小鼠模型中下腔静脉移植旁路移植物的植入

摘要

为了增进对细胞和分子水平新生组织形成机制的理解，近期开发了一种小鼠组织工程血管（TEVG）模型。该移植物被植入C57BL/6小鼠的肾下腔静脉作为置换移植物。此模型所获得的结果与临床研究中的结果相似，但所需时间显著缩短。

摘要

接种骨髓单个核细胞（BMCs）的可生物降解支架常用于重建手术，以治疗先天性心脏畸形。长期临床结果显示通畅率良好，但仍有显著的狭窄发生率。为了研究组织工程血管移植物（TEVGs）中新生组织形成的细胞与分子机制，并预防狭窄的发生，我们建立了一种内径约为1 mm的小鼠移植物模型。首先，TEVGs由可生物降解的管状支架组装而成，该支架由聚乙醇酸无纺毡网制成，并涂覆ε-己内酯与L-丙交酯共聚物。将支架置于冷冻干燥机中，真空处理24小时，随后储存在干燥器中，直至接种细胞。其次，从小鼠供体中采集骨髓，并通过密度梯度离心法分离单个核细胞。第三步，将约一百万个细胞接种于支架上，并过夜孵育。最后，将接种细胞的支架作为肾下腔静脉移植段植入C57BL/6小鼠体内。植入的移植物表现出极佳的通畅性（>90%），未见血栓栓塞并发症或动脉瘤形成的证据。该小鼠模型将有助于我们理解并量化TEVG中新生组织形成的细胞与分子机制。

引言

先天性心脏病是严重影响美国近8%活产婴儿的严重疾病。大约25%的先天性心脏病患儿（即每1,000例活产婴儿中有2.4例）在出生后第一年内需要接受侵入性治疗¹。目前治疗先天性心脏病最有效的方法是重建手术。然而，由于现有血管通路装置使用过程中引发的并发症，是导致术后发病率和死亡率的最主要原因。

为解决这一问题，我们开发了首个用于临床的组织工程血管移植物（TEVGs）²。TEVGs由可生物降解的聚酯管支架接种自体骨髓来源的单个核细胞（BM-MNCs）构建而成，并作为静脉通路应用于先天性心脏病手术中。随访1至3年的结果显示通畅率良好，但狭窄的发生率仍较显著^3,4。显然，迫切需要更深入地理解血管新生组织的形成过程以及TEVG狭窄发生的机制。为了进一步阐明TEVG的发展过程及其狭窄形成的机制，研究人员建立了绵羊模型^5,6。在该模型中，TEVG成功转化为具有活性的血管，其形态和功能均与天然静脉相似。这种大动物模型的使用为TEVG的临床应用提供了重要的临床前信息，是迈向实际应用的良好第一步。然而，由于缺乏针对该物种的特异性分子工具，利用大动物模型对TEVG中血管新生组织形成的细胞与分子机制进行全面研究仍受到限制。为克服这些局限性，研究人员开发了小鼠TEVG模型，得益于小鼠遗传学的快速发展、丰富的分子表征手段以及更短的实验周期等优势。

小鼠下腔静脉移植模型真实再现了在大型动物和人类中发生的新血管形成过程，但所需时间显著缩短^6-9。本文详细描述了使用可生物降解支架进行小规模移植物制备、骨髓单个核细胞（BM-MNC）的获取与分离、BM-MNC在支架上的接种，以及在小鼠模型中移植移植物的完整实验方案。

方案

注意：所有动物实验程序均经全国儿童医院机构动物护理和使用委员会批准。

1. 移植物制备

1. 在通风橱中，将100 mg P(LA/CL)加入2 ml 二氧六环中，配制ε-己内酯与L-丙交酯共聚物P(LA/CL)溶液。将溶液置于涡旋振荡器上，持续混合1–1.5小时，直至完全溶解。 
2. 同时，从冰箱中取出一片聚乙醇酸（PGA）毡，裁剪出数个5 × 8 mm的片段。另将一支0.1–10 µl移液枪头在滤膜上方稍作剪切，切去尖端。
3. 将一支19 G针头（长度1.5）插入移液枪头的远端，并使用显微镊子将PGA毡包裹在针头上。
4. 在19 G针头插入枪头的同时，用钝头的18 G针头小心地将毡推至移液枪头的远端（该部位内腔比近端更平直）。
5. 从顶部向移液枪头中加入40 µl P(CL/LA)溶液，使PGA毡充分浸透。然后使用移液器排空气泡。 如有需要，可重复此步骤。
6. 将移植物放入50 ml离心管中，并置于-80 °C冰箱中冷冻20分钟。确保针头朝下放置。
7. 将离心管转移至冷冻干燥机中，抽真空干燥24小时。注意打开管盖，以保证空气流通。
8. 取出移植物，将其从针头上取下。剪去两端，保留约5 mm长的片段，再将其重新套回针头以维持其形状。将移植物保存在干燥器中。
9. 在接种细胞前，将支架置于生物安全柜中，用紫外光照射过夜。

2. 骨髓单个核细胞的采集与分离

1. 使用过量的氯胺酮/赛拉嗪（氯胺酮 200 mg/kg，赛拉嗪 20 mg/kg）对小鼠实施安乐死。
2. 从 3 只小鼠中取出骨骼（股骨和胫骨）用于 10 次移植物植入，并将其置于含有 10 cc RPMI 的培养皿中。剪除骨骼两端，使用配备 25 G 针头的注射器将骨髓冲洗至另一含有 3 cc RPMI 的新培养皿中。收集骨髓与 RPMI 溶液至 15 cc 离心管中，并用额外的 2 cc RPMI 冲洗培养皿以收集残留的骨髓。
3. 取样（5–10 µl），使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。记录结果。
4. 在 15 cc 离心管中加入 5 cc Ficoll，然后缓慢加入骨髓与 RPMI 溶液，注意轻柔操作以避免与 Ficoll 混合。
5. 在 24 °C 条件下以 528 × g 离心 30 分钟，"不启用刹车"。
6. 移除上层粉红色液体，收集中间透明层 图 1（即单个核细胞层），并以 1:1 比例用 PBS 稀释。
7. 将稀释后的单个核细胞溶液在 24 °C 条件下以 528 × g 离心 10 分钟。
8. 弃去上清液，将沉淀物用 5 ml PBS 重悬。
9. 将重悬的沉淀物溶液在 24 °C 条件下以 528 × g 离心 10 分钟。
10. 弃去上清液，用适当体积的 RPMI（约 200 µl）重悬沉淀物。
11. 取 5–10 µl 样品，使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。记录结果，并重复计数一次，计算平均细胞数。
12. 用 RPMI 将细胞浓度调整至 1,000,000 个细胞/10 µl。

3. 细胞接种

1. 向支架管腔内加入 5 µl RPMI，润湿 5 分钟，然后移除 RPMI。
2. 将步骤 2.12 中获得的 10 µl RPMI 悬浮骨髓来源单核细胞加入支架管腔，静置 10 分钟 ，使细胞贴附于支架表面。
3. 将一根 19 G 针头截成 1 cm 长，插入支架管腔以维持支架形状。将样品置于 24 孔板中。
4. 每孔加入 1,000 µl RPMI，于培养箱中过夜培养。

4. 移植物植入

1. 手术前对所有手术器械进行高压灭菌：精细剪刀1把，显微镊子3把，显微血管夹2个，持夹钳1把，显微持针器1把，弹簧剪1把，拉钩1个。
2. 选用6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠作为组织工程血管移植物受体。将小鼠从笼中取出并称重，随后在腹部右下象限进行腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮100 mg/kg，赛拉嗪10 mg/kg）以实施麻醉。术前使用酮洛芬（5 mg/kg，腹腔注射）作为镇痛剂。
3. 通过尾部夹捏法检查镇静程度，然后剪除腹部毛发。用无菌眼科软膏润滑眼睛，将小鼠仰卧位固定于垫子上。使用聚维酮碘和酒精棉片对腹部进行消毒，用无菌洞巾覆盖小鼠，仅暴露切口区域。
4. 从剑突下方至耻骨上区做正中腹腔切口，插入自持式拉钩。将肠管用生理盐水浸湿的纱布包裹。钝性分离腹主动脉和下腔静脉，明确其位置。
5. 在腹主动脉和下腔静脉的近端和远端分别放置显微血管夹，钝性分离腹主动脉与下腔静脉，横断下腔静脉。如有必要，使用带锥形针的10-0单股缝线结扎腹主动脉分支。
6. 使用无菌10-0缝线，将下腔静脉间置移植物以端对端方式吻合于近端和远端。根据小鼠解剖结构修剪移植物，通常长度为1–2 mm。在移植物近端和远端各用一针固定，然后从移植物另一侧开始连续缝合4–5针。完成前壁缝合后，翻转血管夹和移植物，缝合后壁。植入过程中需频繁用肝素溶液冲洗移植物，以防急性血栓形成。
7. 先移除近端血管夹，使用局部可吸收无菌止血剂控制出血。待出血完全停止后，移除远端血管夹，并以相同方式控制出血。确保血液顺利通过移植物。
8. 使用带针6-0黑色单股聚酰胺缝线分两层缝合腹壁肌肉和皮肤。
9. 皮下注射0.5 ml生理盐水，将小鼠置于带加热垫的恢复笼中，直至其完全恢复活动能力。苏醒后，将小鼠转移至铺有纸垫的新笼中，并在饮水中给予镇痛药物（布洛芬，30 mg/kg）持续48小时。

结果

TEVG移植的示意图见图1。从供体小鼠中采集骨髓，通过密度梯度离心法分离单个核细胞，并将其接种至可生物降解的支架上。接种后的支架在O/N条件下孵育，随后作为下腔静脉置换移植物植入受体小鼠体内。

图2展示了PGA-P(CL/LA)支架的扫描电子显微镜图像。其内径约为1 mm，壁厚约为0.17 mm。总孔隙率为78.5%，平均孔径为45.4 ± 17.6 µm。

C57BL/6 小鼠下腔静脉中植入的组织工程血管移植物的大体图像如图所示 图3植入后立即（A）以及植入后2周（B). (C显示了原生下腔静脉的大体图像作为对比。显然，移植物已被新生组织填充，但仍保持了原始移植物的形态。我们之前的结果表明，移植物完全降解需要长达12周的时间¹⁰.

植入2周后组织...

讨论

TEVG 的小鼠模型是研究新生组织形成及狭窄发生过程中细胞与分子机制的有力工具。组织学和扫描电镜图像均显示，骨髓单个核细胞（BM-MNC）已成功接种于移植物表面¹¹。此外，通过DNA检测也证实了细胞接种效率⁷。利用该模型系统，我们发现细胞接种可降低TEVG狭窄的发生率，而狭窄正是我们在前期人体临床试验中观察到的主要失败模式³。接种的细胞在TEVG中迅速消失，提示其作用可能通过旁分泌机制实现^8,12。研究还表明，新生血管的形成为一种免疫介导的再生过程，新生血管由邻近血管壁的血管细胞（内皮细胞EC和血管平滑肌细胞SMC）沿支架腔面内向生长而形成。此外，正常程度的巨噬细胞浸润对血管新生组织的形成至关重要，但若该过程过度，则会导致TEVG狭窄的发生^7,8。这些结果表明，该小鼠模型与人类疾病具有高度相关性。该显微外科技术还可推广应用于其他血管场景，包括动脉移植物¹³以及动静脉瘘的建立。

我们每年进行超过1,000例下腔静脉搭桥移植手术，死亡率低于1%。为了成功实...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚乙醇酸（PGA）毛毡	Biomedical Structures		定制订购
移液器吸头，0.1–10 μl	Fisher Scientific	02-707-456
冷冻干燥机	Labconco	7070020
RPMI 1640 培养基	Gibco	11875-093
培养皿	BD	353003
24 孔板	Corning	3526
15 cc 离心管	BD	352096
Ficoll	Sigma	10831-100ml	又称“Histopaque”
DPBS	Gibco	14190-144
Littauer 骨剪，4.5" 直型	Roboz	RS-8480	用于骨髓采集
镊子，4.5"	Roboz	RS-8120	用于骨髓采集
剪刀，4.5"	Roboz	RS-5912	用于骨髓采集
显微镜	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b)，雌性	Jackson Laboratories	664	8–12 周龄
盐酸氯胺酮注射液	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
无菌赛拉嗪溶液	Akorn Inc.	NADA# 139-236
酮洛芬	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01
布洛芬	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
肝素钠	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400
生理盐水溶液（无菌 0.9% 氯化钠）	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
0.9% 氯化钠注射液	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
凡士林眼膏	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
碘伏消毒片	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
酒精消毒片	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
棉签	Fisher Scientific	23-400-118
精细剪刀	FST	14028-10
微型 Adson 镊	FST	11018-12
持夹镊	FST	00072-14
S&T 血管夹	FST	00396-01
弹簧剪刀	FST	15008-08
Colibri 牵开器	FST	17000-04
Dumont #5 镊子	FST	11251-20
Dumont #7 — 精细镊	FST	11274-20
Dumont #5/45 镊子	FST	11251-35
Tish 缝合针持/镊子	Micrins	MI1540
黑色聚酰胺单丝缝线，10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	用于移植物缝合
黑色聚酰胺单丝缝线，6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	用于肌肉和皮肤闭合
无纺布海绵	McKesson Corp.	94442000
可吸收止血剂	Ethicon	1961
1 ml 注射器	BD	309659
3 ml 注射器	BD	309657
10 ml 注射器	BD	309604
18 G 1.5 英寸针头	BD	305190
25 G 1 英寸针头	BD	305125
30 G 1 英寸针头	BD	305106
循环温水仪	Gaymar	TP-700
加热垫	Gaymar	TP-22G
修剪器	Wahl	9854-500