需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
人类多能干细胞（hPSCs）在研究人类胚胎发育、体外模拟人类疾病以及作为疾病或创伤后再生治疗所需的可移植细胞来源方面具有巨大潜力。神经嵴（NC）细胞是多种成体体细胞的前体细胞，例如周围神经系统和胶质细胞、黑色素细胞以及间充质细胞。它们是研究人类胚胎发育过程诸多方面的宝贵细胞来源，包括细胞命运决定和迁移。将神经嵴前体细胞进一步分化为终末分化细胞类型，为人类疾病建模提供了可能 体外，研究疾病机制并为再生医学生成细胞。本文介绍了对现有的一种常用方法的改进 体外 从人多能干细胞（hPSCs）诱导神经嵴细胞的分化方案。该新方案需18天分化时间，无需饲养层，易于扩增，且在人胚胎干细胞（hESC）系及人诱导多能干细胞（hiPSC）系中均具有高度可重复性。新旧两种方案所获得的神经嵴细胞具有相同的细胞身份。
引言
人类胚胎干细胞（hESC）和人类诱导多能干细胞（hiPSC）已展现出巨大的潜力，尤其适用于那些缺乏良好动物模型或原代组织的人类疾病的研究及未来治疗。hESC/hiPSC 技术的应用实例包括：可由 hESC/hiPSC 无限量地生成特定研究所需的细胞类型，用于再生医学1. 可从携带特定疾病的患者体内获取细胞，并用于建立 体外 疾病模型2,3此类疾病模型随后可用于大规模药物筛选，以寻找新的药物化合物。4 以及对现有药物的有效性和毒性的测试5. 体外 疾病模型有助于发现新的疾病机制。在应用hESC/iPSC技术的所有研究中，使用与目标疾病相关的特定且定义明确的细胞类型至关重要。因此，建立稳定且可重复的 体外 分化方案对于hESC/hiPSC技术的所有应用都至关重要。理想的方案应具有最小的变异性、时间消耗、操作难度和成本，并在不同hESC/hiPSC细胞系及不同研究人员之间实现最大程度的可重复性。
神经嵴（NC）细胞在脊椎动物神经管形成期间出现于表皮与神经上皮之间。这些细胞在发育中的胚胎内广泛增殖并迁移，可分化为多种多样的子代细胞类型，包括骨/软骨、颅面骨骼、感觉神经、许旺细胞、黑色素细胞、平滑肌细胞、肠神经元、自主神经元、嗜铬细胞、心脏间隔细胞、牙齿以及肾上腺/甲状腺腺体细胞。6因此，神经嵴细胞是干细胞领域中一种极具吸引....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 培养基制备、包被培养皿及人多能干细胞的维持
1.1 培养基制备
注意：所有培养基均需过滤除菌，并在避光条件下于 4 °C 保存，最多可保存 2 周。试剂名称、公司及目录编号详见材料 表。
- DMEM/10%FBS：将885 ml DMEM、100 ml FBS、10 ml 青霉素-链霉素溶液和5 ml L-谷氨酰胺混合。
- HES培养基：将800 ml DMEM/F12、200 ml KSR、5 ml L-谷氨酰胺、5 ml 青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）、10 ml MEM必需氨基酸溶液和1 ml β-巯基乙醇混合。过滤培养基后，加入10 ng/ml FGF-2。
警告：β-巯基乙醇有毒，避免吸入、摄入和皮肤接触。 - KSR-分化培养基：将820 ml Knockout DMEM、150 ml KSR、10 ml L-谷氨酰胺、10 ml 青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）、10 ml MEM必需氨基酸溶液和1 ml β-巯基乙醇混合。
- N2分化培养基：将12 g DMEM/F12粉末溶解于980 ml dH₂O中2O，加入1.55 g葡萄糖、2 g碳酸氢钠和100 mg APO人转铁蛋白。混合2 ml dH2加入25 mg人....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
相较于MS5-R-NC方案11，R-NC方案的两项最重要改进在于采用无饲养层的明确分化条件，以及整体缩短了实验所需时间。MS5饲养细胞13是来源于小鼠骨髓的基质细胞，已被证实可支持人胚胎干细胞（hESCs）向神经方向分化14。在低密度条件下将hESCs培养于MS5饲养细胞上时，细胞会形成上皮样结构及神经玫瑰花环结构15，神经嵴（NC）细胞即出现在这些结构的边缘区域10，从而模拟了人类早期神经发育过程。然而，目前尚不清楚MS5饲养细胞释放了哪些信号分子和生长因子，因此其分化条件缺乏明确定义，导致在重复实验及不同人多能干细胞（hPSC）系之间难以重现结果。为实现有效的神经诱导，hESCs必须以低密度、小克隆形式接种于MS5饲养层上，这限制了实验的扩增能力，也难以获得高产量的分化细胞。2009年，研究人员开发出一种高效诱导hPSC神经分化的方案12。该方法将hPSC以高密度单层形式接种，无需MS5饲养细胞，可在10天内实现高效的神经诱导。我们借鉴了该方案的设计思路，对MS5-R-NC分化方案进行了优化（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
为了成功地将人胚胎干细胞（hESC）或人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为R-NC细胞，需注意以下事项。必须始终在无菌培养条件下操作。尤其重要的是应定期检测hPSC培养物是否受到支原体污染，因为此类污染会阻碍有效分化，但在hPSC培养物中难以通过肉眼直接识别。R-NC分化应在细胞密度达到90–100%时启动；较低的细胞密度会影响细胞存活率及R-NC分化的效率。某些试剂（特别是支持高效神经嵴分化的KSR）的最佳浓度和批号需通过实验经验性验证。在第11天将细胞以液滴形式重新接种时，10 µl液滴内的细胞密度应较高，其最佳值需通过实验经验确定。适当的玫瑰花环结构（rosette）和神经嵴（NC）形成依赖于液滴内合适的细胞密度。我们通过实验观察发现，在使用accutase处理后至少清洗细胞两次，可提高细胞存活率。为通过FACS成功分离R-NC细胞，必须设置适当的实验对照，如未染色对照、单抗体染色对照以及仅二抗染色对照。死细胞可通过DAPI、7-AAD或碘化丙啶（Propidium Iodide）染色排除。此外，每一批次的特异性抗体都应通过实验经验确定其稀释比例。使用HNK-1和p75进行双染色对FACS纯化R-NC细胞至关重要，因为单染色可能.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了瑞士国家科学基金会高级研究员奖学金以及NYSTEM（C026446；C026447）和三机构干细胞计划（Starr基金会）资助项目的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| 胎牛血清（FBS） | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| 无血清替代物（Knockout Serum Replacement） | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | 应测试批次 |
| L-谷氨酰胺 | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM最低必需氨基酸溶液 | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-巯基乙醇 | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 有毒 |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子（FGF2） | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| 无血清DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 粉末 | Invitrogen | 12500-096 | |
| 葡萄糖 | Sigma | G7021 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma | S5761 | |
| APO人转铁蛋白 | Sigma | T1147 | |
| 人胰岛素 | Sigma | I2643 | |
| 亚精胺二盐酸盐 | Sigma | P5780 | |
| 亚硒酸盐 | Sigma | S5261 | |
| 孕酮 | Sigma | P8783 | |
| Matrigel 基质 | BD Biosciences | 354234 | |
| 聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐 | Sigma | P3655 | |
| 小鼠层粘连蛋白-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| 纤维连接蛋白 | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase（在Hank's平衡盐溶液中，5 U/ml） | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 二盐酸盐 | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 抗坏血酸 | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| 小鼠重组音猬因子（SHH） | R&D Systems | 464SH | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| 人重组EGF | R&D Systems | 236EG | |
| 明胶（无Mg/Ca的PBS） | 本实验室制备 | ||
| 抗体： | |||
| 抗HNK-1/N-Cam（CD57）mIgM | Sigma | C6680-100TST | 应测试批次 |
| 抗p75 mIgG1（神经营养因子受体） | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | 应测试批次 |
| APC标记的抗大鼠mIgM | BD Parmingen | 550676 | 应测试批次 |
| AlexaFluor 488 标记的山羊抗小鼠IgG1 | Invitrogen | A21121 | 应测试批次 |
| 抗Oct4 mIgG2b（使用稀释比例1:200） | Santa Cruz | sc-5279 | 应测试批次 |
| 材料/设备： | |||
| 小鼠胚胎成纤维细胞（700万个细胞/管） | GlobalStem | GSC-6105M | |
| 细胞培养皿：10 cm 和 15 cm 培养板、离心管、FACS管、 移液器、移液器吸头 | |||
| 玻璃血细胞计数板 | |||
| 细胞培养用离心机 | |||
| 细胞培养用孵育箱（CO2、湿度和温度可控） | |||
| 带内置显微镜的细胞培养超净工作台 | |||
| 细胞培养用生物安全柜 | |||
| 细胞分选仪，i.e. MoFlo | |||
| 倒置显微镜 | |||
| 1 ml TB 注射器 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| 聚乙烯细胞刮刀 | Corning Incorporated | 3008 |
参考文献
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
