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方法文章

手术获取、分离与 体外 用于组织工程应用的人前交叉韧带来源细胞的扩增

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DOI：

10.3791/51597

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2014年4月30日

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1Department of Medical Microbiology, Immunology & Cell Biology, Southern Illinois University School of Medicine, 2Division of Orthopaedics and Rehabilitation, Department of Surgery, Southern Illinois University School of Medicine, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Biomedical Engineering Program, Southern Illinois University Carbondale, 4University of Illinois at Springfield

本文内容

摘要

为将来作为修复前交叉韧带（ACL）部分撕裂的补片应用，从重建手术中获取的组织分离出人源ACL细胞，并进行扩增 体外 并在组织工程支架上培养。随后进行细胞黏附与形态学分析，以确认支架表面的生物相容性。

摘要

前交叉韧带（ACL）损伤是活动人群中常见的问题。即使是这种关节内膝关节韧带的部分撕裂，也会导致生物力学缺陷，影响关节功能和稳定性。目前对于部分ACL撕裂的治疗方案包括从非手术的保守治疗到多种手术方法，例如：热力修复、单束修复、完全重建以及对原有韧带受损部分的重建。然而，几乎没有研究能够证明其中任何一种治疗方法具有持续的优越性，在许多情况下，患者仍表现出持续的不稳定及其他合并症。

本研究的目的是确定一种潜在的细胞来源，用于开发一种组织工程补片，以应用于部分撕裂的前交叉韧带（ACL）修复。我们建立了一种新型方案，用于扩增来自接受ACL重建手术患者的细胞。为分离细胞，将ACL重建过程中获取的人前交叉韧带（hACL）组织切碎后，在胶原酶溶液中进行消化。细胞扩增使用添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的DMEM/F12培养基进行。扩增后的细胞以含有DMSO、FBS和扩增培养基的冻存液在-80 ºC或液氮中保存。解冻后，将hACL来源的细胞接种至组织工程支架PLAGA（聚乳酸-共-乙醇酸）以及对照组组织培养聚苯乙烯（TCPS）上。培养7天后，通过扫描电子显微镜（SEM）比较细胞在PLAGA与对照组TCPS表面的黏附情况。同时采用免疫荧光染色法评估细胞形态。SEM显微图像显示，细胞在PLAGA和TCPS表面均能生长并牢固黏附，并在第7天时在整个表面达到融合状态。免疫荧光染色结果显示，两种表面上的细胞均呈现正常、无应激的形态特征。该技术在前交叉韧带再生与重建应用中具有良好的前景。

引言

前交叉韧带（ACL）是膝关节内常见的损伤性关节内韧带。在美国，每年约报告20万例前交叉韧带（ACL）损伤。超过75%的前交叉韧带损伤患者选择骨科重建手术1,2,3,4。由于前交叉韧带自身愈合能力较差，通常需要手术干预3。前交叉韧带重建通常采用自体肌腱移植或同种异体肌腱移植。自体移植和同种异体移植被视为重建的金标准，因其成功率高；而另一种治疗选择——原发性缝合修复——失败率高达94%5,6,7。

前交叉韧带（ACL）部分撕裂占所有ACL撕裂的10%至28%8。在一项前瞻性研究中，Noyes 等估计，对于ACL受累超过一半的部分撕裂患者，经非手术治疗后有50%进展为完全性ACL功能不全9。其他研究报道，持续性关节不稳定和功能下降较为常见，仅有不到30%的患者能够恢复至受伤前的活动水平9,10,11,12,13。目前治疗选择有限，包括保守治疗、残余ACL的热收缩处理或ACL重建手术。近年来，增强型原位修复技术受到越来越多关注。这些技术利用生物材料来增强原位缝合修复的效果14。近期研究尝试获取类似间充质干细胞的源自人前交叉韧带（hACL）的干细胞，以克服移植物来源的局限性31,32，但这些细胞的有效性和可靠性仍不明确。在组织工程应用中，理想的细胞来源似乎是源自hACL的非间充质型成纤维细胞。

当前研究的重点是为组织工程支架寻找合适的基质材料和细胞来源。在前交叉韧带（ACL）重建手术中，撕裂的ACL通常作为手术废弃物被丢弃，然而，这种受损韧带可能是获取构建和优化理想组织工程ACL替代物所需细胞的优质来源。本实验室已建立了一套从撕裂的ACL中分离和培养韧带来源细胞的实验方案。 体外 扩增这些收获的源自人前交叉韧带（hACL）的细胞。利用一种负载了源自hACL细胞的工程化二维基质，我们设计了一种补片，有望用于增强部分前交叉韧带修复，并强化撕裂的韧带。

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方案

1. 手术取材

注意：已获得机构审查委员会（IRB）批准，可在前交叉韧带（ACL）重建手术期间采集ACL残端组织。由于所使用的ACL残端通常作为手术废弃物丢弃，因此获得了IRB豁免。共采集了20名患者的ACL残端组织。

  1. 根据所在机构的规程，为患者实施全身麻醉并给予术前抗生素。
  2. 应用止血带并充气至高于收缩压 100 mmHg。
  3. 将患者置于仰卧位，在膝关节屈曲 30–45° 时做一水平前外侧切口，建立 5 mm 入路，以 30° 角将关节镜套管和镜头插入髌上囊。
  4. 进行常规诊断性关节镜检查。
  5. 进入髁间窝，清除覆盖于撕裂前交叉韧带（ACL）上的膜状滑膜组织。
  6. 使用 4.5 mm 刨削刀和消融器识别前交叉韧带残端。
  7. 使用直喙钳从残留的前交叉韧带残端多点取样。
  8. 将样本保存在无菌容器内的生理盐水中。
  9. 将样本送至病理科进行解码，并最终递送至实验室设施。
  10. 按机构规程对患者进行复苏及术后护理。

2. 组织消化与人前交叉韧带分离

  1. 将病理科提供的前交叉韧带组织转移至含有无菌生理盐水/PBS（磷酸盐缓冲液）的培养皿中。
  2. 使用无菌剪刀将组织剪碎成 1–2 mm3 的小块，并用生理盐水至少清洗 3 次。
  3. 用含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM/F-12（50/50，1×）培养基配制的 0.4% 胶原酶，在 37 °C 条件下消化剪碎的组织 4–6 小时。
  4. 在 1,000 × g 条件下离心 5 分钟，然后将细胞重悬于培养基中。
  5. 用培养基清洗细胞 2–3 次，随后接种于 T-25 培养瓶中培养 2–3 天。

3. 细胞扩增、冻存与复苏

  1. 使用光学显微镜观察在T-25培养瓶中培养2-3天的细胞。
  2. 将细胞维持在37 °C条件下，培养基为添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的DMEM/F-12（50/50，1x）培养液。
    注意：当细胞出现贴壁现象并呈现标准形态时，需更换培养基。使用光学显微镜观察细胞状态。
  3. 在第7天用PBS洗涤汇合的细胞（约1.3 × 106 个细胞/瓶）。加入胰蛋白酶（0.5 g/L），于37 °C孵育5分钟。向悬浮细胞中加入培养基以中和胰蛋白酶。将细胞-培养基混合液等分为三份，分别接种至三个T-25培养瓶中。
  4. 用PBS洗涤汇合的细胞，加入胰蛋白酶（0.5 g/L），并将细胞重悬于冷冻保存液中，该冷冻液由DMSO、FBS和完全培养基（DMEM/F-12培养基 + 10% FBS + 1% P/S）按1:2:7的比例配制而成。
  5. 若细胞将在一个月内使用，可将冻存管置于-80 °C保存；若需长期储存，则应置于液氮中保存。
  6. 再次使用时，在37 °C水浴中解冻冻存管。
    注意：通常细胞存活率为90-95%。

4. 组织工程二维聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLAGA）支架的制备

  1. 在20 ml闪烁瓶中，将1 g PLAGA溶于12 ml二氯甲烷中，并以恒定速度（800 rpm）涡旋搅拌8小时。
    注意：详见Gupta et al.15
  2. 将溶解后的溶液转移至铺有氟化保护纸的玻璃培养皿中。
  3. 将培养皿置于真空罩下30分钟。随后将培养皿于-20 °C放置过夜，再转移至室温。将培养皿放入冷冻干燥机中，以确保溶剂完全蒸发，从而获得聚合物薄膜。
  4. 将聚合物薄膜置于干燥器中24小时。
  5. 将聚合物薄膜切割成直径为12 mm的圆形片状，储存于干燥器中备用。

5. 扫描电子显微镜（SEM）

  1. 用 PBS 清洗接种于对照 TCPS 和 PLAGA 支架上的细胞（每片 50,000 个细胞），接种后第 7 天进行。
  2. 使用1.5%戊二醛溶于0.1 M卡考基酸缓冲液固定细胞，以及2.5%四氧化锇4 在0.1 M卡考得缓冲液中进行后固定。
  3. 用0.1 M卡考基酸盐缓冲液洗涤固定后的细胞。使用梯度乙醇脱水（50%、70%、80%、90%和100%）对固定细胞进行脱水处理，每种浓度处理15分钟，随后在六甲基二硅氮烷（HMDS）中过夜进一步干燥。
  4. 使用按钮阀释放SEM溅射镀膜系统的腔室压力，并升起顶板。
  5. 将干燥的样品放入腔室中，降下上部平板。
  6. 将控制旋钮切换至“泵”以开始抽空腔体。
  7. 打开氩气泄漏阀。等待真空度降至0.05 mbar。
  8. 用一层薄金/钯（0.13 nm）镀覆干燥样品。
  9. 将氩气泄漏阀恢复至关闭位置。
  10. 将控制旋钮切换至关闭位置。
  11. 使用按钮阀释放腔室压力，并升起顶板。
  12. 取出样品，置于干燥器中保存24小时。
  13. 在扫描电子显微镜下观察样品。

6. 免疫荧光染色

  1. 在接种后第7天，用PBS洗涤接种于对照TCPS和PLAGA支架上的细胞（每片50,000个细胞）。
  2. 用70%乙醇（冷）固定细胞，作用10分钟。
  3. 将固定后的细胞在室温下用含0.05% Triton X-100的PBS配制的1%牛血清白蛋白（BSA）溶液孵育20分钟。
  4. 将样品浸入1% Tween溶液中，在室温下孵育20分钟。
  5. 加入单克隆小鼠抗-β-actin抗体（1:400稀释），4 °C下孵育过夜。
  6. 用0.05% Tween洗涤细胞，加入二抗（与荧光探针偶联的山羊抗小鼠IgG F(ab')₂片段，1:400稀释），室温孵育1小时。
  7. 用PBS洗涤细胞，用核染料对细胞染色，并用80%甘油封片。
  8. 在共聚焦显微镜下观察细胞。

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结果

人前交叉韧带（hACL）来源细胞的手术获取、组织消化及分离工作模型见图1。细胞从组织块中迁移并贴附于T-25培养瓶中。这些细胞培养3天后，在光学显微镜下进行观察（图2）。至第7天获得融合的单层细胞。健康且具有活力的细胞的存在表明已成功获取并培养出hACL来源细胞。

通过扫描电镜（SEM）定性评估细胞在PLAGA和TCPS表面的黏附情况。图3展示了来源于人前交叉韧带（hACL）的细胞在每种聚合物表面的黏附与增殖情况。在PLAGA和TCPS表面均观察到细胞融合生长。

通过免疫荧光染色法测定细胞形态和黏附性分析。β-actin 染色显示，来源于人前交叉韧带（hACL）的细胞能够黏附并在 PLAGA 和 TCPS 表面增殖。图4 展示了聚合物上的细胞黏附情况，并突出了 hACL 细胞正常的、无应激状态下的形态特征。

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讨论

本项hACL/2D支架研究的主要目标是利用获取的细胞制成补片，以增强部分前交叉韧带（ACL）撕裂的原位修复。对于部分ACL撕裂的非手术治疗，可能包括短暂的制动、支具固定、渐进式康复训练以及定期随访评估13,16,17。然而，许多研究表明，运动员采用保守治疗常导致疗效不佳和治疗失败。Buckley et al. 对25例部分ACL撕裂患者进行中期随访评估，发现仅有44%的患者恢复至受伤前的运动水平，72%的患者报告存在与活动相关的症状8。Bak et al. 对56例孤立性部分ACL撕裂患者进行了平均5.3年的随访，仅有30%的患者恢复了受伤前的活动能力10。Fritschy et al. 发现，在43例部分ACL撕裂患者中，有18例在5年随访期间进展为完全断裂11。这些研究结果表明，亟需开发创新技术以治疗和修复部分ACL撕裂。

本研究的目的是建立一种实验方案，以展示一种新技术，即获取人前交叉韧带（hACL）细胞、进行培养，并使其在工程化支架上...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢南伊利诺伊大学医学院的启动资金和外科研究基金，以及纪念医疗基金会的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
培养皿Fisher Scientific08-757-103C
磷酸盐缓冲液（PBS）Fisher ScientificBP3994
胶原酶Gibco17018-0294 °C 保存
DMEM/F-12Cellgro10-092-CV4 °C 保存。使用前在 37 °C 水浴中预热。
胎牛血清（FBS）Gibco10082-80 °C 保存
青霉素/链霉素Lonza17-602E4 °C 保存
离心管 - 15 mlCorning430790
T-25 培养瓶BD Falcon3013
胰蛋白酶-Versene 混合液Lonza17-161E4 °C 保存。使用前在 37 °C 水浴中预热。
DMSOFisher ScientificBP231-100可燃液体。可引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。
冻存管Corning430489
PLAGAPurac BiomaterialsPurasorb PLG8523-80 °C 保存
TCPS 圆片Fisher Scientific12-545-82
二氯甲烷Fisher ScientificAC36423-0010可能致癌。应存放在干燥、阴凉处。
Bytac 纸Saint gobin performance plastics1420652
闪烁瓶Fisher Scientific03-339-21G
牛血清白蛋白（BSA）Sigma AldrichA79064 °C 保存
TweenFisher ScientificBP337-500
小鼠抗-β-肌动蛋白抗体（1° Ab）Sigma AldrichA5441-20 °C 保存
山羊抗小鼠抗体（2° Ab）Cell Signaling4408-20 °C 保存
Hoechst 染料Sigma Aldrich14530-20 °C 保存
甘油Fisher ScientificBP229-1
戊二醛Fisher ScientificBP2547-1吸入或吞咽有毒。所有接触途径均可引起灼伤。
六甲基二硅氮烷Fisher ScientificAC43085-1000易燃液体和蒸气。所有接触途径均可引起灼伤。
无菌剪刀McKesson25-716
离心机Eppendorf5804R
光学显微镜OlympusCK40
水浴锅Thermo scientific2845
涡旋振荡器LabnetVX-200
玻璃培养皿fisher ScientificS31473
Acu-PunchAcuderm Inc.P1225Acu-Punch 用于切割 12 mm 圆片
卡可基酸缓冲液Sigma Aldrich97068易燃液体，致癌物，刺激物。
四氧化锇Sigma Aldrich201030剧毒
Triton X-100Sigma AldrichT8787吞咽有害
乙醇Decon Labs2705远离热源、火花、火焰及其他点火源。
全身/区域麻醉剂Amphastar pharmaceuticals1% 利多卡因，0.25% 布比卡因，用于诱导和维持麻醉的麻醉剂
抗生素Hospira0409-0805-01Ancef 1 g 静脉注射
关节镜穿刺器Smith and Nephew
关节镜摄像系统Smith and Nephew
关节镜抓钳和咬钳Arthrex
4.5 mm 刨削器Arthrex
干涉螺钉Arthrex不锈钢螺钉
溅射镀膜仪PolaronE5400

参考文献

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