超声引导下经胸心肌内注射小鼠技术

摘要

超声心动图引导下的经皮心肌内注射是一种高效、可靠且可靶向的小鼠心脏基因转导剂或细胞递送方法。按照本方案所述步骤操作，实验人员可迅速掌握这种用途广泛且微创的技术。

摘要

心血管疾病的小鼠模型对于研究病理生理机制和探索潜在的再生治疗方法具有重要意义。目前，心肌注射实验通常通过开胸手术直接进行。尽管在进行冠状动脉结扎等其他实验操作时该方法较为方便，但侵入性手术限制了心肌内给药的实验设计可能性。随着超声分辨率的不断提高以及先进的无创成像技术的发展，常规开展超声引导下经皮心肌注射已成为可行。该技术能够高效且可靠地将试剂递送至心肌的靶向区域。此方法的优势包括避免手术带来的并发症、可在超声引导下选择性地靶向特定心肌区域，以及能够在多个预设的时间点向心肌递送注射物。在熟练掌握操作技术后，心肌注射相关的并发症极为罕见，小鼠在麻醉恢复后可迅速恢复正常活动。按照本方案所述步骤操作，具备基本超声心动图经验的操作者可快速掌握这一多功能且微创的技术。

引言

心脏病是美国男性和女性死亡的首要原因，每年导致约60万人死亡¹。心血管疾病的小鼠模型对于研究其病理生理机制以及探索潜在治疗方法至关重要。将基因治疗载体、干细胞、修饰RNA及其他治疗剂递送至心肌，有助于评估这些物质在心脏病治疗中的潜力^2-7。目前，在小鼠模型中心肌递送治疗剂的选择仍十分有限⁶。在直视下进行心肌内注射是常用方法，但需要进行胸骨切开术或开胸术，且仅能作用于心脏暴露区域。尽管在进行其他实验操作（如左前降支结扎）的同时实施该方法较为方便，但因心肌内递送需侵入性手术，限制了实验设计的灵活性，并可能引入额外的手术相关效应（例如，由开胸术引起的纤维化）。已有报道采用经皮心包递送病毒载体的方法，但治疗剂的注射部位和分布不均，难以控制⁸。经皮冠状动脉注射可实现更均匀的物质分布，但在小鼠模型中实现高效且可重复的冠状动脉递送仍具挑战性。

本文介绍一种经胸壁心肌内注射技术，可在超声引导下实现治疗剂的微创、由操作者可控的靶向递送。该技术易于掌握，无需开胸或胸骨切开术，避免了相关实验并发症，同时在心肌内注射的时间点和注射位点选择上具有更高的灵活性。因此，超声心动图辅助的心肌内注射是一种在小鼠实验模型中对心肌进行干预的技术上简便且高效的方法。

方案

所有描述的步骤均在波士顿儿童医院机构动物护理和使用委员会批准的方案下进行。

1. 准备

1. 在开始注射方案之前，应通过超声心动图进行基线心脏解剖结构和功能评估，因为用于心肌内注射的最佳固定探头位置可能无法提供用于清晰显示解剖结构和评估功能的标准切面。
2. 注射装置设置如图1A-1C所示。将装有套管针头（针尖斜面朝上）的空注射器放入注射器夹具中（见图1C），并将超声探头固定在扫描头夹具中（见图1B）。松开扫描头夹具的球形锁紧关节（图1B），调整探头方向，使其与针头轴线平行，然后拧紧扫描头夹具的球形锁紧关节以固定扫描头位置。
   注意：在成年小鼠中进行注射时，使用30 G、长度为1 in/2.5 cm的针头最为合适。对于较大体积的注射可使用1 ml注射器，而对于更精确控制较小体积（5–10 µl）的情况，可使用气密性注射器。
3. 使用刮刀将足量超声耦合剂涂抹于探头尖端，确保完全覆盖探头表面。小心地移除针头套管，利用针头支架控制装置将针头推进至探头正下方，并进入超声耦合剂中以便成像。通过针头支架控制装置进行微调，使针头在超声图像中沿其全长清晰可见。如果在步骤1.4中探头已正确与针头保持平行对齐，则在使用注射控制旋钮推进或回撤针头时，针头应始终位于成像平面内（图1C）。
4. 在后续操作中，避免沿水平轴移动针头或探头，以免破坏其水平对齐状态。应通过调节针头支架的垂直（y轴）位置以及移动动物平台来定位心脏的特定注射区域。
5. 使用扫描高度控制装置（图1B）将探头从动物平台上方向上移动，以便随后将麻醉后的小鼠放置于动物平台上。此操作不会影响探头与针头长轴之间的x轴对齐。
6. 从注射器夹具中取出用于对齐的注射器，并妥善丢弃。将新的针头和注射器装载注射液至目标终体积，注意预留注射器尖端的死腔空间。务必仔细排除气泡。将装有注射液的注射器放入注射器夹具中，过程中不得改变其x轴对齐位置。使用注射控制装置将注射器完全回缩。
   注意：为便于初期培训，可使用伊文思蓝染料（1%）、台盼蓝染色液（0.4%）或荧光微球悬浮液作为注射物，以帮助操作者确认靶向注射的操作熟练度和成功率。

2. 注射

1. 打开加热平台的集成加热器，并将其设定为 37 °C。将动物平台旋转至与常规成像方向相反 180° 的位置，使麻醉管夹和动物头部最靠近操作者。这样可使心脏（位于胸部左侧）与注射器夹和针头处于同侧。注意：可能需要对动物平台进行轻微的顺时针旋转调整，以正确对齐心脏，从而获得用于注射的胸骨旁短轴成像平面（图 2A）。
2. 按照先前报道的方法⁹准备小鼠进行超声心动图检查。使用 2% 异氟烷在诱导室中对小鼠进行麻醉。使用脱毛膏去除胸部毛发，并在双眼上涂抹润滑凝胶，以防止巩膜干燥。
3. 使用扫描头高度控制装置抬高换能器（图 1B）。将麻醉后的小鼠仰卧放置在加热的动物平台上，鼻部置于输送 1–3% 异氟烷的鼻罩内（图 2A–2B）。轻柔插入直肠探头，并用胶带将四只脚爪固定在心电图电极上，同时涂抹电极凝胶以确保电接触。
   注意：必须确保适当的麻醉深度，以人道对待实验动物。在针头穿过胸壁时，心率不应发生变化，且动物无任何反应。应使用动物平台集成的稳态温度控制系统维持正常体温（37 ± 0.5 °C），因为低体温会导致相对性心动过缓、心室扩张以及可能的不适。
4. 当小鼠在动物平台上固定稳妥后，使用扫描头高度控制装置将换能器缓慢下放至去毛的胸部（图 1B）。注射时最佳的超声设置是采用胸骨旁短轴切面观察心脏，遵循标准超声心动图技术。将动物平台顺时针旋转 20–30°，以在短轴成像平面中获得最佳的声学窗口用于注射（图 2A–2B）。注意：也可通过逆时针旋转动物平台，从胸骨旁长轴切面进行注射（图 2C）。
5. 使用动物平台调节控制装置调整视野，并定位左心室心肌中任意期望的注射部位。从心尖到心底前后移动扫描视野，以精确定位左心室心肌中的目标注射位置（图 3A–3C）。注意：胸骨旁短轴乳头肌中部切面（图 3A）提供可重复的解剖标志，便于后续对注射部位进行成像追踪。注意：也可使用胸骨旁长轴切面定位预设的注射部位（图 3D）。
6. 从注射器完全回缩于注射器夹中的状态开始，通过顺时针旋转注射控制旋钮，缓慢将注射器向动物胸部推进（图 4A）。为清晰地在超声图像中同时观察心脏和针尖接近胸部的过程，应在小鼠左侧胸部涂抹充足的超声耦合剂，并通过超声心动图控制设置较宽的视野以优化声学窗口。将焦点/焦区设定在目标注射部位。轻微调节针头支架控制装置，可优化沿针体全长的成像效果。
   注意：部分超声设备配备针头引导软件功能，可在数字图像中沿针体长轴延伸一条直线至目标心肌区域（图 4B）。此类软件工具虽有帮助，但并非必需。
7. 在动物处于适当镇静状态（1–3% 异氟烷混合 0.5–0.8 L/min 纯氧）下，将针头穿过小鼠胸壁进入心肌，全程需持续密切观察斜面针尖的位置。当针尖到达目标心肌区域时停止推进（图 4C）。整个斜面针尖应牢固位于心肌内，以避免注射物泄漏至心包腔。
8. 当针尖到达理想位置后，推动注射器活塞注入试剂。注射过程应缓慢进行，持续 5–30 秒（根据注射体积而定）。单次注射量可达 50 µl，而不会影响心室功能。成功注射后，注射区域心肌可能出现短暂的回声增强现象。偶尔在心肌注射时会出现短暂（数秒）的相对性心动过缓，但可迅速自行恢复。
9. 完成注射后，立即通过逆时针旋转注射控制旋钮快速撤出针头。小鼠应在麻醉状态下继续接受数分钟的超声心动图观察，以确认心室功能保持正常且无术后并发症。如有需要，可通过调整动物平台改变针头进针角度，依次对心肌多个区域进行注射。心肌内注射完成后，将小鼠单独置于笼中，在观察下恢复麻醉。
10. 在动物未恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。接受心肌内注射的动物在完全恢复前不得与其他动物合笼。笼子应放置在温控垫上，并提供充足的饮水和小鼠饲料。预期不会出现术后不适；若干预后短时间内未能恢复正常行为，则提示可能存在并发症（见讨论部分）。
11. 心肌内注射完成后，应立即妥善丢弃针头，以最大限度降低操作者或旁观者遭受锐器伤害的风险。重复使用针头可能导致针尖钝化，增加穿刺心肌的难度，并提高并发症发生风险。

结果

小鼠心肌内注射蓝色染料或荧光微球

注射伊文思蓝染料可用于培训目的。注射后不久，处死小鼠并取出心脏，以观察注射的蓝色染料所在位置。图5显示了一次成功注射的示例，蓝色染料渗透至乳头肌中部水平的心肌区域（图5A，虚线包围区域）。伊文思蓝染料将在数小时内从组织中洗脱。如需对注射部位进行更持久的标记，可使用荧光微球，其可长期保留在注射部位。图5C-5F展示了左心室前壁和后壁的多个注射靶点。

腺病毒心肌注射

为了通过超声引导注射可视化腺病毒向心肌的递送，我们注射了一种腺病毒，该病毒携带心肌细胞特异性的大鼠肌钙蛋白T启动子¹⁰，驱动哺乳动物密码子优化的Cre蛋白¹¹表达。通过Rosa26^mTmG小鼠确定Cre介导的重组区域，在该小鼠中，Cre重组可关闭红色荧光蛋白（RFP）并激活绿色荧光蛋白（GFP）。单次注射50 µl病毒（2.8...

讨论

生物制剂可通过直接心肌内注射、心包内注射或经由血液系统的间接给药方式递送至心肌。近期在心肌梗死模型中开展的基于细胞的治疗试验已描述了通过开胸手术途径进行注射给药的方法^12-14。心肌治疗干预成功的关键因素之一在于给药途径的选择。通过心肌内递送可实现最高的局部药物浓度^15,16。在直视下进行心肌内注射是最直接的方法，可实现对心肌内部的靶向给药¹⁷。然而，该方法也是侵入性最强的，因其需要打开胸腔和心包以暴露目标心肌区域¹⁸。心脏的部分区域（如背侧表面）使用该方法难以清晰观察和准确注射。该操作的侵入性也限制了潜在的治疗性给药方案。本文中，我们介绍一种技术上简便、可靠且可重复的方法，可在超声引导下通过经皮心肌内注射安全地递送生物制剂或药物，无需承受外科开胸暴露所带来的并发症和限制。截至目前，在超过150只小鼠的注射操作中，一旦操作者掌握了技术要领，在单次操作中靶向少于四个心肌位点时，围手术期死亡率低于5%。小鼠心脏对高达200 µl的总注射体积表现出出乎意料的良好耐受性。前壁心肌是理想的注射靶区，因为该区域心肌走向与注射针长轴平行，有助于针头更稳固地停留在心...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Vevo 2100 超声成像系统	Visualsonics
Vevo 集成导轨系统 III	Visualsonics
Microscan MS400 探头	Visualsonics
Microscan MS550D 探头	Visualsonics
PrecisionGlide 注射针	BD	305128	30 G x 1 in/2.5 cm
1 cc 滑动接头注射器	Exel International	26048	或同类产品
Gastight 50 μl 玻璃注射器	Hamilton	1705
台盼蓝染液 (0.4%)	Gibco	15250	或同类产品
异氟烷	Baxter	AHN3640	或同类产品
Aquasonic 100 超声耦合剂	Parker Laboratories	(01-08)	或同类产品
聚苯乙烯微球（红色荧光）	Life Technologies	F-8842	或同类产品