异位心脏移植小鼠模型中肺动脉瓣移植

摘要

为了理解组织工程心脏瓣膜中新生组织形成和狭窄发展的细胞与分子机制，研究人员建立了一种小鼠异位心脏瓣膜移植模型。采用异位心脏移植技术，将肺动脉瓣移植至受体动物体内。

摘要

组织工程心脏瓣膜，尤其是脱细胞瓣膜，近年来在重建手术的临床应用中逐渐受到关注，但其效果尚不一致。然而，新生组织形成、瓣膜增厚以及狭窄发展的细胞与分子机制尚未得到充分研究。为回答上述问题，我们建立了一种小鼠异位心脏瓣膜移植模型。从瓣膜供体小鼠获取心脏瓣膜，并将其移植至心脏供体小鼠体内。携带新瓣膜的心脏随后被异位移植到受体小鼠体内。移植后的心脏表现出独立于受体心跳的自主搏动。通过高频超声系统结合脉冲波多普勒技术对血流进行定量分析。经植入的肺动脉瓣血流显示为前向血流，反流极少，峰值流速接近100 mm/sec。该小鼠心脏瓣膜移植模型具有高度可变性，可进行修改和调整，以提供不同的血流动力学环境，或与多种转基因小鼠联合使用，用于研究组织工程心脏瓣膜中新生组织的发育过程。

引言

先天性心血管缺陷是西方世界婴儿死亡的主要原因之一^1,2。  其中，肺动脉瓣狭窄和二叶式主动脉瓣缺陷是较为常见的类型³。  心脏瓣膜置换手术是重建性手术的常规选择；然而，瓣膜狭窄和钙化等并发症，以及终身依赖抗凝药物，是导致慢性疾病和死亡的重要原因^4-7。此外，由于缺乏生长潜力，患者需要接受多次修复手术，这进一步增加了年轻患者的死亡率^4,8,9。

为了开发具有生长潜力的功能性替代心脏瓣膜，Shinoka 等将自体细胞接种到一种可生物降解的合成心脏瓣膜上⁸。该合成瓣膜转化为类似天然心脏瓣膜的结构，并具备生长潜能。初步的大动物研究表明，采用此方法制造功能性心脏瓣膜是可行的¹⁰ 。然而，长期植入研究显示，由于瓣膜新生组织进行性增厚，导致心脏瓣膜狭窄，耐久性较差。Sodian 等的研究采用了Shinoka的方法，但最终用一种可生物降解的弹性体替代了PGA基质，使组织工程瓣膜构建物的生物力学性能更接近生理状态^9,11,12。在体内研究中，尽管植入取得成功，但未形成连续的内皮细胞层，这可能限制该支架的长期效果¹²。

为了合理设计改进的第二代人工心脏瓣膜，建立了小鼠心脏瓣膜移植模型，....

方案

注意：所有动物实验程序均已通过 Nationwide Children’s Hospital 机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 从小鼠心脏瓣膜供体中获取肺动脉瓣

1. 手术前对所有手术器械进行高压灭菌：精细剪刀1把、显微镊子3把、显微血管夹2个、持夹钳1把、显微持针器1把、弹簧剪刀1把、牵开器1把。
2. 采用6至8周龄雌性C57BL/6小鼠作为肺动脉瓣供体。将小鼠从笼中取出并称重，随后通过腹腔注射过量的氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮200 mg/kg，赛拉嗪20 mg/kg）实施安乐死。
3. 剪除胸部毛发，将小鼠仰卧位固定于垫上，随后进行开胸手术。暴露心脏，在右心房做一小切口，并用冰冻生理盐水灌注左心室。
4. 钝性分离肺动脉（PA）与升主动脉。连同2 mm肺动脉袖段一并切除肺动脉瓣（PV）。其余心脏组织弃去。
5. 将肺动脉瓣置于含肝素的冷生理盐水溶液（100 单位/ml）中保存。注意：肺动脉瓣可在移植前在此溶液中保存最多两小时。

2. 供体心脏的制备

1. 选用一只6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠作为心脏供体。将小鼠从笼中取出并称重，随后通过腹腔注射过量的氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮200 mg/kg，赛拉嗪20 mg/kg）实施安乐死。此为终末性操作。 
2. 剪除胸部毛发，将....

结果

图1展示了利用异位心脏移植建立心脏瓣膜移植模型的示意图。心脏瓣膜取自供体心脏，并植入另一只供体小鼠的心脏上。随后，将带有新心脏瓣膜的心脏移植至受体小鼠的腹腔内。图2显示了移植后心脏在腹腔内的位置示意图（A）、心脏移植刚完成时的状态（B）以及移植后5分钟的状态。当主动脉和下腔静脉（IVC）两侧的缝线被拆除后，心脏通常在1-2分钟后开始搏动，并随着血流灌注增加而逐渐变为粉红色。请注意，右心房在（C）中的扩张程度较（B）更为明显。心脏搏动逐渐增强，并在24小时后趋于稳定。

植入肺动脉瓣后10天，使用高频超声系统结合脉冲波多普勒模式经皮测量通过植入肺动脉瓣的血流（图3）。B模式下显示了主动脉、右心室（RV）、植入肺动脉瓣（PV）和肺动脉（PA）的位置（图3（A））。黄色取样容积重叠区域位于.......

讨论

该手术的死亡率接近20%，主要原因为门静脉移植部位以及供体主动脉与受体腹主动脉吻合处发生出血。大多数情况下，术后48小时死亡率显著下降。存活的小鼠表现出强有力的心跳以及血液流经植入的门静脉。对于经验丰富的显微外科医生而言，整个手术过程耗时约四小时。掌握该技术大约需要250只小鼠。与将门静脉植入供体心脏相比，异位心脏移植相对简单。门静脉移植成功最关键的步骤之一是从供体小鼠中获取门静脉结构。门静脉结构应在瓣膜下方约1-2 mm处横断。若残留组织过短，吻合将变得困难；若门静脉下方组织过长（即肺动脉过长（与升主动脉相比）可能导致植入后发生扭曲或成角。另一个关键步骤是植入的肺动脉与受体下腔静脉之间的吻合。由于下腔静脉管壁极薄，缝合时极易撕裂。

在此模型中，主动脉血液经主动脉流入，通过冠状动脉，随后经冠状窦流入供体右心房。因此，流经植入肺动脉瓣的血量估计仅为总血容量的5%，这是该模型在研究组织工程心脏瓣膜（TEHV）时最主要的局限性。为了增加通过肺动脉瓣的血流量，建立了三种额外的模型。首先，在供体右心室与受体下腔静脉之间建立第三条吻合口。该第三条吻合口可使血流量增加至总血容量.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DPBS	Gibco	14190-144
显微镜	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b)，雌性	Jackson Laboratories	664	8–12 周龄
盐酸氯胺酮注射液	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
无菌赛拉嗪溶液	Akorn Inc.	NADA# 139-236
酮洛芬	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01
布洛芬	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
肝素钠	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400
生理盐水溶液（无菌 0.9% 氯化钠）	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
0.9% 氯化钠注射液	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
凡士林眼膏	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
碘伏消毒片	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
酒精消毒片	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
棉签	Fisher Sientific	23-400-118
精细剪刀	FST	14028-10
微型 Adson 镊子	FST	11018-12
夹子施加镊	FST	00072-14
S&T 血管夹	FST	00396-01
弹簧剪	FST	15008-08
Colibri 牵开器	FST	17000-04
Dumont #5 镊子	FST	11251-20
Dumont #7 – 精细镊子	FST	11274-20
Dumont #5/45 镊子	FST	11251-35
Tish 持针器/镊子	Micrins	MI1540
黑色聚酰胺单丝缝线，10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	用于移植缝合
黑色聚酰胺单丝缝线，6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	用于肌肉和皮肤闭合
非织造海绵	McKesson Corp.	94442000
可吸收止血剂	Ethicon	1961
1 ml 注射器	BD	309659
3 ml 注射器	BD	309657
10 ml 注射器	BD	309604
18 G 1 1/2 英寸针头	BD	305190
25 G 1 英寸针头	BD	305125
30 G 1 英寸针头	BD	305106
循环温水加热系统	Gaymar	TP-700
加热垫	Gaymar	TP-22G
剃毛器	Wahl	9854-500
VEVO2100 高频超声系统	VisualSonics	http://www.visualsonics.com/vevo2100	货号和价格可向销售代表咨询获取。
超声耦合凝胶	Parker Laboratories, INC.	01-02
台式实验动物麻醉系统	VetEquip, INC.	901806
异氟烷	Baxter	1001936060