为将来作为修复前交叉韧带（ACL）部分撕裂的补片应用，从重建手术中获取的组织分离出人源ACL细胞，并进行扩增 体外 并在组织工程支架上培养。随后进行细胞黏附与形态学分析，以确认支架表面的生物相容性。
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摘要
摘要
前交叉韧带（ACL）损伤是活动人群中常见的问题。即使是这种关节内膝关节韧带的部分撕裂，也会导致生物力学缺陷，影响关节功能和稳定性。目前对于部分ACL撕裂的治疗方案包括从非手术的保守治疗到多种手术方法，例如：热力修复、单束修复、完全重建以及对原有韧带受损部分的重建。然而，几乎没有研究能够证明其中任何一种治疗方法具有持续的优越性，在许多情况下，患者仍表现出持续的不稳定及其他合并症。
本研究的目的是确定一种潜在的细胞来源，用于开发一种组织工程补片，以应用于部分撕裂的前交叉韧带（ACL）修复。我们建立了一种新型方案，用于扩增来自接受ACL重建手术患者的细胞。为分离细胞，将ACL重建过程中获取的人前交叉韧带（hACL）组织切碎后，在胶原酶溶液中进行消化。细胞扩增使用添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的DMEM/F12培养基进行。扩增后的细胞以含有DMSO、FBS和扩增培养基的冻存液在-80 ºC或液氮中保存。解冻后，将hACL来源的细胞接种至组织工程支架PLAGA（聚乳酸-共-乙醇酸）以及对照组组织培养聚苯乙烯（TCPS）上。培养7天后，通过扫描电子显微镜（SEM）比较细胞在PLAGA与对照组TCPS表面的黏附情况。同时采用免疫荧光染色法评估细胞形态。SEM显微图像显示，细胞在PLAGA和TCPS表面均能生长并牢固黏附，并在第7天时在整个表面达到融合状态。免疫荧光染色结果显示，两种表面上的细胞均呈现正常、无应激的形态特征。该技术在前交叉韧带再生与重建应用中具有良好的前景。
引言
前交叉韧带（ACL）是膝关节内常见的损伤性关节内韧带。在美国，每年约报告20万例前交叉韧带（ACL）损伤。超过75%的前交叉韧带损伤患者选择骨科重建手术1,2,3,4。由于前交叉韧带自身愈合能力较差，通常需要手术干预3。前交叉韧带重建通常采用自体肌腱移植或同种异体肌腱移植。自体移植和同种异体移植被视为重建的金标准，因其成功率高；而另一种治疗选择——原发性缝合修复——失败率高达94%5,6,7。
前交叉韧带（ACL）部分撕裂占所有ACL撕裂的10%至28%8。在一项前瞻性研究中，Noyes 等估计，对于ACL受累超过一半的部分撕裂患者，经非手术治疗后有50%进展为完全性ACL功能不全9。其他研究报道，持续性关节不稳定和功能下降较为常见，仅有不到30%的患者能够恢复至受伤前的活动水平9,10,11,12,13。目前治疗选择有限，包括保守治疗、残余ACL的热收缩处理或ACL重建手术。近年来，增强型原位修复技术受到越来越多关注。这些技术利用生物材料来增强原位缝合修复的效果14。近期研究尝试获取类似间充质干细胞的源自人前交叉韧带（hACL）的干细胞，以克服移植物来源的局限性31,32，但这些细胞的有效性和可靠性仍不明确。在组织工程应用中，理想的细胞来源似乎是源自hACL的非间充质型成纤维细胞。<....
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方案
1. 手术取材
注意：已获得机构审查委员会（IRB）批准，可在前交叉韧带（ACL）重建手术期间采集ACL残端组织。由于所使用的ACL残端通常作为手术废弃物丢弃，因此获得了IRB豁免。共采集了20名患者的ACL残端组织。
- 根据所在机构的规程，为患者实施全身麻醉并给予术前抗生素。
- 应用止血带并充气至高于收缩压 100 mmHg。
- 将患者置于仰卧位，在膝关节屈曲 30–45° 时做一水平前外侧切口，建立 5 mm 入路，以 30° 角将关节镜套管和镜头插入髌上囊。
- 进行常规诊断性关节镜检查。
- 进入髁间窝，清除覆盖于撕裂前交叉韧带（ACL）上的膜状滑膜组织。
- 使用 4.5 mm 刨削刀和消融器识别前交叉韧带残端。
- 使用直喙钳从残留的前交叉韧带残端多点取样。
- 将样本保存在无菌容器内的生理盐水中。
- 将样本送至病理科进行解码，并最终递送至实验室设施。
- 按机构规程对患者进行复苏及术后护理。
2. 组织消化与人前交叉韧带分离
- 将病理科提供的前交叉韧带组织转移至含有无菌生理盐水/PBS（磷酸盐缓冲液）的培养皿中。
- 使用无菌剪刀将组织剪碎成 1–2 mm3 的小块....
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结果
人前交叉韧带（hACL）来源细胞的手术获取、组织消化及分离工作模型见图1。细胞从组织块中迁移并贴附于T-25培养瓶中。这些细胞培养3天后，在光学显微镜下进行观察（图2）。至第7天获得融合的单层细胞。健康且具有活力的细胞的存在表明已成功获取并培养出hACL来源细胞。
通过扫描电镜（SEM）定性评估细胞在PLAGA和TCPS表面的黏附情况。图3展示了来源于人前交叉韧带（hACL）的细胞在每种聚合物表面的黏附与增殖情况。在PLAGA和TCPS表面均观察到细胞融合生长。
通过免疫荧光染色法测定细胞形态和黏附性分析。β-actin 染色显示，来源于人前交叉韧带（hACL）的细胞能够黏附并在 PLAGA 和 TCPS 表面增殖。图4 展示了聚合物上的细胞黏附情况，并突出了 hACL 细胞正常的、无应激状态下的形态特征。
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讨论
本项hACL/2D支架研究的主要目标是利用获取的细胞制成补片，以增强部分前交叉韧带（ACL）撕裂的原位修复。对于部分ACL撕裂的非手术治疗，可能包括短暂的制动、支具固定、渐进式康复训练以及定期随访评估13,16,17。然而，许多研究表明，运动员采用保守治疗常导致疗效不佳和治疗失败。Buckley et al. 对25例部分ACL撕裂患者进行中期随访评估，发现仅有44%的患者恢复至受伤前的运动水平，72%的患者报告存在与活动相关的症状8。Bak et al. 对56例孤立性部分ACL撕裂患者进行了平均5.3年的随访，仅有30%的患者恢复了受伤前的活动能力10。Fritschy et al. 发现，在43例部分ACL撕裂患者中，有18例在5年随访期间进展为完全断裂11。这些研究结果表明，亟需开发创新技术以治疗和修复部分ACL撕裂。
本研究的目的是建立一种实验方案，以展示一种新技术，即获取人前交叉韧带（hACL）细胞、进行培养，并使其在工程化支架上.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢南伊利诺伊大学医学院的启动资金和外科研究基金，以及纪念医疗基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养皿 | Fisher Scientific | 08-757-103C | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 胶原酶 | Gibco | 17018-029 | 4 °C 保存 |
| DMEM/F-12 | Cellgro | 10-092-CV | 4 °C 保存。使用前在 37 °C 水浴中预热。 |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 10082 | -80 °C 保存 |
| 青霉素/链霉素 | Lonza | 17-602E | 4 °C 保存 |
| 离心管 - 15 ml | Corning | 430790 | |
| T-25 培养瓶 | BD Falcon | 3013 | |
| 胰蛋白酶-Versene 混合液 | Lonza | 17-161E | 4 °C 保存。使用前在 37 °C 水浴中预热。 |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | 可燃液体。可引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。 |
| 冻存管 | Corning | 430489 | |
| PLAGA | Purac Biomaterials | Purasorb PLG8523 | -80 °C 保存 |
| TCPS 圆片 | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 二氯甲烷 | Fisher Scientific | AC36423-0010 | 可能致癌。应存放在干燥、阴凉处。 |
| Bytac 纸 | Saint gobin performance plastics | 1420652 | |
| 闪烁瓶 | Fisher Scientific | 03-339-21G | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma Aldrich | A7906 | 4 °C 保存 |
| Tween | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 小鼠抗-β-肌动蛋白抗体（1° Ab） | Sigma Aldrich | A5441 | -20 °C 保存 |
| 山羊抗小鼠抗体（2° Ab） | Cell Signaling | 4408 | -20 °C 保存 |
| Hoechst 染料 | Sigma Aldrich | 14530 | -20 °C 保存 |
| 甘油 | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| 戊二醛 | Fisher Scientific | BP2547-1 | 吸入或吞咽有毒。所有接触途径均可引起灼伤。 |
| 六甲基二硅氮烷 | Fisher Scientific | AC43085-1000 | 易燃液体和蒸气。所有接触途径均可引起灼伤。 |
| 无菌剪刀 | McKesson | 25-716 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5804R | |
| 光学显微镜 | Olympus | CK40 | |
| 水浴锅 | Thermo scientific | 2845 | |
| 涡旋振荡器 | Labnet | VX-200 | |
| 玻璃培养皿 | fisher Scientific | S31473 | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc. | P1225 | Acu-Punch 用于切割 12 mm 圆片 |
| 卡可基酸缓冲液 | Sigma Aldrich | 97068 | 易燃液体，致癌物，刺激物。 |
| 四氧化锇 | Sigma Aldrich | 201030 | 剧毒 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | 吞咽有害 |
| 乙醇 | Decon Labs | 2705 | 远离热源、火花、火焰及其他点火源。 |
| 全身/区域麻醉剂 | Amphastar pharmaceuticals | 1% 利多卡因，0.25% 布比卡因，用于诱导和维持麻醉的麻醉剂 | |
| 抗生素 | Hospira | 0409-0805-01 | Ancef 1 g 静脉注射 |
| 关节镜穿刺器 | Smith and Nephew | ||
| 关节镜摄像系统 | Smith and Nephew | ||
| 关节镜抓钳和咬钳 | Arthrex | ||
| 4.5 mm 刨削器 | Arthrex | ||
| 干涉螺钉 | Arthrex | 不锈钢螺钉 | |
| 溅射镀膜仪 | Polaron | E5400 |
参考文献
- Johnson, R. J. The anterior cruciate ligament: A dilemma in sports medicine. Int J Sports Med. 3, 71-79 (1982).
- Owings, M. F., Kozak, L. F. Ambulatory and inpatient procedures in the United States, 1996. Vital Health Stats. 13, 1-119 (1998).
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重印与许可
