境因素。因此，建立与感染相关的动物模型是识别宿主和病原体特异性机制的关键步骤，这些机制共同参与了慢性炎症的形成。

本文描述了一种小鼠模型，用于研究口腔病原菌Porphyromonas gingivalis感染后在局部和全身部位引发的慢性炎症。该细菌与人类牙周病密切相关。在无特定病原体的小鼠中，口腔感染可诱导局部炎症反应，导致支持牙齿的牙槽骨破坏，这是牙周病的典型特征。在已建立的动脉粥样硬化小鼠模型中，P. gingivalis感染会加速主动脉窦和无名动脉内炎症斑块的沉积，并伴随血管内皮细胞活化、免疫细胞浸润增加以及病灶内炎症介质表达升高。我们详细阐述了评估局部和全身炎症的实验方法。利用转基因小鼠和特定的细菌突变株，使该模型特别适用于鉴定参与疾病起始、进展及结局的宿主和微生物因素。此外，该模型还可用于筛选新的治疗策略，包括疫苗接种和药物干预。

引言

慢性炎症是导致病理性组织损伤的主要因素，也是人类多种慢性疾病的共同特征。这些疾病包括肿瘤性疾病、自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病¹。许多慢性疾病的病因尚不明确，但已知其成因复杂且为多因素所致，涉及遗传易感性以及环境因素的共同作用。尽管炎症持续存在的机制仍不清晰，但免疫激活的细胞和分子特征与宿主对病原体反应中所观察到的模式存在显著重叠²。

越来越多的证据表明，微生物病原体感染与慢性炎症的发生、发展及其多种临床表现密切相关^2,3。病原体可通过破坏宿主免疫系统并建立持续性感染，直接诱导和维持慢性炎症⁴。即使在病原体未持续存在的条件下，感染仍可能通过分子模拟引发针对自身抗原的自身免疫反应、改变自身抗原使其具有免疫原性，或通过组织损伤释放原本被屏蔽的宿主抗原，从而诱发慢性炎症。然而，极少有特定病原体被确认为某种特定慢性疾病的普遍病因。相反，现有大多数数据表明，在遗传易感宿主中，不同病原体通过各自独特的机制引发慢性炎症，导致广泛的临床表现和疾病结局³。因此，深入理解特定病原体诱导慢性炎症的具体机制，对于公共卫生以及多种慢性疾病的治疗和预防具有重要意义。

尽管宿主与病原体特异性机制在慢性炎症的诱导与维持中的作用尚不明确，但病原体诱导慢性炎症模型的研究进展已开始加深我们对这些过程的理解。P. gingivalis 口腔感染模型是一种独特且已被充分表征的小鼠模型，可用于研究宿主与病原体特异性机制在局部（口腔骨质流失）和全身性部位（动脉粥样硬化）引发慢性炎症中的作用^5,6。

P. gingivalis 是一种革兰氏阴性、厌氧的口腔病原体，与人类牙周病相关。牙周病是一种由感染引发的慢性炎症性疾病，其特征是牙齿支持组织的破坏⁷。除了在感染初始部位引起病理变化外，越来越多的证据表明，P. gingivalis 诱导的慢性炎症还参与了包括动脉粥样硬化⁵在内的多种全身性疾病的发病与进展。动脉粥样硬化是一种以动脉血管壁慢性炎症为特征的疾病。在无特定病原体小鼠中进行 P. gingivalis 口腔感染，可引发局部炎症反应，导致牙齿支持性牙槽骨的破坏⁸。P. gingivalis 可在感染后小鼠口腔中持续检出长达42天⁸，且小鼠体内可产生高水平的病原体特异性血清抗体滴度⁹。在利用载脂蛋白E^-/-小鼠（ApoE^-/-）建立的动脉粥样硬化小鼠模型中，P. gingivalis 的口腔感染可诱发慢性炎症，促进主动脉窦¹⁰和无名动脉¹¹内的炎性斑块沉积。P. gingivalis 感染小鼠无名动脉内的进行性炎症可通过活体 in vivo MRI 在活体动物中进行监测。组织学上，P. gingivalis 感染小鼠的动脉病变表现为脂质积聚增加，同时伴有血管内皮细胞活化、免疫细胞浸润增多以及炎症介质表达水平升高¹²。在基因敲除小鼠中应用该模型，已阐明宿主信号通路组分和炎症介质的作用，以及驱动 P. gingivalis 诱导免疫病理过程的细胞特异性相互作用^12–14。此外，利用特定细菌突变株开展的实验已鉴定出多个对局部和全身慢性炎症至关重要的 P. gingivalis 毒力因子¹⁵。

本文详细介绍了用于评估的方法学 P. gingivalis诱导的局部和全身性慢性炎症。我们提供了使用Amira软件通过显微CT分析牙槽骨吸收的详细实验方案。此外，我们阐述了连续切片 体内 用于评估无名动脉内进行性炎症的活体动物磁共振成像。我们提供了动脉病变中炎症斑块的可视化与定量方法，并描述了其组织学特征。利用转基因小鼠和特定的细菌突变株，该模型特别适用于鉴定参与疾病起始、进展及结局的宿主与微生物因素。此外，该模型还可用于筛选新的治疗策略，包括疫苗接种和药物干预。

方案

1. 细菌的培养与生长

1. 将冻存的牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）381菌种划线接种至厌氧血琼脂平板上，在厌氧培养箱（10% H₂/10% CO₂/80% N₂）中37 °C培养3–5天。
2. 用平板培养的菌落接种5 ml添加酵母提取物（0.5%）、血红素（10 μg/ml）和甲萘醌（1 μg/ml）的脑心浸液培养基（BHI），过夜培养后，将5 ml培养物转接到45 ml BHI培养基中。
3. 将50 ml液体培养物在厌氧条件下继续培养18–24小时，并在对数生长中期至后期收获。注意：在将细菌接种动物前，必须始终通过革兰染色验证培养物的纯度。
4. 在7,000 x g条件下离心10分钟收集细菌，吸除上清液，用移液管将菌体沉淀充分重悬于5 ml PBS中。再加入45 ml PBS，在7,000 x g条件下离心10分钟。重复此步骤共三次，总计洗涤三次。
5. 最后一次洗涤后，将菌体沉淀重悬于PBS中，使培养物1:10稀释后的660 nm处光密度值为1.0（O.D.₆₆₀ 为1相当于10⁹ CFU/ml）。称取足量的羧甲基纤维素（中等黏度），配制成2% w/v溶液（例如，每5 ml菌液加0.1 g）。在涡旋振荡的同时缓慢将羧甲基纤维素加入菌悬液中，以避免结块。

2. 口服感染

注意：如图1所示，通过使用合适的小鼠模型和口服感染方案，P. gingivalis 可在局部（口腔）和全身（动脉）部位诱导慢性炎症和免疫病理改变。

1. 给6至8周龄雄性小鼠施用磺胺甲噁唑（0.87 mg/ml）和甲氧苄啶（0.17 mg/ml）（Sulfatrim） 随意摄取 在饮水中加入抗生素，持续2周，以减少正常菌群。将抗生素溶液保存在棕色玻璃瓶中，并避免光照，以防降解。
2. 为避免抗生素溶液沉淀，每天需摇动瓶子一至两次。即， 在早晨和傍晚更换溶液，每3至5天更换一次新鲜配制的溶液。
3. 两周后，将抗生素溶液更换为常规饮用水。口服感染前留出2天的抗生素停药期。
4. 加载 P. gingivalis将1毫升结核菌素注射器连接喂养针头，吸入适量载体。用手抓住小鼠颈背部的皮肤以进行手动固定，确保抓握牢固，以限制小鼠头部活动。
5. 通过局部涂抹感染小鼠 P. gingivalis 在上颌的颊面，将喂养针置于与右侧上颌磨牙颊面齐平的位置，注入50 μl细菌悬液。使用喂养针的球部在牙龈边缘轻柔分散溶液1分钟。
6. 让小鼠休息30秒 至1分钟，然后在左侧上颌重复该操作。对照小鼠接受抗生素预处理，并仅通过口服灌胃给予载体（PBS中2%羧甲基纤维素）。
7. 通过每2天间隔感染小鼠1次，共感染3次，以建立病原体诱导的局部慢性炎症并导致牙槽骨吸收模型。感染6周后处死小鼠，采用显微CT评估骨吸收情况。
8. 为研究病原体诱导的局部和全身慢性炎症，可感染易发动脉粥样硬化的ApoE^-/- 小鼠每周5次，持续3周。
   注意：无名动脉疾病进展通过系列检查进行监测 体内 MRI。在不同时间点对小鼠进行成像，6-16周后处死。处死时，通过评估整体动脉粥样硬化负荷 正面 通过显微CT分析并确定牙槽骨丧失。通过组织学与免疫组织化学表征动脉粥样硬化病变。

3. 显微计算机断层扫描（microCT）

1. 样本制备
   1. 在感染后的预定时间点处死小鼠。采用机构动物设施批准的方法，通过 CO₂ 窒息或其他方法实施安乐死。
      注意：通过心脏穿刺采集血液，分离血清，并在 -80 °C 下保存，用于后续抗P.gingivalis IgG 的分析，具体方法见文献⁹。
   2. 使用大型断头剪在颅底处切断小鼠头部。用镊子去除软组织，将颅骨放入含有 30 ml 4% 缓冲多聚甲醛的 50 ml 锥形管中。在 4°C 下固定 24–48 小时。
   3. 固定完成后，用 PBS 充分冲洗样本。
   4. 制备上颌骨块活检样本。
   5. 将半侧上颌骨保存在组织学级 70% EtOH 中，4 °C 保存，直至进行 microCT 评估。
2. 图像采集
   1. 使用台式 microCT 扫描仪进行图像采集。将 X 射线源设置为电流 114 μA，电压 70 kV。将单个半侧上颌骨样本装入成像容器中，以 12 μm 的空间分辨率在三个维度上进行扫描。
      注意：可在同一成像容器中同时装载多个半侧上颌骨样本。
   2. 执行初步低分辨率扫描，以便用户在系统中界定图像采集的边界，并将扫描范围限制在感兴趣区域（ROI）。
      注意：釉质的高密度使上颌磨牙的牙冠易于识别。以磨牙为参考，粗略设定成像边界，覆盖三颗磨牙及其周围的牙槽骨。当在同一容器中扫描多个样本时，该功能也可用于区分各个半侧上颌骨。
   3. 扫描完成后，将原始图像文件（.ISQ）转换为高质量的 DICOM 文件（.DCM）。
3. 图像分析
   本方案中，图像分析使用数据可视化、处理与分析软件完成。首先，利用形态学标志点构建牙骨质-釉质交界（CEJ）的最佳拟合平面，然后利用该平面将半侧上颌骨转换为标准方向，以便后续测量牙槽骨体积。
   1. 打开软件，点击“Pool”区域左上角的“Open Data”图标。或者，使用 文件 > Open Data。
   2. 选择 DICOM 图像序列并点击加载。DICOM 加载窗口出现，点击确定。
   3. 在 Pool 中观察数据集显示为绿色图标。点击数据对象时，Pool 顶部的按钮区域会显示额外按钮。选中图标后，数据记录的相关信息也会在属性区域中显示。
   4. Pool 中的每个图标均提供一个弹出菜单，可从中选择不同模块。通过点击数据图标右上角的白色箭头激活弹出菜单。在显示模块下，选择等值面（Display > Isosurface）。等值面图标将出现在 Pool 区域中。选中后，属性区域会显示更多设置选项。
   5. 将绘制样式设为透明，阈值设为 2,000。确保在选项中选中“compactify”和“downsample”。在平均设置下，确保 x、y 和 z 均设为 2。点击应用以生成等值面。
      注意：在 3D 查看器中观察半侧上颌骨的透明三维重建。使用透明绘制样式进行图像重建的优势在于可清晰识别磨牙的牙根，这对于将样本调整为标准方向至关重要。
   6. 选中绿色数据图标，在属性区域中点击裁剪图标。此时会弹出一个显示数据尺寸和坐标的窗口。暂将其保留。注意 3D 查看器中会出现一个带有绿色角标签的边界框。
   7. 在查看器工具栏中点击“Interact”按钮。通过点击并拖动绿色角点调整边界框大小，确保其包含感兴趣区域（ROI），并尽可能排除空白区域和杂质，以降低计算机的计算负担。
   8. 在查看器工具栏中使用“Trackball”按钮旋转 3D 查看器中的对象，确保 ROI 完全被边界框包围。确认无误后，点击第 8 步中暂留的裁剪窗口中的“确定”。
   9. 选中数据图标，在显示模块下选择斜切面（OBS）（Display > OBS）。
   10. 选中 OBS，在属性区域中将映射类型设为线性，数据窗口范围设为 -200 至 10,000，采样设为最精细。然后在选项中选择旋转。此时 OBS 中心会出现一个旋转切换按钮。
   11. 在查看器工具栏中点击“Interact”按钮，使用切换手柄调整切片的切割平面。创建一个与牙根平行、与牙合面垂直的矢状面。该平面应平分三颗磨牙（M1–M3），如图 2所示。
   12. 关闭旋转功能，并复制 OBS（对象>复制对象）。新生成的 OBS 命名为 OBS 2。对 OBS 2 启用旋转功能。
   13. 使用旋转手柄重新调整 OBS 2 的方向，使其与 OBS 1 垂直（见图 2）。
   14. 关闭 OBS 2 的旋转功能，并创建 3 个切片副本。这些切片将被命名为 OBS 3、4 和 5。
4. 选取最佳拟合平面的点位
   注意：步骤 3.4.1–3.4.5 描述了沿 CEJ 选取 8 个点以构建最佳拟合平面的过程。其中 4 个点从矢状切面选取，另 4 个点从冠状切面选取（见图 3）。在步骤 3.4.6 中选取矢状切面上的点时，可能需要调整 OBS 1。
   1. 将 OBS 1 与 M1 最近中根在矢状面上的中心对齐。将 OBS 2 与 M1 最近中根在冠状面上的中心对齐。
   2. 将 OBS 3 与 M1 颊远根在冠状面上的中心对齐。必要时，在步骤 20 中选取点时，调整 OBS 1，使其在矢状面上大致对准 M1 的颊远根中心。
   3. 将 OBS 4 与 M2 颊根分叉处对齐。OBS 4 应位于 M2 颊近根与颊远根之间中心位置。必要时，在步骤 20 中选取点时，调整 OBS 1，使其在矢状面上大致对准 M2 的颊远根中心。
   4. 调整 OBS 5，使其在冠状面上沿 M3 中心垂直穿过。必要时，在步骤 20 中选取点时，调整 OBS 1，使其在矢状面上大致对准 M3 最远中根的中心。
   5. 复制任意一个 OBS（OBS 6），并在属性窗口中选择“fit to points”。该功能允许研究人员在查看器中的二维或三维对象上选取 3 个或更多点，软件将自动计算最佳拟合平面。本例中，使用前述步骤中描述的二维 OBS 沿 CEJ 选取 8 个点。
   6. 通过点击数据图标右上角的橙色方框，将 OBS 6 从 3D 查看器中隐藏。同时隐藏等值面，以便在所有二维切片上清晰显示 CEJ。按住 Shift 键并依次选取上述 8 个沿 CEJ 的点。
      注意：若选取点时未按住 Shift 键，系统将在选取前三个点后自动计算平面。
   7. 选取全部 8 个点后，使 OBS 6 可见。注意该切面为轴向切面，大致与牙合面平行。
5. 转换与重定向 注意：使用最佳拟合平面将数据转换为标准方向，以便进行后续体积测量。
   1. 点击数据图标>计算>应用变换。ApplyTransform 图标出现在 Pool 区域。点击 ApplyTransform 图标角落的白色方块，选择“reference”，然后点击 OBS 6。
   2. 在属性区域中，选择“standard”作为插值方法，“extended”作为模式。应用变换。
   3. 为新数据文件创建等值面和冠状 OBS。将 OBS 沿轴向旋转，使其大致与 M1 垂直（如图 2所示）。以磨牙牙尖和牙合面曲率为参考进行调整。
   4. 使用该平面按照步骤 3.5.1 和 3.5.2 对数据进行变换。保存变换后的数据文件。
6. 分割与骨体积测量
   注意：以下步骤描述了牙槽骨的分割与体积测量过程。首先确定与 CEJ 最佳拟合平面对应的切片，并选择一个参考平面。对磨牙颊侧从 CEJ 到参考平面之间的牙槽骨进行分割与测量。M1 最近中根与 M3 最远中根作为端点标志。将参考平面设在 CEJ 下方 15–20 个切片处可获得最佳结果。若包含更多切片，会引入变异性，掩盖不同处理组之间的骨体积差异。
   1. 打开分割编辑器，为变换后的数据创建新标签。
   2. 创建新材料并命名为“牙槽骨”。
   3. 在“Zoom and Data Window”下，将数据范围设为 -200 至 10,000。
   4. 在“Display and Masking”下，选择 2D 十字线、3D MPR 和 3D 体积渲染图标。将数据范围设为 2,500 至 8,000。启用数据掩膜功能。
   5. 在查看器工具栏中选择“Four Viewers”显示模式。显示界面分为四个象限，可同时查看矢状、冠状、轴向图像序列以及 3D 渲染体积。
   6. 利用四个象限，确定在 M1 和 M3 颊侧牙面上釉质可见的最后一个切片。该位置对应于 CEJ 的最佳拟合平面。记录该轴向切片编号。
   7. 在轴向切面上，继续向牙槽骨嵴方向移动 15–20 个切片，作为参考平面。
   8. 结合使用任意分割工具，选取从 CEJ 到参考平面之间磨牙颊侧的牙槽骨区域。以 M1 最近中根和 M3 最远中根作为端点标志。
   9. 确认无误后，将所选区域添加至材料列表中的“牙槽骨”类别下。
   10. 返回对象池。图像数据图标后应追加一个扩展名为“.Labels”的新图标。选中 Labels 图标，在下拉菜单中选择 材料>材料统计。
   11. 在属性区域中选择“Material”并点击应用。将弹出一个表格，列出材料列表中每种材料的多个参数。记录“牙槽骨”的体积。

4. 动脉粥样硬化的评估

1. 主动脉夹层
   1. 在感染后预定时间点，通过 CO₂ 窒息法处死小鼠。
   2. 将小鼠仰卧放置，用胶带固定四肢，并用 70% 乙醇擦拭小鼠体表。从腹部中段开始沿腹侧正中线剪开皮肤，直至剑突上方。
   3. 剪开腹部皮肤直至剑突清晰可见。用小镊子提起剑突，在肋骨两侧做切口，并剪开膈肌。然后沿肋骨两侧向下剪开，以暴露心脏。
   4. 使用 27 G 胰岛素注射器插入右心室心尖进行放血。采血过程中应定期旋转针头，防止心室壁堵塞针孔。通常采用此方法可获得 0.8 - 1 ml 血液。
   5. sup>注意：分离血清并储存在 -80 °C，用于后续抗牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）IgG 的检测，具体方法见其他文献⁹。
   6. 用剪刀切除右心房。
   7. 在心脏后侧定位左心室。将 21 G 针头插入左心室心尖，针尖斜面朝向心腔中心，缓慢灌注 3 - 5 ml 组织固定液以冲洗循环系统。
   8. 修剪心脏周围附着的脂肪组织和胸腺。
   9. 移除肺脏。
   10. 定位具有三个分支的主动脉弓，并清除周围脂肪层以充分暴露。
   11. 从主动脉弓开始向下解剖至膈肌基底部。
   12. 移除肝脏并移开肠组织以暴露降主动脉。继续解剖远端主动脉至肾动脉分支处。
   13. 切断肾动脉，并继续向下解剖至髂部分叉处。
   14. 当主动脉大部分结缔组织已被清除后，返回主动脉顶端，剪除主动脉弓上方三个分支的最顶端部分。
   15. 向上剥离心脏，剪除下方脂肪组织，以将心脏与身体分离。
   16. 用镊子夹住心脏并向上牵拉，剪断仍可能连接的结缔组织，继续向下至肾脏，并沿下肢方向延伸，尽可能在最低位置剪断。
   17. 将主动脉置于 10% 福尔马林中固定 1 小时，随后用 PBS 洗涤 1 小时。或者，可将主动脉在 10% 福尔马林中过夜固定，次日用 PBS 冲洗后继续后续操作。
   18. 将主动脉放入盛有 PBS 的 10 cm 培养皿中。
   19. 在解剖显微镜下，小心去除主动脉外膜组织。
   20. 当主动脉上多余脂肪和组织被清除后，剪除心脏底部三分之二部分。从与主动脉弓相对的一端开始剥离心肌。主动脉球部将逐渐显露，呈白色。
   21. 使用两把镊子继续精细解剖，直至主动脉球部完全脱离心肌组织。
   22. 将清理后的主动脉置于黑色解剖托盘中，并用 PBS 覆盖。
2. 主动脉固定
   1. 在整个固定过程中保持主动脉被 PBS 覆盖。
   2. 将主动脉按解剖位置摆放，主动脉球部位于左侧。
   3. 在以下 5 个位置使用临时微细钉针固定：1）主动脉顶端；2）主动脉弓第三分支下方；3）降主动脉中段；4）降主动脉下端附近；5）股动脉分支上方。
   4. 使用超细弹簧剪刀，从股动脉左支开始，沿主动脉左侧向上剪开，直至升主动脉最低分支下方。
   5. 从最低位主动脉球部的缝隙处开始，沿左侧向上剪开，并与主动脉纵向切口相交。
   6. 沿水平方向横剪主动脉，直至升主动脉最低分支处。
   7. 从右侧向上剪开，直至高于主动脉最高分支的位置。
   8. 分别剪开各分支，以暴露其内表面。
   9. 移除部分临时钉针，并替换为永久钉针，目标是将整个主动脉以自然解剖位置固定，避免折叠或拉伸，确保内表面完全暴露。
   10. 持续固定直至主动脉内表面完全暴露，从上方清晰可见，且无钉针造成视觉遮挡。
3. 脂质染色与病变定量
   1. 配制苏丹 IV 染色液（5 mg/ml 溶于 70% 异丙醇）。充分混匀并过滤，确保无晶体残留。
   2. 用苏丹 IV 溶液覆盖已固定的主动脉，染色 50 分钟。
   3. 用 70% 异丙醇洗涤 1 - 5 分钟。用去离子水（ddH2O）轻轻冲洗主动脉，直至流出液不再呈红色。
   4. 用 PBS 覆盖主动脉。使用连接解剖显微镜的高分辨率相机拍摄主动脉图像，并保存为数字图像文件（.TIFF 格式）。每张图像旁放置标尺，以便后续校准。
   5. 使用 ImageJ 软件测定内膜面积和病变面积。手动勾画内膜表面以确定总面积。病变面积可通过自动颜色阈值法计算，需设定一个颜色强度阈值，以区分病变区域与正常区域。
   6. 计算动脉粥样硬化病变占内膜表面积的百分比。

5. 动脉粥样硬化病变的组织学评估

1. 取主动脉弓及心脏组织，浸入一次性底模中的O.C.T.包埋剂中。
2. 收集 5 μ每50微米进行连续冷冻切片 μ在设定为 -17℃ 的冷冻切片机中对主动脉窦和无名动脉进行切片 °C，并将组织切片载于显微镜载玻片上。将载玻片置于 -20℃ 保存 °直至进一步使用前均需保持在 C 条件下保存。
3. 用于组织学评估，用苏木精染色 & 伊红，采用适当的步骤。

6. 动脉粥样硬化病变的免疫组织化学表征。

以下步骤概述了一种常规使用的基于抗体的实验方案，用于评估P. gingivalis感染小鼠中的动脉粥样硬化病变。该方案需针对每种抗体或试剂进行优化。

1. 从冰箱中取出载玻片，用冰冻固定液（丙酮或其他固定液）固定 2 分钟。
2. 让载玻片恢复至室温，并使用耐溶剂笔进行标记。
3. 用 PBS 漂洗载玻片 3 次，每次 2 分钟，以去除包埋组织的冷冻包埋剂。
4. 将载玻片置于含 0.3% H₂O₂ 的 PBS 溶液中孵育 10 分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。
5. 用 PBS 漂洗载玻片 3 次，每次 2 分钟。
6. 在封闭缓冲液（含 10% 兔血清的 PBS）中孵育 30 分钟，以阻断非特异性结合。
7. 用含 10% 兔血清的溶液将一抗按 1:50 比例稀释。
8. 将稀释后的一抗加至载玻片上的组织切片。
9. 室温孵育 1 小时。
10. 用 PBS 漂洗载玻片 3 次，每次 2 分钟。
11. 用含 10% 兔血清的溶液将生物素标记的二抗（抗大鼠）按 1:100 比例稀释。
12. 加至载玻片上的组织切片，室温孵育 30 分钟。
13. 用 PBS 漂洗载玻片 3 次，每次 2 分钟。
14. 按每 1 ml DAB 缓冲液加入 1 滴 DAB 发色剂的比例配制 DAB 底物溶液。
15. 弃去载玻片上的 PBS，加入 DAB 底物溶液，孵育 5 分钟或直至达到理想的颜色深度。
16. 用蒸馏水洗涤 3 次，每次 2 分钟。
17. 用苏木精复染。
18. 通过四次酒精梯度脱水（95% 酒精 1 分钟、95% 酒精 1 分钟、100% 酒精 1 分钟、100% 酒精 5 分钟）。
19. 用三次二甲苯透明处理。
20. 用封片剂封片，并通过显微镜进行定性分析。如需定量分析，采集图像并使用 ImageJ 软件通过自动阈值法计算染色面积。

7. 磁共振成像

1. 动物 MRI 实验前准备
   1. 在进行MRI实验前对小鼠进行麻醉。使用4%气化异氟烷在诱导室中进行初始麻醉诱导，持续2-3分钟。在成像期间，通过鼻罩装置或面罩持续输送0.5–2%气化异氟烷以维持麻醉状态。
   2. 达到手术麻醉平面后（即， 无足趾捏压反应），将小鼠放入动物固定装置中，使其鼻部插入鼻锥。市面上有多种类型的动物固定装置可用于减少成像过程中的潜在移动。我们使用一种带有咬杆的定制固定装置。
   3. 使用带有小动物监测和门控系统的呼吸垫（置于小鼠腹部）监测呼吸和心电周期，并与图像采集同步。
   4. 用实验室封口膜将小鼠和监测系统固定在动物固定装置上。
2. MRI数据采集
   1. 将动物固定装置以小鼠头部朝前的仰卧位放入30 毫米垂直探针（Micro 2.5）保持在23°C 并置入垂直孔径 11.7 T 磁共振成像仪中。
   2. 将支架与射频线圈的中心对齐。
   3. 使用单个脉冲序列进行匀场过程。
   4. 使用RARE序列，沿三个正交方向采集定位像，以获得轴向、冠状和矢状图像。
   5. 使用非门控3D梯度回波序列进行低分辨率磁共振血管成像（MRA），参数如下： slab厚度 = 1.5 cm；翻转角 = 45°；重复时间 = 20 ms；回波时间 = 2.2 ms；视野 = 1.5 × 1.5 × 1.5 cm；矩阵 = 64 × 64 × 64；平均次数 = 1。总扫描时间： 2∼3 分钟。此扫描的目的是确保在目标区域（头臂动脉）获取图像。
   6. 使用非门控3D梯度回波序列对无名动脉进行高分辨率MRA扫描，参数如下： slab厚度 = 1.5 cm；翻转角 = 45°；重复时间 = 20 ms；回波时间 = 2.2 ms；视野 = 1.5 × 1.5 × 1.5 cm；矩阵 = 128 × 128 × 128；平均次数 = 4。总扫描时间为 ∼25 分钟
   7. 在锁骨下动脉分叉下方0.5 mm处获取无名动脉的连续轴向图像。
3. MRI数据分析
   1. 使用与扫描仪配套的成像软件进行图像重建与分析。通过最大强度投影法实现MRA图像的三维重建。
   2. 以锁骨下动脉分叉作为解剖标志，用于对不同小鼠或同一小鼠在不同时间点获取的数据进行对齐。选择位于锁骨下动脉分叉下方0.3至0.5 mm处的无名动脉目标横截面。
   3. 使用 ImageJ 定义并计算所选横截面的管腔面积。测量应由两名独立观察者在盲法条件下进行。通过计算组内相关系数验证测量的可重复性。
   4. 对于需要连续成像的纵向研究，将每只小鼠管腔面积归一化为其基线期（研究中第一次扫描）获得的管腔面积。结果以随时间变化的管腔面积改变来表示。
   5. 进行适当的统计分析（即， 学生 t 检验，以确定实验组之间的显著性差异。

结果

采用合适的小鼠模型和口服感染方案，P. gingivalis 可在局部（口腔）和全身部位（动脉）诱导慢性炎症和免疫病理改变（图1）。

在小鼠中，经口感染P. gingivalis可诱导局部炎症反应，进而导致支持牙齿的牙槽骨破坏⁸。感染P. gingivalis的小鼠会产生针对该病原体的血清抗体反应，主要为IgG亚型⁹。图4所示结果代表了一项实验，其中C57BL/6小鼠每隔两天接受一次P. gingivalis感染，共感染三次，6周后处死，通过显微CT评估牙槽骨丧失情况。使用Amira软件进行的容积分析显示，与未感染的对照组相比，P. gingivalis感染小鼠表现出显著的骨量丢失（图4A）。对重建的半上颌骨进行肉眼观察发现，与对照组相比，感染小鼠的磨牙根部暴露表面积增加（图4B和图4C

讨论

P. gingivalis 口腔感染模型为研究病原体在局部和全身部位诱导的慢性炎症提供了有价值的工具。该独特模型可用于表征宿主和病原体特异性机制，这些机制共同参与慢性炎症和免疫病理过程。此外，该模型还可用于筛选新型治疗策略，包括免疫接种和药物干预。本方案所述步骤详细描述了该模型的成功应用，并阐述了评估P. gingivalis诱导的慢性炎症的起始、进展及结局的方法学。

在使用本方案研究炎症性骨丢失时，有几个关键方面需要注意。首先，应当注意，P. gingivalis 感染的结果由三个关键因素决定：1）宿主对感染的遗传易感性；2）病原体的毒力（病原体的遗传特性）；以及 3）宿主与病原体之间的相互作用（两个基因组之间的相互作用）。小鼠对 P. gingivalis 诱导的牙槽骨丢失具有遗传决定的易感性，因此在选择实验小鼠品系时必须谨慎¹⁷。利用近交系小鼠在宿主反应上的差异，可开展正向遗传筛选，以鉴定参与病原体诱导的慢性炎症易感性与抗性相关的基因。此外，不同 P. gingivalis<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amira 分析软件	Visualization Sciences Group
厌氧培养箱 DW Scientific 型号 MG500	Microbiology International
BHI	Becton-Dickinson	211059
血红素	Sigma-Aldrich	51280-5G
甲萘醌（维生素 K）	Sigma-Aldrich	M5625-25G
酵母提取物	Becton-Dickinson	212750
羧甲基纤维素（中等黏度）	Sigma-Aldrich	C-4888
复方磺胺甲噁唑口服混悬液 200 mg/40 mg 每 5 ml	Hi-Tech Pharmacal	NDC 50383-823-16
μCT 40	Scanco
HistoChoice 组织固定液	Sigma-Aldrich	H2904
苏丹 IV	Sigma-Aldrich	S4261-25G
垂直腔 11.7T Avance 波谱仪	Bruker
Paravision	Paravision
ImageJ	NIH
大鼠抗小鼠 F4/80 抗体	Serotec	MCA497R
大鼠抗小鼠 TLR2 抗体	eBioscience	13-9021-80
Leica S4 解剖显微镜	Leica
Microm HM 550 冷冻切片机	Microm