雄性生殖细胞中的de novo突变可能对后代的健康产生不利影响。本文介绍了一种利用转基因啮齿类动物模型定量环境因子诱导雄性生殖细胞突变的实验方案。
本文内容
摘要
摘要
从头合成 突变主要发生在雄性生殖细胞系中，并可能对后代的健康产生不利影响。评估生殖细胞突变诱导的传统方法需要使用大量动物，因而不具可行性。因此，在化学物质测试和风险评估过程中，很少对生殖细胞的致突变性进行评估。本文描述了一种 体内 基于近期经经济合作与发展组织（OECD）批准的试验指南，利用转基因啮齿类动物模型进行雄性生殖细胞突变检测。该方法采用一种 体外 阳性选择实验以测定 体内 在暴露雄性个体的生殖细胞中，于携带报告基因的转基因λgt10载体上诱导产生突变。我们进一步阐述了如何通过控制三个实验参数——暴露持续时间（给药时间）、暴露至取样间隔时间（取样时间）以及用于分析的细胞群体——来检测从生殖细胞中回收的转基因突变，从而表征不同生精细胞类型对致突变物暴露的阶段特异性敏感性。由于单只雄性个体可提供大量生殖细胞用于检测，该方法相较于传统方法具有更高的灵敏度，所需实验动物更少，因而显著节省时间和资源。
引言
生殖细胞中偶发的DNA突变可能导致生育能力下降，若被遗传，还可能引起子代遗传性疾病或增加癌症易感性1-3大量证据表明，很大一部分 从头合成 突变源自父系生殖细胞系4，并且后代的突变数量与父亲在受孕时的年龄呈正相关5较高的男性突变比例被认为源于两性配子发生过程中年龄差异以及男性生精细胞分裂次数远多于女性卵子发生过程中卵母细胞分裂次数。2以及男性随着年龄增长DNA修复效率的逐步下降。上述所有因素共同导致了男性生殖细胞系复制错误概率的增加6然而，父系暴露于环境因素对后代发生频率的影响 从头合成 突变的影响仍不确定。然而，已知大量环境因子可在啮齿类动物中诱导生殖细胞突变7，且越来越多的证据表明，其中一些物质还可能影响人类生殖细胞系8尽管存在这些担忧，化学物质仍常规地被检测其诱导体细胞突变的能力，以满足监管要求，并且通常认为体细胞测试足以保护生殖细胞系。因此，化学物质极少被评估其诱导生殖细胞突变的能力。
生殖细胞致突变性检测在很大程度上未被纳入监管决策过程的原因之一是缺乏实用的方法学。传统的基于啮齿类动物的方法，如显性致死9和特定位点10试验，通过检测暴露亲本的胚胎或后代中突变表型来估算生殖细胞突变率。这些检测需要使用大量动物，并耗费大量时间和资源才能获得具有统计学意义的结果。
尽管近年来已出现多种用于量化生殖细胞突变的现代方法，但许多方法在实用性、效率和生物学相关性方面仍存在不足。例如，可通过单分子PCR方法定量雄性生殖细胞中扩增的简单串联重复（ESTR）位点的重复长度突变15。然而，该方法在技术上具有挑战性且操作繁琐，而且与点突变不同，高度不稳定的ESTR位点重复长度变化的生物学意义及对健康的影响仍不明确16。现代全基因组测序技术在研究可遗传突变问题时可提供大量具有生物学意义的数据4,17，但其高昂的成本、较高的错误率、为确认突变所需的相关验证工作以及生物信息学分析的挑战，仍限制了该方法在法规检测中常规应用18。
本文介绍了一种直接在转基因雄性小鼠生殖细胞中定量诱导突变的实用方法。该方案针对转基因MutaMouse模型进行描述，该模型在3号染色体的两个拷贝中均整合了多个串联重复的重组λgt10噬菌体载体拷贝，载体中含有Escherichia coli lacZ报告基因19（图1）。
该方案也适用于基于相同原理的其他转基因啮齿类动物（TGR）模型（BigBlue 小鼠和大鼠，或 lacZ 质粒小鼠， 等等）或略有不同的报告基因（gpt delta 小鼠和大鼠、TGR 模型，详见 Lambert 综述） 等20）。该方法基于最近发布并修订的OECD试验指南中所述的TGR突变试验21 我们详细阐述了由于精子发生过程的独特特性，在评估雄性生殖细胞系突变时所需考虑的特殊因素。简言之，该检测方法包括将转基因雄性小鼠暴露于致突变物质，随后设置一个取样时间窗口，使预先形成的突变损伤转化为稳定的可遗传突变。在选定的取样时间点，处死小鼠并从小鼠附睾尾部或曲细精管中收集生殖细胞。如下文所述，通过调整暴露与取样之间的时间间隔，可确定致突变物质在精子发生不同阶段的作用效应。从生殖细胞基因组DNA中分离出含有多个拷贝λ噬菌体基因组的转基因插入片段，并将其包装至空的λ噬菌体衣壳中，形成具有感染能力的λ噬菌体颗粒，随后用于感染大肠杆菌 E. coli 宿主。将感染的细菌培养在选择性培养基上，该培养基能够区分含有携带突变拷贝载体的细胞 lacZ 来自含有野生型的细胞 lacZ通过比较对照组和处理组小鼠之间突变型转基因的频率，确定暴露对雄性生殖系的致突变效应（图2，由Lambert审阅 等20). 单只小鼠可提供大量生殖细胞用于检测，使该方法的灵敏度显著优于传统方法，同时减少了所需实验动物的数量。由于无需特殊设备或专门培训，该方法为大多数现代毒理学/分子生物学实验室提供了实用且高效的生殖细胞突变检测方案。
有效应用TGR生殖细胞突变检测方法的一个基本要求是了解精子发生周期（图3）。小鼠生殖细胞从曲细精管中的干细胞发育为精原细胞、初级精母细胞、精子细胞，最终形成附睾中的成熟精子（即 精子发生过程）大约需要49天。突变可发生于该周期的各个阶段，且常具有化合物特异性。在雄性生殖细胞诱变过程中，两个尤为关键的特征是：早期减数分裂期间DNA合成的停止，以及减数分裂后期DNA修复能力的逐步丧失6，这两个过程对于大多数突变的诱导和固定至关重要。
由于精子发生具有这些独特的特征，进行TGR生殖细胞突变检测时存在三个关键的实验变量：（1）受试化合物给药时间；（2）采样时间；以及（3）用于分析的生殖细胞群体的选择（图3 和 表1）。给药时间是决定靶细胞暴露于受试化合物时长的实验变量。给药时间的长短也可用于针对精子发生过程中特定类型的细胞或特定阶段进行暴露。例如，单日给药可用于确定急性暴露对某一特定细胞类型的影响。类似地，通过采用两周的给药时间和适当的采样时间，可将暴露集中于整个精子发生阶段，例如仅针对正在进行减数分裂的精母细胞或进行有丝分裂的精原细胞。长期和亚慢性给药时间可用于评估长期暴露的影响，确保受试化合物充分的药代动力学分布，或允许弱诱变剂诱导的突变充分积累（例如，OECD试验指南中推荐的28天给药时间）。
取样时间是确定暴露时靶细胞处于精子发生哪个阶段的关键变量。取样时间决定了暴露后细胞继续经历精子发生周期的时间长短。例如，若要研究精原干细胞的影响，当采集完全成熟的精子时，需要超过>49天的取样时间；若从曲细精管中采集未成熟生殖细胞，则需超过>42天，以确保所有采集到的细胞均有足够时间从受暴露的干细胞发育而来。需要注意的是，为充分证明真正的干细胞效应，建议取样时间至少为70天，以便为毒物的药代动力学分布提供足够时间，清除在精子发生后期受暴露的细胞，并涵盖在接触高诱变性化合物后约6周可能出现的暂时性不育期22。同样，若取样时间为21天，则可确保从附睾尾采集的精子恰好在暴露结束当天完成减数分裂。
可通过附睾尾收集成熟的精子，或从生精小管中收集包含多种生精细胞类型的混合物。成熟的精子在附睾尾中停留约3天，因此在任何特定实验设计中，均可相对准确地确定精子所来源的细胞类型或生精阶段。因此，对附睾尾精子的分析可实现对特定阶段突变效应的高度靶向性研究。另一方面，从生精小管收集的细胞悬液包含处于不同发育阶段的多种生殖细胞类型，因而对突变发生时所处的生精阶段分辨能力较差。此外，从生精小管回收的细胞悬液通常以精子细胞为主，其次是精母细胞，而精原细胞和干细胞数量极少（这些比例在图3中以渐变的白色条形表示）。此外，由生精小管制备的悬液还可能含有多种体细胞。因此，由于存在大量不同类型的细胞，突变效应可能受到多种非靶细胞的影响。然而，从生精小管采集样本提供了一种经济的方法，可同时筛查多种生殖细胞类型，并便于将生殖细胞分析整合到体细胞突变检测的标准OECD试验方案中。
需要重申的是，根据研究者的需求，可通过调整给药时间、取样时间以及收集的细胞群体，来探究暴露因素在不同类型细胞及精子发生不同阶段中的效应。通过谨慎选择这些变量，可设计出针对特定机制研究的实验，或用于更广泛的监管测试目的。
为了熟练掌握该检测方法，我们建议采用单次口服100 mg/kg的N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）并设置70天的采样时间作为阳性对照。由此对尾部精子进行的分析可靶向精原干细胞（图3），在施用该高致突变剂量的ENU后，其突变频率（MF）通常较对照组升高4至5倍。需要注意的是，已知该剂量在暴露后6周可导致不育，因此可能不适合作为较短采样时间的对照剂量。该剂量在大多数体细胞组织中也可产生可检测到的突变频率升高20。下文展示的代表性结果是在急性暴露+70天的实验方案下，使用最高至100 mg/kg的三种ENU剂量处理后获得的。
方案
所有涉及动物饲养、维护和操作的实验方案均经加拿大卫生部动物护理委员会批准。
1. 动物暴露
- 将转基因雄性小鼠（8-12周龄）随机分配至对照组和处理组（每组至少5只）。通过选定的暴露途径，在选定的给药时间内对小鼠给予待测化合物及相关对照物。根据感兴趣的生精细胞类型选择适当的采样时间（图3）。
- 采样时间到达后，在异氟烷麻醉下通过颈椎脱位法（或其他适当方法）处死小鼠。通过腹部或阴囊切口小心取出睾丸，并分离附睾尾部（图4；有关附睾采集的详细视频，请参见 Duselis et al.24）。若需分析曲细精管细胞，则采集睾丸组织。将组织置于液氮中速冻，随后于-80 °C保存以备后续使用。
2. 尾部精子的分离与消化
- 将附睾尾置于冰上解冻。将解冻后的附睾尾转移至培养皿中，用手术刀或剃须刀片充分剪碎。
- 向培养皿中加入 700 µl 室温 D-PBS。使用宽口 1,000 µl 移液枪头，通过反复吸取和释放悬液，使精子从附睾尾释放，直至 D-PBS 变得浑浊（约 10 次）。注意：制备宽口移液枪头时，可从塑料枪头末端剪去 2–3 mm。
- 将悬液通过不锈钢网筛过滤至新的 1.5 ml 离心管中。用额外的 700 µl D-PBS 冲洗培养皿，并将冲洗液经同一网筛转移至该离心管中。移除网筛，将离心管置于冰上。
- 对剩余样品重复步骤 2.1–2.3。
- 以 11,000 × g 离心 3 分钟。小心弃去上清液，避免扰动沉淀。
- 加入 1.0 ml 冷的 1× 盐水柠檬酸钠（SSC）溶液。涡旋振荡，直至沉淀完全重悬。此过程可能需要多次涡旋。
- 加入 15 µl 10% SDS。剧烈颠倒或振荡 30 秒，以破坏非精子细胞。若振荡力度过轻，会导致细胞裂解不充分，从而影响下一步沉淀的形成。
- 以 11,000 × g 离心 2 分钟。若沉淀松散、呈“绒毛状”，表明步骤 2.7 中体细胞裂解不完全。若出现此情况，只需再次剧烈振荡样品并重新离心，直至形成紧密沉淀。小心弃去上清液，避免扰动沉淀。短暂离心后，用 200 µl 移液器吸除残留上清液。
- 加入 940 µl 冷的 0.2× SSC 溶液，涡旋振荡至沉淀完全重悬。该沉淀可能极难重悬，需多次涡旋。有时精子团块难以完全消除。
- 加入 120 µl β-巯基乙醇、100 µl 10% SDS、20 µl 0.5 M EDTA（pH 8）和 20 µl 蛋白酶 K（60 mg/ml，新鲜配制）。充分混匀后，在 37 °C 条件下旋转消化过夜。随后进行苯酚/氯仿抽提。
3. 从尾部精子中提取DNA的苯酚/氯仿法
注意：由于晚期精子细胞和成熟精子中的核DNA与鱼精蛋白结合，其致密程度远高于体细胞DNA，因此常规的核酸分离方法无法获得足够产量和纯度的DNA，难以使突变检测有效进行。在充分消化后，需进行多次苯酚-氯仿抽提，才能释放并纯化精子DNA（基于文献15的方法）。
- 将精子细胞消化液转移至15 ml聚丙烯管中。
- 加入2 ml苯酚:氯仿混合液（1:1），以22 rpm转速旋转离心管3分钟。
- 在1,600 × g下离心10分钟，将上层水相及界面模糊层转移至新的15 ml离心管中。
- 重复步骤 3.1.2 和 3.1.3，共 3 次，但分别将旋转时间改为 3 min、4 min 和 6 min。最后一次重复时，避免转移任何“絮状”界面层。
- 4之后th 提取，加入70 µ每1 ml水相提取物中加入1 M 3M NaAc（pH 5.2）和2 ml氯仿:异戊醇（24:1）。在22 rpm条件下旋转混匀12分钟。
- 在1,600 × g下离心10分钟，将上层水相转移至新的15 ml离心管中。
- 通过加入两倍体积的无水乙醇并轻轻侧向旋转离心管，缓慢摇动，使DNA沉淀。
- 用封口的巴斯德吸管尖端卷取DNA。将吸管尖端在70%乙醇中轻轻搅动以清洗DNA，随后室温晾干5分钟。
- 提取后，将DNA沉淀溶解于40 - 100 µl Tris-EDTA 缓冲液，pH 8。4℃保存 °C. 在4℃下让DNA溶解 °至少静置两天后，再进行下一步 lacZ 突变检测实验。如果遇到溶解度问题，可在65℃下进一步溶解DNA °C 下保存 15 分钟后使用。使用分光光度计在 A260 并确保溶解的DNA浓度在200-2,000 ng/μL之间µl.
4. 从曲细精管中分离和消化生殖细胞
- 若为冷冻样本，将睾丸置于冰上解冻（约1小时）。将睾丸转移至磨砂玻璃板上。
- 用一对镊子夹住睾丸的一端，在另一端用另一对镊子或解剖剪刀刺破上皮囊膜（图5A）。将曲细精管从穿刺孔中挤出，并弃去上皮囊膜（图5B）。
- 向去囊膜的曲细精管中加入500 µl室温D-PBS。
- 将组织碾压器（硅橡胶紧密包裹在一个可自由旋转的直径5 mm的不锈钢管上，或类似装置）倾斜放置，使其一端与玻璃板接触，角度约为5–10°（图5C）。不施加压力，轻轻前后滚动碾压器，直至曲细精管被压平且D-PBS因释放的细胞而变得浑浊（约5–10次）。
- 在曲细精管上再加入500 µl D-PBS，并轻轻额外滚动数次。
- 将细胞悬液转移至1.5 ml微量离心管中，尽量减少转移附着的管状组织（图5D）。
- 如有必要，重复步骤4.5–4.6以收集更多细胞。
- 静置1–2分钟，使可能混入的少量管状组织沉降至管底。将上清D-PBS转移至新的1.5 ml离心管中，留下沉淀的管状组织（保留约100 µl D-PBS）。可取少量该悬液在显微镜下（相差模式）观察，以评估细胞群体的组成。
- 以11,000 × g离心30秒，使细胞沉淀。小心倾去上清液，勿扰动沉淀。如需保存，此时可将细胞沉淀于-80 °C冷冻。
- 如需使用，将细胞解冻。转移至15 ml聚丙烯管中，用5 ml裂解缓冲液（10 mM Tris pH 7.6，10 mM EDTA，100 mM NaCl，1 mg/ml蛋白酶K，1% SDS）重悬细胞。在37 °C摇床中孵育过夜进行消化。
- 继续进行苯酚/氯仿抽提步骤。
5. 从生精小管生殖细胞中提取DNA的苯酚/氯仿法
注意：由于此类细胞尚未经历核浓缩过程，因此采用较为温和的提取方法来分离曲细精管生殖细胞的DNA。
- 向过夜消化的曲细精管细胞中加入 5 ml 苯酚:氯仿混合液（1:1），在 22 rpm 条件下旋转 20 分钟。
- 在 1,600 × g 条件下离心 10 分钟，转移上层水相至新的 15 ml 离心管中，注意避免接触“模糊”的中间界面层。
- 每 5 ml 水相提取物中加入 100 µl 5 M NaCl（通常可回收约 5 ml）。
- 加入 5 ml 氯仿:异戊醇（24:1），在 22 rpm 条件下旋转 12 分钟。
- 在 1,600 × g 条件下离心 10 分钟，将上层水相转移至新的 15 ml 离心管中。
- 加入两倍体积的无水乙醇，通过轻柔旋转和倒置离心管使 DNA 沉淀。
- 用封口的巴斯德吸头尖端缠绕收集 DNA，将吸头尖端在 70% 乙醇中轻轻搅动以清洗 DNA，随后空气干燥 5 分钟。
- 将 DNA 溶解于 40–100 µl Tris-EDTA 缓冲液（pH 8.0）中，4 °C 保存。在进行 lacZ 突变检测前（见步骤 3.9），需在 4 °C 下至少溶解两天。若溶解困难，可在使用前于 65 °C 进一步溶解 15 分钟。使用分光光度计在 A260 处测定 DNA 浓度，并确保浓度在 200–2,000 ng/µl 范围内。
6. LacZ 突变检测实验
细菌或真菌污染可能影响包装效率以及噬菌斑的生长和计数。因此，必须采取适当的无菌措施进行 lacZ 检测，以防止包装反应、宿主培养物和培养基受到污染。
- 检测前一天：制备底层琼脂与过夜培养物
- 每个样本需要8个平板（4个用于筛选突变体，4个用于测定滴度），每个平板含8 ml底层琼脂即，每样品64 ml）。底层琼脂在突变株和滴度测定中均相同 计数平板。根据待处理样本的数量准备足够的底层琼脂。在无菌条件下将琼脂倒入90 mm的培养皿中（每皿8 ml），静置使其凝固。注意：底层琼脂平板可提前1周制备。
- 在50 ml离心管中加入10 ml LB肉汤和100 µ20% 麦芽糖溶液，25升 µl 氨苄青霉素（20 mg/ml）和 20 µl 卡那霉素（5 mg/ml）。接种于 E. coli (lacZ-/galE-)25 并在37℃过夜培养 °240 rpm 摇床培养。
- 第1天：传代培养细胞
- 通过将过夜培养物以新鲜LB培养基（不含抗生素）进行1:100稀释来制备亚培养物。每个样品需要8 ml亚培养液体积。37℃培养 °C，240 rpm 振荡培养约 3.5 小时，直至 OD600 = 1.
- 当OD600 = 1，将细胞悬液均匀分装至50 ml离心管中，在15℃下以1,300 × g离心 °C 下孵育 10 分钟。移除上清液，并将细胞重悬于原体积一半的溶液中（即，每样本4 ml）含10 mM MgSO₄的LB培养基4将细胞置于一旁，待需要时再使用［步骤6.2.4.3］。
- 第1天：将DNA包装进λ噬菌体颗粒
- 将水浴加热至30℃ °C.
- 使用宽孔径10 µl 移液器吸头，转移 4 µ将DNA加入1.5 ml离心管中。注意：此步骤可提前一天或更长时间进行，以减少后续操作的准备时间。
- 从噬菌体包装提取试剂盒中取出第一管（红色）并预热（每2个样本使用1管）。短暂离心，使提取液聚集于管底。
- 转移 4.8 µ将第一管中的包装提取物 l 加入 DNA 样本中，并用移液器吸头轻轻搅拌混合。将试管中的样本短暂离心。在 30 ℃ 下孵育 1.5 小时 °C 水浴
- 预热第二个（蓝色）包装提取管（约每15个样本使用1管）。短暂离心，使提取液聚集于管底。
- 转移 4.8 µ将第二个管中的包装提取物 l 加入 DNA 样本中，轻轻搅拌混合。将管中的样本短暂离心。在 30 ℃ 下额外孵育 1.5 小时 °C 水浴
- 将包装好的噬菌体颗粒重悬于 500 µ加入l SM缓冲液，以20 rpm转速旋转混匀30分钟。
- 旋转后，短暂涡旋混匀样品，然后在11,000 × g离心30秒，使样品聚集于离心管底部。噬菌体颗粒已准备好用于感染[步骤6.2.4]。
- 第1天：制备顶层琼脂
- 为滴定分别制备顶层琼脂 平板和突变体筛选平板。每个样本需要4个滴度 平板和4个突变体平板。每个平板需要8 ml顶层琼脂。加入选择性试剂苯基-β仅向突变体筛选顶层琼脂中加入 -D-半乳吡喃糖苷（P-Gal）。两种顶层琼脂均需提前配制（在检测当天），并保持在 50 ℃ °加入 MgSO₄ 前的 C4 向两种顶层琼脂中加入P-Gal，并将其涂布于突变体筛选琼脂。
- 第1天：用包装好的噬菌体感染细胞并进行铺板
- 每个样本标记两个50 ml离心管：每个样本一个“突变体”管和一个“滴定”管
- 每份样本标记8个琼脂平板：每份样本4个“突变体”平板和4个“滴度”平板
- 将重悬的细胞（来自步骤6.2.1.2）每管分装2 ml。
- 加入500 µ将步骤6.2.2.8中获得的噬菌体颗粒加入标记为“突变体”的50 ml离心管（含细胞）中。轻轻混匀，室温下孵育30分钟，使噬菌体颗粒感染细胞。
- 孵育30分钟后，短暂涡旋震荡感染的细胞，转移15 μL µ将感染的细胞加入相应的50 ml“滴定”管（含细胞）。
- 测定滴度接种 样品，加入 30 ml 温热（50 °C) 将“titer”顶层琼脂（不含P-Gal）加入至“titer”50 ml离心管中。立即将琼脂/细胞混合物分装至4个“titer”平板中（每板约8 ml）。操作需迅速，以防顶层琼脂在移液器中冷却凝固，并尽量避免引入气泡。
- 接下来接种“突变体”样品。确保在“突变体筛选”顶层琼脂中加入P-Gal。将30 ml温热的含P-Gal的“突变体筛选”琼脂加入“突变体”50 ml离心管中。立即将琼脂-细胞混合物分装至4个“突变体”平板中（每板约8 ml）。
- 让平板静置凝固（约15分钟），然后倒置并在37℃培养 °C 过夜。
- 第2天：噬斑计数
- 过夜孵育后，计数突变体和滴度的噬斑数量 平板。对于斑块数量较多的情况，可仅计数平板的一部分以估算总数（例如，通常 ¼ 滴度平板上的噬斑数量应在100-200之间。计数平板部分区域时，每块平板至少应计数100个噬斑。
- 计算每毫升的噬菌斑形成单位（PFUs）数量 µ细胞的数量。这是通过将“滴定”平板上的噬斑数除以接种的细胞体积（15 µl)。
- 使用PFU数量/µl 用于估算接种于“突变体”平板上的感染细胞总体积中的PFU总数（PFUs/µl *[2 ml 细胞 + 0.5 ml 包装好的噬菌体颗粒 – 15 µ滴度测定 平板]）
- 通过将4块“突变”平板上计数的突变噬斑总数除以从“滴定”平板确定的感染细胞总体积中估计的PFU总数，来计算突变频率（MF）。
- 当自发的 lacZ MF 的数量级为 3 × 10-5 在对照组中，对于MutaMouse生殖细胞，OECD指南建议每只动物至少筛选125,000至300,000个非突变噬斑形成单位（PFU），以获得可靠的基线信号。其他转基因模型的自发突变频率可能较低，此时需要筛选更多的PFU。可通过统计功效检验来确定获得理想分辨能力所需的最小PFU数量和动物数量。若多个重复实验所得突变频率无显著差异，其数据可合并使用，以满足最低PFU数量要求。
7. 统计学
分析的实验单位是小鼠。该实验产生的数据通常不符合正态分布。因此，应根据数据的分布特征选择相应的统计分析方法。
注意：如果对数据进行适当的转换以均衡观测范围内响应变量的方差，则可采用标准参数分析方法（例如，ANOVA）。泊松回归或二项式回归分析通常更为合适。也可采用非参数分析方法。我们通常采用 SAS v.9.2（SAS Institute，Cary，NC）中的广义线性模型过程（即，Proc GENMOD）进行泊松回归分析，如 Lemieux et al26 所述。
结果
每只动物平均斑块数为 200,000 个斑块时，我们通常观察到平均背景突变频率（MF）约为 2.8 x 10-5 在雄性生殖细胞中，标准差为1.7 x 10-5 在我们的对照组中（基于八次独立实验的数据）。根据该斑块计数、背景水平和方差，每组 n = 5 只动物的剂量组足以以足够的检验效能检测到突变频率（MF）两倍的升高 >0.8.
结果通常以表格或图形形式报告。表2和图6展示了经单次急性口服剂量为0、25、50和100 mg/kg的N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）处理后，在第70天采样获得的MutaMouse雄性小鼠（每组n = 5）尾部精子的代表性结果。该70天的采样周期允许检测暴露时处于精原干细胞阶段的精子中发生的突变事件（图3）。图7显示了突变板和滴定板上典型的噬斑密度。如表2和图6所示，急性ENU暴露导致精原干细胞的突变频率（MF）出现显著的剂量依赖性升高。低剂量组的MF较对照组显著升高了2.6倍，对照组的基础MF为2.6 × 10-5。高剂量组的诱导效应达到最大，MF较对照组升高了4.4倍。
在Douglas对生精小管生殖细胞进行的该检测示例中可见 等.27，其中MF是在连续5天每天腹腔注射50 mg/kg ENU后，在不同时间点测定生精小管生殖细胞中的突变频率。该研究发现，精原细胞中的突变频率在处理后15天内逐渐升高，之后保持稳定。
| 暴露方案 | 采集组织 | 采集的细胞类型（靶细胞） | 暴露开始时靶细胞所处阶段 | 暴露期间经历的阶段 |
| 急性+70 | 尾部 | 成熟精子 | 干细胞 | 干细胞 |
| 14+21 | 尾部 | 成熟精子 | 精原细胞 | 精子细胞 |
| 14+35 | 尾部 | 成熟精子 | 干细胞 | 初级精母细胞 |
| 28+3 | 尾部 | 成熟精子 | 初级精母细胞 | 初级精母细胞 精子细胞 成熟精子 |
| 小管 | 干细胞 | 干细胞 | 干细胞 | |
| 精原细胞 | 精原细胞 | 精原细胞 | ||
| 初级精母细胞 | 初级精母细胞 | |||
| 精子细胞 | 精子细胞 | |||
| 28+49 | 尾部 | 成熟精子 | 干细胞 | 干细胞 |
| 小管 | 干细胞 精原细胞 初级精母细胞 精子细胞 | 干细胞 | 干细胞 |
表1. 不同实验设计下转基因啮齿类动物突变检测法所靶向的生精细胞类型及生精过程的各个阶段。
| 剂量组 | 动物编号 | 突变PFU | 总PFU | 突变频率 (x 10-5) | 平均突变频率 (x 10-5) | 倍数变化 | p值 |
| 对照组 | 1 | 5 | 180245 | 2.8 | 2.6 | 1.0 | - |
| 2 | 4 | 137835 | 2.9 | ||||
| 3 | 11 | 385672 | 2.9 | ||||
| 4 | 2 | 431396 | 0.5 | ||||
| 5 | 6 | 152413 | 3.9 | ||||
| 25 mg/kg | 6 | 17 | 162353 | 10.5 | 6.9 | 2.6 | 0.0002 |
| 7 | 14 | 150094 | 9.3 | ||||
| 8 | 4 | 154401 | 2.6 | ||||
| 9 | 9 | 154401 | 5.8 | ||||
| 10 | 12 | 196978 | 6.1 | ||||
| 50 mg/kg | 11 | 17 | 155727 | 10.9 | 9.3 | 3.6 | <0.0001 |
| 12 | 11 | 135847 | 8.1 | ||||
| 13 | 25 | 193499 | 12.9 | ||||
| 14 | 12 | 133859 | 9.0 | ||||
| 15 | 14 | 252807 | 5.5 | ||||
| 100 mg/kg | 16 | 26 | 170968 | 15.2 | 11.5 | 4.4 | <0.0001 |
| 17 | 28 | 234584 | 11.9 | ||||
| 18 | 10 | 145289 | 6.9 | ||||
| 19 | 35 | 292236 | 12.0 | ||||
| 20 | 22 | 190848 | 11.5 |
表2. 转基因雄性小鼠的精原干细胞阶段急性暴露于ENU后，在70天时采集的尾部精子中lacZ基因的突变频率（给药时间为1天，采样时间为70天）。PFU = 空斑形成单位，MF = 突变频率。
图1. λgt10噬菌体构建体的示意图。
图2. 转基因啮齿类动物生殖细胞突变检测的流程示意图。
图3. 小鼠精子发生过程的示意图，以及不同实验设计下转基因啮齿类动物突变检测法所靶向的细胞类型和时相。 注：渐变的白色条带表示从生精小管制备的细胞悬液中各类细胞的相对比例（即 精子细胞 > 初级精母细胞 > 精原细胞 > 干细胞）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4. 小鼠附睾尾的采集。A) 沿阴囊方向在腹部做一切口。B) 辨认附睾脂肪垫。C) 轻柔牵拉脂肪垫，以引出睾丸和附睾。D) 定位并切除附睾尾。
图 5. 来自曲细精管的生殖细胞悬液的制备。A) 在睾丸的上皮囊上做一切口，暴露曲细精管。B) 将曲细精管从囊中挤出。C) 以5-10°角轻轻将组织碾压器在管状结构上滚动，以释放其中所含的生殖细胞。D) 收集生殖细胞悬液用于后续处理。
图6. 急性暴露于ENU的MutaMouse精子中lacZ突变频率的图形表示（n = 5）。 每个三角形代表一只动物的突变频率（MF）。* p <0.05，由泊松回归分析确定。
图7. 转基因啮齿类动物突变检测实验中形成的噬菌斑在大肠杆菌（E. coli）宿主菌草坪上的代表性琼脂平板。A）“突变型”平板上的噬菌斑极少（以箭头标示），尤其是在对照剂量组中，某些平板上偶尔甚至无任何噬菌斑。B）“滴度”平板上则可出现数百个噬菌斑。
讨论
与传统方法相比，TGR 生殖细胞突变检测法提供了一种更快捷、更经济且更灵敏的手段，用于定量诱导的 体内 生殖细胞突变。通过直接在精子中评估转基因突变频率（MF），而非通过后代进行评估，显著减少了评估任何单一化合物生殖系致突变性所需的动物数量、时间和资源。在灵敏度方面，我们仅使用每剂量组5只动物，即可检测到暴露于25 mg/kg ENU后，精原干细胞突变频率显著增加2.6倍。相比之下，特定位点检测法在相同剂量下，即使使用了>3,000只暴露组小鼠和>500,000只对照组小鼠，仍未能检测到突变频率的任何显著变化28。
除了适用于机制性和监管性研究外，该方法还为体细胞与生殖系突变率之间的比较研究提供了机会。最近的证据表明，某些试剂可在低于诱导体细胞突变所需浓度的水平下诱导生殖细胞突变。例如，长期暴露于丙烯酰胺（一种食品致癌物）的代谢产物N-羟甲基丙烯酰胺，可在不影响红细胞微核频率（体细胞细胞遗传损伤的传统检测指标）的情况下，增加小鼠显性致死性生殖细胞突变的发生频率12。此外，小鼠暴露于主流和侧流烟草烟雾后，在不增加血液微核频率的剂量下，精子中串联重复DNA位点的突变频率升高13。这些发现挑战了“体细胞遗传毒性检测总能保护生殖细胞系”的假设，并强化了对更高效且经济的方法以量化生殖细胞突变频率的需求。然而，关于优先作用于生殖细胞的诱变剂的证据仍然不足，这主要归因于缺乏可用于比较体细胞与生殖细胞组织中突变率的数据。TGR突变检测技术可利用相同的转基因在多种组织中平行测试并比较诱导突变率。因此，采用TGR检测进行突变比较研究将有助于填补围绕生殖细胞优先效应可能性所存在的数据空白14。
对于监管测试而言，同时评估体细胞和生殖细胞突变将通过减少所需实验动物数量而提高效率。经济合作与发展组织（OECD）关于体细胞突变的指导原则推荐给药28天后进行为期3天的采样（28+3）。在此时间点分析尾部精子可能灵敏度较低，因其主要针对处于精子发生过程中初级精母细胞和精子细胞阶段的细胞（图3）。这些阶段的细胞不合成DNA，并且逐渐丧失DNA修复能力6。此外，在此时间点采集尾部精子将无法检测到精原细胞和干细胞中发生的突变。因此，为了整合到28+3实验设计中，OECD指导原则建议从生精小管中采集生殖细胞。该混合细胞群体包含来源于具备DNA合成和修复能力的细胞类型的细胞，包括干细胞，并且涵盖了精子发生的大多数阶段。然而，由于这些细胞具有异质性，对生精小管细胞的分析无法提供特定阶段的信息。此外，人们担忧非靶细胞的存在可能影响观察到的突变频率（例如，由于突变的体细胞污染导致错误判断为生殖细胞致突变阳性，或因DNA修复缺陷的生殖细胞稀释了突变信号）。目前尚无充分数据可确定在28+3时间点获得的生精小管细胞结果是否具有与后期时间点尾部精子相当的灵敏度和特异性。本实验室目前正在比较不同采样时间点采集的生精小管细胞与尾部精子中的诱导突变频率，以解决这一问题。我们注意到，OECD指导原则建议对于肝脏等分裂缓慢的组织可采用28天的采样时间，该方案也可能适用于生殖细胞分析。然而，现有数据仍不充分，目前我们尚无法推荐一种单一的实验设计方案，用于在监管测试中利用TGR突变检测法同时分析体细胞和生殖细胞。
需要注意的是，该检测的一个特点是突变事件是在非小鼠来源的转基因上进行评估的。然而，已有充分证据表明，该转基因对环境致突变物的反应方式与内源基因相似20。此外，由于独立突变事件的确切来源难以分辨，结果通常以突变频率（mutant frequency）的形式报告（而非突变频率，mutation frequency）。若通过DNA测序对克隆扩增（i.e. 单个突变细胞的分裂与增殖，可导致转基因突变体观察频率升高）进行校正，则可确定实际的突变频率。对突变的转基因进行测序可用于表征lacZ基因的突变，并识别可能源于克隆扩增事件的突变体，尽管这会显著增加分析所需的时间和成本。除了lacZ基因外，λgt10转基因载体还携带一个可选的温度依赖性突变报告基因：一种λ cII基因的变体，其长度较短（294 bp，相比之下lacZ为3021 bp，图1），更易于测序29。测序还可用于分析诱导突变谱，从而揭示待测化合物的突变作用机制。克隆扩增的一个极端例子是“ jackpot”突变的发生（i.e. 在器官发育早期阶段发生的转基因突变，导致突变频率（MF）显著升高，有时可比背景值高出数百至数千倍）。携带“jackpot”突变的动物或组织应从分析中剔除。
我们所描述的检测方法可广泛适用于其他TGR模型，例如BigBlue小鼠和大鼠，以及lacZ质粒小鼠，这些模型均携带类似的突变报告载体（综述见20）。迄今为止，采用类似方法开展的绝大多数生殖细胞研究几乎都集中于已被充分表征的诱变剂，如ENU和辐射（综述见30）。随着经济合作与发展组织（OECD）最近发布TGR检测的试验指南，预计该检测方法在化学物质筛选和法规评估中的应用将日益广泛。将TGR生殖细胞突变检测纳入法规测试组合，将填补现有空白，从而实现对生殖细胞中突变诱导的高效评估11。此外，该检测几乎可用于测量任何组织中的突变频率（MF），为比较体细胞与生殖细胞在相同遗传终点下对环境因子诱导突变的相对敏感性提供了合适的方法。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由加拿大生物技术监管体系（CRSB）和化学品管理计划（CMP）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MutaMouse | 科文斯 | - | |
| E. coli (lacZ-/galE-) | 科文斯 | - | 参见文稿中的参考文献25 |
| 氯仿 | Caledon | 3001-2-40 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS） | Gibco | 14190-250 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA），0.5 M，pH 8 | Sigma-Aldrich | 03690 FLUKA | |
| 异戊醇 | 卡利登 | 2/10/7900 | |
| Lennon LB 肉汤基础培养基 | Invitrogen | 12780-029 | |
| 不锈钢网滤器 | Sigma-Aldrich | S3770 | |
| Transpack 包装提取物 | 安捷伦科技 | 200220 | |
| β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 无水乙醇（EtOH） | 商业酒精 | - | |
| 氨苄青霉素 | Gibco | 11593-027 | 在 dH₂O 中配制 20 mg/ml 溶液2O |
| 卡那霉素 | Gibco | 11815-024 | 在 dH₂O 中配制 5 mg/ml 溶液2O |
| 苯酚 | Invitrogen | 15509-097 | 按照制造商说明，用 0.1 M Tris-HCl 饱和 |
| 苯基-β-D-半乳吡喃糖苷（P-Gal） | Sigma-Aldrich | P6501 | 将3 g溶于10 ml二甲基甲酰胺中 |
| 蛋白酶K | Invitrogen | 25530-031 | 制备 60 mg/ml 的 dH 溶液2使用前立即加入20 µ每样本升 |
| 乙酸钠（NaAc） | Fisher Scientific | BP333-500 | 配制 3 M 溶液，pH 5.2 |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma-Aldrich | L4390 | 在 dH₂O 中配制 10% 溶液2O |
| 1 M MgSO₄4 | 24.6 g MgSO₄4·7H2每100毫升去离子水2O，高压灭菌，室温保存，最长1年 | ||
| LB肉汤 | 5.0 g LB 培养基基础，6.4 g NaCl 每升 dH₂O2O. 高压灭菌并冷却 | ||
| 氯化钠柠檬酸盐（SSC） | 150 mM NaCl，15 mM 柠檬酸三钠，pH 7.0 | ||
| SM 缓冲液 | 5.8 g NaCl，2.0 g MgSO₄4·7H2O，每升去离子水含50 ml 1 M Tris-HCl（pH 7.5）、5.0 ml 明胶（2% w/v）2O，高压灭菌，室温保存，最长1年 | ||
| TE缓冲液 | 10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8 |
参考文献
- Ahmadi, A., Ng, S. C. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa. J. Exp. Zool. 284 (6), 696-704 (1999).
- Crow, J. F. The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation. Nat. Rev. Genet. 1 (1), 40-47 (2000).
- Nelson, K., Holmes, L. B. Malformations due to presumed spontaneous mutations in newborn infants. N. Engl. J. Med. 320 (1), 19-23 (1989).
- Kong, A., et al. Rate of de novo mutations and the importance of father's age to disease risk. Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).
- Michaelson, J. J., et al. Whole-genome sequencing in autism identifies hot spots for de novo germline mutation. Cell. 151 (7), 1431-1442 (2012).
- Marchetti, F., Wyrobek, A. J. DNA repair decline during mouse spermiogenesis results in the accumulation of heritable DNA damage. DNA Repair (Amst). 7 (4), 572-581 (2008).
- Marchetti, F., Wyrobek, A. J. Mechanisms and consequences of paternally-transmitted chromosomal abnormalities. Birth Defects Res. C. Embryo. Today. 75 (2), 112-129 (2005).
- Demarini, D. M. Declaring the existence of human germ-cell mutagens. Environ. Mol. Mutagen. 53 (3), 166-172 (2012).
- Epstein, S. S. Use of the dominant-lethal test to detect genetic activity of environmental chemicals. Environ. Health. Perspect. 6, 23-26 (1973).
- Russell, W. L. X-ray-induced mutations in mice. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 16, 327-336 (1951).
- Singer, T. M., Yauk, C. L. Germ cell mutagens: Risk assessment challenges in the 21st century. Environ. Mol. Mutagen. 51 (8-9), 919-928 (2010).
- Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, P., Eriksson, S., Tornqvist, M. Acrylamide: A cooking carcinogen. Chem. Res. Toxicol. 13 (6), 517-522 (2000).
- Witt, K. L., et al. Mouse bone marrow micronucleus test results do not predict the germ cell mutagenicity of N-hydroxymethylacrylamide in the mouse dominant lethal assay. Environ. Mol. Mutagen. 41 (2), 111-120 (2003).
- Marchetti, F., Rowan-Carroll, A., Williams, A., Polyzos, A., Berndt-Weis, M. L., Yauk, C. L. Sidestream tobacco smoke is a male germ cell mutagen. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), 12811-12814 (2011).
- Yauk, C. L., Dubrova, Y. E., Grant, G. R., Jeffreys, A. J. A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus. Mutat. Res. 500 (1-2), 147-156 (2002).
- Niwa, O. Indirect mechanisms of genomic instability and the biological significance of mutations at tandem repeat loci. Mutat. Res. 598 (1-2), 61-72 (2006).
- Campbell, C. D., et al. Estimating the human mutation rate using autozygosity in a founder population. Nat. Genet. 44 (11), 1277-1281 (2012).
- Beal, M. A., Glenn, T. C., Somers, C. M. Whole genome sequencing for quantifying germline mutation frequency in humans and model species: Cautious optimism. Mutat. Res. 750 (2), 96-106 (2012).
- Shwed, P. S., Crosthwait, J., Douglas, G. R., Seligy, V. L. Characterisation of MutaMouse lambdagt10-lacZ transgene: Evidence for in vivo rearrangements. Mutagenesis. 25 (6), 609-616 (2010).
- Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat. Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
- OECD. OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. , (2011).
- Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice. Toxicol. Lett. 17 (1-2), 77-80 (1983).
- Russell, L. B. Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse. Genetica. 122 (1), 25-36 (2004).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Harvesting sperm and artificial insemination of mice. J. Vis. Exp. (3), 184(2007).
- Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254(1992).
- Lemieux, C. L., et al. Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse. Environ. Mol. Mutagen. 52 (9), 756-765 (2011).
- Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (16), 7485-7489 (1995).
- Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. Dose--response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (11), 3589-3591 (1982).
- Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. The cII locus in the MutaMouse system. Environ. Mol. Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
- Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays. Mutat. Res. 598 (1-2), 164-193 (2006).
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