组合使用5种荧光蛋白标记造血干细胞和祖细胞可实现 体内 通过共聚焦和双光子显微镜进行克隆追踪，揭示造血再生过程中骨髓造血结构的动态变化。该方法可在移植后长期、非侵入性地对光谱编码的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）来源的细胞在完整组织中进行命运图谱绘制。
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摘要
摘要
我们开发并验证了一种荧光标记方法，可用于高空间和时间分辨率下对造血干细胞和祖细胞（HSPCs）进行克隆追踪研究 体内 利用小鼠骨髓移植实验模型研究造血作用。通过编码荧光蛋白（FPs）的慢病毒载体进行遗传组合标记，结合高级显微成像技术实现细胞命运示踪。使用编码五种不同荧光蛋白（Cerulean、EGFP、Venus、tdTomato 和 mCherry）的载体同时转导造血干细胞和祖细胞（HSPCs），从而生成具有多样化颜色标记的细胞群体。采用共聚焦/双光子混合显微成像技术，可同时高分辨率地评估独特标记的细胞及其子代，并结合组织结构成分进行分析。大范围体积成像分析表明，光谱编码的HSPC来源细胞可在移植后长期非侵入性地在包括骨髓（BM）在内的多种完整组织中被检测到。结合视频速率多光子成像与4D共聚焦延时成像的活体研究，展示了以定量方式动态追踪单个细胞及其克隆行为的可能性。 关键词：造血作用，骨髓移植，小鼠模型，慢病毒载体，荧光蛋白，细胞命运示踪，共聚焦显微镜，双光子显微镜，HSPC，活体成像
引言
血细胞的生成过程称为造血作用，由一小群造血干细胞和祖细胞（HSPCs）维持。这些细胞存在于骨髓（BM）中一个复杂的微环境生态位内，该微环境包含成骨细胞、基质细胞、脂肪组织和血管结构，均参与调控HSPCs的自我更新与分化1,2。由于完整的骨髓传统上难以直接观察，HSPC与其微环境之间的相互作用在活体（in vivo）条件下的特征仍 largely 未被阐明。此前，我们建立了一种利用共聚焦荧光与反射显微镜对完整骨髓进行三维结构成像的方法3。我们曾表征了骨髓中EGFP标记的HSPCs的扩增情况，但仅使用单一荧光蛋白（FP）限制了对克隆水平再生过程的分析。最近，我们利用可组成型表达荧光蛋白（FPs）的慢病毒基因本体（Lentiviral Gene Ontology, LeGO）载体，实现了对细胞的高效标记4,5。通过使用3种或5种载体对HSPC进行共转导，可产生多种组合颜色，从而实现对多个单个HSPC克隆的追踪。
标记的造血干细胞/祖细胞（HSPC）结合新型成像技术，使得在辐照小鼠骨髓（BM）中追踪单个HSPC的归巢与植入成为可能。采用LeGO载体将HSPC标记为3种或5种不同的荧光蛋白（FP）（包括Cerulean、eGFP、Venus、tdTomato和mCherry），并通过共聚焦显微镜和双光子显微镜长期观察其在骨髓中的植入情况，从而清晰地可视化骨组织及其他基质结构，并揭示HSPC克隆与其微环境....
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方案
所有小鼠的饲养和操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》的规定，并纳入经国家心肺血液研究所（NHLBI）动物护理和使用委员会批准的实验方案。选用6至12周龄的雌性B6.SJL-Ptprc(d)Pep3(b)/BoyJ（B6.SJL）小鼠作为供体，C57Bl/6小鼠作为受体。
材料、试剂和设备列表见表1。
1. 小鼠HSPC的LeGO转导及骨髓移植
在经认证的生物安全二级（BSL-2）柜（组织培养罩）中进行下述操作。
- 编码5FPs的LeGO载体的制备
- 使用编码不同荧光蛋白（FP）的慢病毒“基因本体”（LeGO）载体质粒，这些荧光蛋白由强组成型SFFV启动子驱动表达，包括LeGO-Cer2（Cerulean）、LeGO-G2（EGFP）、LeGO-V2（Venus）、LeGO-T2（tdTomato）和LeGO-C2（mCherry），由德国汉堡-埃彭多夫大学医学中心Boris Fehse博士惠赠；现亦可从Addgene获取5-7.
- 为制备LeGO载体，接种5 × 106 转染前24小时，在10 cm培养皿中接种293T细胞（每种载体使用12个培养皿），每皿加入8 ml I10培养基（IMDM添加10....
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结果
胸骨骨髓的全组织三维共聚焦/双光子显微镜时间序列重建揭示了移植的共表达5种荧光蛋白（co-5FPs）细胞的植入与扩增模式，具有显著特征：克隆边界清晰，最初均匀地标记有多种颜色，随着时间推移逐渐演变为主要包含单一颜色细胞的克隆。共聚焦显微镜的设置以及在胸骨骨髓中成像标记了5FPs的造血干细胞和祖细胞（HSPC）的代表性示例见图2以及视频1和2。
完整组织的三维共聚焦/双光子显微镜整体成像重建展示了在活体组织中长期追踪经颜色标记的骨髓来源细胞命运的可能性。以下展示了移植后造血及非造血器官中骨髓来源细胞的代表性示例。 图3.
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讨论
我们在此详细介绍一种近期开发的强大克隆细胞追踪方法，该方法结合了由组合标记产生的高度多样性与编码5种荧光蛋白（5FP）的LeGO载体，并利用串联共聚焦显微镜与双光子显微镜成像，实现在活体组织中进行三维及动态成像。该技术通过在5个“独立”的8位通道中记录共聚焦光谱特征，拓展了基于荧光蛋白的颜色标记应用。因此，每个细胞内Cerulean、EGFP、Venus、tdTomato和mCherry的相对比例形成独特的“颜色指纹”，可用于识别克隆子代细胞。利用5种荧光蛋白进行多色标记显著增加了标签的多样性，尤其在研究高密度组织样本中同类型细胞或细胞群的分布、接触、拼接排列以及竞争性相互作用时表现出重要优势。结合双光子激发对多种组织和器官内在结构特征的成像能力，我们能够在无需固定和物理切片的情况下，在天然微环境中追踪带有颜色标记的克隆细胞。我们已发表的研究证实，源自单个前体细胞的子代细胞即使经历分化与增殖，仍保留独特的“颜色指纹”，并在单个克隆中发现数百个已分化的细胞，验证了该方法的有效性 体外 具有相同“颜色图谱”的菌落（CFU）
该方法结合了单细胞分辨率高分辨率成像与共聚焦.......
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披露
作者声明不存在竞争性经济利益。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所的院内研究项目资助。我们感谢德国汉堡-埃彭多夫大学医学中心的 Boris Fehse 提供了五种 LeGO 载体质粒；感谢 NHLBI、NIH 的 Christian A. Combs 和 Neal S. Young 在本研究过程中给予的讨论、支持与鼓励；并感谢 NHLBI、NIH 的 Andre LaRochelle 在尾静脉注射方面提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>病毒的制备 | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Cerulean 的表达 |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | eGFP的表达 |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Venus的表达 |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | tdTomato的表达 |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | mCherry的表达 |
| 磷酸钙转染试剂盒 | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| 组织培养皿 | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco，Life Technology | 12440-053 | |
| 胎牛血清，热灭活 | Sigma | F4135-500ML | |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺 | Gibco，Life Technology | 10378-016 | |
| 离心管 | 贝克曼库尔特 | 326823 | |
| SW28 超速离心机 | 贝克曼库尔特 | L60 | |
| 密理博注射器驱动滤器（0.22 µm） µm) | Millipore | SLGS033SS | |
| <强>小鼠细胞的收集、纯化、转导与移植 | |||
| ACK裂解缓冲液 | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| 小鼠谱系细胞耗竭试剂盒 | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS 柱 + 管 | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| 预分离滤器（30 µm) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| 用于造血细胞培养与扩增的StemSpan SFEM无血清培养基（500 ml） | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| 小鼠 IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | 100 µg/ml 是 1,000 倍 |
| 重组小鼠 SCF | RDI 分部，Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | 100 µg/ml 是 2,000 倍 |
| 重组小鼠IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | 20 µg/ml 是 2,000 倍 |
| FLT-3配体 | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | 100 µg/ml 是 1,000 倍 |
| 12孔板，Costar | 康宁公司 | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio 公司 | T100A/B | 重悬于50 µg/ml |
| 硫酸鱼精蛋白 | Sigma | P-4020 | 4 µg/ml 是 1,000 倍 |
| <强>共聚焦与双光子显微镜技术 | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1 M Hepes | Cellgro，Mediatech 公司 | 25-060-CI | |
| P35G-0-20-C 玻璃底培养皿 | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| 玻璃底培养皿 P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek 培养皿盖玻片 #1 硼硅酸盐盖玻片；4 孔 | 赛默飞世尔科技 | 155383 | |
| 22 mm 盖玻片，No 2 | Thomas Scientific | 6662-Q55 | |
| Leica TCS SP5 AOBS 五通道共聚焦与多光子显微镜 | 徕卡显微系统 | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph 激光器波长范围 680-1,080 nm | 相干 | ||
| Chameleon Compact OPO 激光器，波长范围 1,030-1,350 nm | 相干的 | ||
| HCX-IRAPO-L 25倍/0.95 数值孔径水浸物镜（工作距离=2.5 mm） | 徕卡显微系统 | ||
| HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA 干式物镜（工作距离=0.6 mm） | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA 水浸物镜（工作距离=0.6 mm） | Leica Microsystems | ||
| Imaris 软件版本 7.6 | Bitplane |
参考文献
- Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A correction was made to In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
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