本方案描述了一种无需处死小鼠即可进行股骨骨髓（BM）连续取样的操作流程。该方法可支持对小鼠骨髓组成进行长期的纵向研究，并能够连续获取骨髓内的细胞，用于离体（ex vivo）及移植实验研究。
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本文内容
摘要
摘要
对骨髓（BM）细胞组成的连续取样是临床血液学中的一项常规且关键的操作。本方案详细描述了一种在活体小鼠中进行类似操作的技术步骤，可实现对骨髓中细胞的连续性表征。该方法有助于检测外源性施用的细胞在小鼠骨髓中的存在情况，例如在异种移植研究中的应用。此外，该方法可在不处死小鼠的情况下，实现对骨髓中富集的细胞（如造血干细胞和祖细胞（HSPCs））的回收与表征。鉴于外周血的细胞组成未必能反映骨髓中干细胞和祖细胞的比例与类型，因此无需终止实验动物即可获取骨髓成分的操作具有重要价值。本文以股骨骨髓穿刺为例，展示了其在骨髓细胞的细胞学分析、造血干细胞/祖细胞区室的流式细胞术表征，以及通过股骨骨髓穿刺获取并分选的HSPCs的培养等方面的应用，相较于传统的骨髓提取方法具有优势。
引言
所有血细胞均起源于造血干细胞（HSCs）。在不牺牲动物的前提下，获取骨髓（BM）——即小鼠和人类中绝大多数造血干细胞所在的部位——的操作方法，为连续监测造血来源提供了资源。本方案的总体目标是提供一种详细的活体小鼠股骨骨髓细胞取样操作流程，所获得的样本能够代表通过牺牲小鼠后常规方法获取的骨髓细胞。与传统的骨髓细胞收获方法相比，该方法的优势在于无需牺牲小鼠，因而能够实现对小鼠骨髓腔室进行纵向的、时间序列的研究。
尽管这种小鼠骨髓穿刺操作已在多项研究中使用并有先前描述（参见Sundberg et al. 的历史综述1），但此前尚未发表正式的分步操作流程。本方案可实现对骨髓（BM）的常规连续取样，适用于多种目的，例如评估外源性导入小鼠体内的细胞在骨髓中的植入情况（如在异种移植研究中所进行的2,3）、分析骨髓嵌合状态并与外周血的嵌合状态进行比较（两者结果未必一致）、监测通常富集于骨髓中的特定细胞类型（如造血干细胞和祖细胞）的丰度，以及获取骨髓细胞用于体外（ex vivo）培养和/或移植实验。此外，在造血系统疾病的小鼠模型中，评估骨髓内容物可能非常有价值，因为当外周血尚未显现疾病迹象时，骨髓穿刺有助于评估特定时间点的血液病负荷3-5。此外，该技术还可用于评估在治疗性研究中给予药物后，骨髓内血液系统疾病对治疗的反应。因此，本文所述的操作方法非常适合希望在不牺牲或伤害小鼠的前提下，获取小鼠骨髓造血细胞用于细胞学分析、流式细胞术分析、体外（in vitro）培养和/或体内（in vivo）移植研究的研究人员。
本文所述的骨髓采样方案与直接向骨髓腔内注射物质的股骨内注射技术非常相似3,6。关键区别在于，本方案详细描述了从骨髓中获取细胞的操作步骤，而股骨内注射则是将物质直接注入骨髓腔内。
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方案
本方案中描述的所有动物实验均遵循《实验动物护理与使用指南》的规定，并已获得纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构动物护理和使用委员会（IACUCs）的批准。
1. 从股骨抽吸骨髓（BM）细胞
- 使用精密挥发器给予异氟烷（1-4%）麻醉将进行股骨骨髓穿刺的小鼠。在整个操作过程中，应每5-10分钟监测一次麻醉深度，通过观察手术操作和/或耳、趾、尾部夹捏时呼吸频率无变化来确认。麻醉诱导和维持均使用异氟烷。可皮下注射布托啡诺0.05-0.1 mg/kg（每6-12小时一次）作为术前预防性镇痛用药，以辅助卡洛芬减轻操作相关的疼痛。
- 麻醉诱导后，向小鼠眼部涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥。
- 仔细剪除穿刺部位周围约150%面积的皮肤毛发。用湿润纱布擦去松散的毛发。操作过程中请将小鼠置于循环温水垫或其他安全的恒温加热表面上，以防低体温。
- 用三轮交替擦拭法对包含待穿刺股骨的整个腿部进行消毒（交替使用聚维酮碘（贝塔碘）或氯己定（诺瓦森）擦拭液与70%异丙醇或70%乙醇浸湿的纱布垫）。
- 在抽取骨髓前，先用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）润洗一支0.5 ml结核菌素注射器（容积：0.5 cc；规格：27.5 G）。向注射器内吸入200-500 μl PBS，随即完全排出。重复此步骤2-3次。
- 用无名指或小指将胫骨向远离股骨方向轻压，使其保持弯曲状态。确认已达到适当的麻醉平面。用拇指和食指持握注射器，以便暴露股骨髁并便于针头插入。
- 润洗注射器后，将针头穿过髌腱，使其牢固地置于股骨两髁之间。用拇指和食指紧贴股骨骨干靠近骨骺处固定，便于将针头顺利插入股骨干内。
- 将针头向外、向上摆动，使其与股骨干平行。此操作有助于从股骨干中获取骨髓内容物。
- 在缓慢推进针头进入股骨髓腔的同时，顺时针和逆时针旋转针头。通过轻轻横向移动注射器，确认针头位置正确。
- 在骨髓腔内前后移动针头的同时，轻柔回拉针栓以产生负压。注意：所抽取的骨髓体积约为5 µl，通常相当于0.4-0.8 × 106个单个核细胞。若在注射器基部针头顶端观察到血液，则表明穿刺成功。若未见血液，可能是有小块骨组织或组织碎片堵塞针头。可通过在PBS中上下推动针栓清除堵塞物（这也是为何在抽取骨髓前应预先用PBS润洗注射器的原因之一）。若组织无法从针头中清除，则更换新的针头和注射器（再次用200-500 µl PBS润洗注射器）。
- 一旦成功从股骨中抽取骨髓，即将针头和注射器从小鼠股骨中取出。
- 将抽取的骨髓转移至预装有500 µl PBS的微量离心管中。大多数应用中，如条件允许，骨髓细胞应在冰上保存直至进一步处理。
- 操作完成后，皮下注射卡洛芬5 mg/kg作为镇痛处理。随后将小鼠移出麻醉状态，并置于加热垫上直至完全恢复。注意：若操作得当，穿刺术后不应出现任何并发症或痛苦表现。
- 在将小鼠送回饲养区之前，确保其能够自主活动并可触及食物和饮水。术后24小时内应观察小鼠是否有痛苦或感染迹象。这些迹象包括：持续出血、贫血、嗜睡。若术后出现上述任一症状，应实施安乐死。注意：骨髓穿刺/取样可重复进行，但重复操作应在对侧股骨进行，以避免同一肢体反复创伤。目前关于骨髓穿刺可重复频率的相关信息较少。股骨骨髓穿刺通常不应超过每两周一次。
2. 抽吸骨髓细胞中细胞成分的评估
- 将骨髓穿刺获取的细胞在 4 oC 或室温下以 300 × g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀并置于微量离心管中。
- 吸除上清液，然后将沉淀重悬于 500 µl ACK 红细胞裂解缓冲液（“氯化铵-氯化钾”裂解缓冲液）中。
- 将细胞在红细胞裂解缓冲液中孵育 10 分钟，然后加入 1 ml PBS，再次于 4 oC 或室温下以 300 × g 离心 5 分钟。注意：此时经红细胞裂解后的细胞沉淀即为骨髓单个核细胞。这些细胞可用于流式细胞术染色、细胞计数、移植、细胞涂片分析及其他用途（使用方式与从安乐死小鼠中获取的骨髓细胞相同）。
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结果
采用活体C57/B6小鼠股骨骨髓穿刺法获取骨髓单个核细胞，随后对该小鼠实施安乐死后进行常规骨髓采集。通过上述两种方法获得的骨髓单个核细胞分别进行以下分析：（1）骨髓细胞的细胞学分析；（2）造血干细胞/祖细胞（HSPCs）相对频率的测定；（3） 离体 分选HSPC的培养。在后一实验中，从骨髓穿刺获取的单个核细胞以及常规骨髓采集物中分选出谱系阴性Sca1+ c-KIT+（LSK）细胞。每种方法获得的150个LSK细胞随后被接种至含髓系-红系细胞因子的甲基纤维素半固体培养基中，技术重复设两份，培养7天。图中所示数据来自 图1 A,B 形态学和流式细胞术分析显示，无论是采用股骨骨髓穿刺还是传统骨髓采集，所获得的总细胞类型及比例与造血干细胞和祖细胞（HSPCs）均相似。
为了定量确定在传统骨髓采集与股骨骨髓穿刺所获得样本中LSK细胞和髓系祖细胞的比例差异，我们比较了3次独立的穿刺样本和传统骨髓采集样本中LSK细胞和MP亚群占全部活细胞的比例。如图1C所示，股骨穿刺获取的骨髓中LSK和MP亚群的比例较传统骨髓...
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讨论
连续骨髓穿刺是临床研究人类血液系统疾病的一项常规操作，具有重要意义。在小鼠中进行类似的连续骨髓取样，以在长期实验过程中动态分析骨髓的细胞组成和成分，同样具有很高的价值。该方法不仅可在不处死小鼠的情况下用于造血干细胞和祖细胞（HSPC）的表征，还可用于检测骨髓中可能存在于外周血中无法反映的其他细胞类型。例如，在监测人源细胞异种移植至免疫缺陷小鼠体内时，该技术已非常有效地用于实现上述后一目的3。通常每次骨髓穿刺可获得0.4–0.8 × 106个细胞，这些细胞可用于多种用途，包括细胞形态学分析（图1A）、诊断性流式细胞术分析（图1B）、流式细胞术分选细胞后进行下游应用，如细胞培养（图1C）、核酸提取、蛋白质提取（用于针对有限数量细胞的蛋白质组学分析），甚至可将分离的细胞进一步用于移植实验。同时需注意，每次股骨穿刺所获得的造血干细胞（HSC）数量受限于该操作所获取的总细胞数。例如，根据HSC定义为谱系阴性Sca1+ cKIT+ CD150+ CD48- CD244-的细胞，HSC频率约为每10万个细胞...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
O.A.-W. 获得美国国立卫生研究院临床研究者奖（NIH K08，项目编号：1K08CA160647-01）、美国国防部骨髓衰竭研究博士后研究员奖（W81XWH-12-1-0041）、Josie Robertson 研究者计划以及 Damon Runyon 临床研究者奖（由 Evan's 基金会资助）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PBS | PAA | H15-002 | |
| 牛血清白蛋白 | PAA | K41-001 | |
| ACK裂解缓冲液 | 自制 | 配制1 L，调节pH至7.2 ~ 7.4，用0.22 μm 真空滤器过滤除菌。 | |
| 8.3 g 氯化铵 | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g 碳酸氢钾 | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μl 0.5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0.5 ml 结核菌素注射器 27.5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| 无菌细胞滤器 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 异氟烷，USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| 钝端针头 | Stemcell Technologies | 28110 | |
| PrecisionGlide 针头 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| 3 ml 注射器，鲁尔锁扣式接头 | Becton Dickinson | 309657 | |
| 非组织培养处理板，6孔 | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm 5 ml 管 | Becton Dickinson | 352054 | FACS染色 |
| 带细胞滤器盖的12 x 75 mm 5 ml 管 | Becton Dickinson | 352235 | FACS染色 |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | 100222 | |
| Ly-6G 和 Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | 122513 | |
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | 用于甲基纤维素培养 |
| 卡洛芬 | Crescent Chemical Company | C11045850 | 单次剂量 (5 mg/kg) |
| 流式细胞仪，LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube vet 软膏（无菌凡士林眼用软膏） | Dechra-US | 17033-211-38 |
参考文献
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
- Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
- Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
- Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).
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