焦点形成：一种基于细胞的检测基因致癌潜能的实验方法

摘要

焦点形成实验提供了一种简单直接的方法，用于评估候选癌基因的转化潜能。

摘要

细胞的恶性转化通常与增殖能力增强、接触抑制丧失、获得锚定非依赖性生长潜能以及在实验动物体内形成肿瘤的能力相关¹。在NIH 3T3细胞中，Ras信号转导通路已知可触发上述多种事件，即所谓的Ras转化。将一个过表达的基因导入NIH 3T3细胞，可能促进细胞形态学转化和接触抑制的丧失，从而有助于判断该目的基因的致癌潜能。一种用于评估癌基因转化潜能某一方面的简便方法是焦点形成实验（Focus Formation Assay, FFA）²。当NIH 3T3细胞在培养中正常分裂时，其增殖至形成融合的单层即停止。然而，在存在过表达癌基因的情况下，这些细胞可开始以密集的多层灶状结构生长¹，可通过结晶紫或Hema 3染色进行观察和定量。本文描述了通过逆转录病毒转导将目的基因导入NIH 3T3细胞的FFA实验方案，以及如何通过染色对灶状结构数量进行定量。相较于转染，逆转录病毒转导是一种更高效的基因递送方法，而使用嗜鼠性逆转录病毒可在操作潜在的人类癌基因时提供生物安全控制。

引言

肿瘤细胞与其正常对应细胞相比，在多个层面表现出广泛差异，包括基因表达模式、表观基因组、形态学及增殖特性等方面的改变。其中，血清依赖性降低、接触（密度）抑制丧失、获得锚定非依赖性增殖能力，以及在接种于动物体内后能够形成肿瘤，均为可测量且有效的恶性转化指标。³. 几个 体外 和 体内 已开发出用于细胞转化的检测方法。 体外 检测旨在鉴定和测量培养物形态的变化（集落形成实验）、培养物动态（生长速率、饱和密度）以及生长因子（低血清条件下的生长）或贴壁依赖性（软琼脂中的生长）需求的变化。确定细胞类型恶性特征的金标准仍然是在实验动物中形成肿瘤（异种移植）。然而，其成本高昂且耗时较长 体内 研究并不总能证明将它们作为候选癌基因的初步验证步骤或筛选方法是合理的。尽管没有 体外 该检测虽不能对基因的致癌潜能提供明确评估，但可提供有关致癌潜能的见解，有助于缩小未来研究范围 体内 研究中，用于评估致癌潜能的最常用系统之一 体外 是焦点形成实验²该方法依赖于使用 NIH 3T3 小鼠成纤维细胞，这是一种非转化细胞系，具有强烈的接触抑制特性。癌基因过表达会导致密度依赖性生长的丧失；转化后的细胞可在多个层面上生长，形成“集落”，在未转化细胞的单层背景上易于观察。因此，集落形成实验（Focus Formation Assay）通过接触抑制丧失这一可测量的表型，来评估候选癌基因诱导恶性转化的能力。FFA 已被用于评估蛋白激酶过表达所引起的转化例如，Src⁴，BRAF⁵），转录因子（例如，N-myc⁶），G蛋白偶联受体（例如P2RY8⁷）和GTP酶（例如Ras¹），以及其他方法。该检测方法操作相对简便，是验证基因过表达是否足以转化NIH 3T3小鼠成纤维细胞的理想选择，可快速获得直观明确的结果。 体外.

本实验方案中描述的 FFA 采用了 Plat-E 包装细胞系⁸，该细胞系可提供病毒包装蛋白，并结合逆转录病毒载体 pBABEpuro⁹（Addgene 质粒 1764）来产生逆转录病毒。将含有目的基因的 pBABEpuro 构建体转染至 Plat-E 细胞系后，该细胞系将产生嗜同种逆转录病毒，可用于感染 NIH 3T3 细胞。这种病毒介导的基因递送方法比传统的化学转染方法更高效，并可实现目的基因的稳定表达¹⁰。一旦目的基因整合至 NIH 3T3 细胞的基因组中，其过表达将由病毒长末端重复序列（LTR）启动子驱动¹¹。这种持续性表达可用于检测目的基因是否具有致癌活性，其判断依据为 NIH 3T3 细胞中是否形成集落（foci）。

方案

1. 病毒载体的制备

目的基因以及阳性和阴性对照的编码序列通过传统克隆方法（PCR扩增、限制性酶切和连接）插入到pBABEpuro载体中。该载体上有四个可用于插入DNA的限制性酶切位点：BamHI、SnaBI、EcoRI和SalI。

1. 使用QIAGEN质粒中量提取试剂盒，从感受态细胞中制备转染级质粒DNA。
2. 使用NanoDrop2000分光光度计测定DNA浓度。

2. 逆转录病毒的制备

将使用Plat-E包装细胞系产生嗜同性逆转录病毒，以将目的cDNA递送至NIH 3T3细胞。

1. 从冻存细胞建立 Plat-E 细胞培养
   1. 将 Plat-E 细胞在 37 °C 水浴中快速解冻，并转移至 15 ml 圆底离心管中。缓慢加入 9 ml Plat-E 培养基（DMEM 培养基 + 10% 胎牛血清 (FBS) + 青霉素和链霉素）。
   2. 以 180 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   3. 用 10 ml Plat-E 培养基重悬细胞，并转移至 10 cm 培养皿中。
   4. 将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中培养，直至细胞融合度达到 80–90%（约 2 天）。
2. 细胞传代
   1. 吸除培养基，用 PBS 洗涤细胞一次。
   2. 加入 2 ml 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，在室温下孵育 1 分钟。
   3. 轻弹培养皿使细胞脱落，加入 10 ml Plat-E 培养基，将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中。
   4. 以 180 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   5. 用 10 ml Plat-E 培养基重悬细胞，并按 1:4 至 1:6 的比例接种至新的培养皿中。
3. Plat-E 细胞接种与转染
   1. 使用不含抗生素的 Plat-E 培养基，按每 10 cm 培养皿接种 2 × 10⁶ 个细胞。
   2. 将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中过夜培养。
   3. 次日，将 300 μl Opti-MEM 转移至 1.5 ml 微量离心管中。
   4. 向含 Opti-MEM 的离心管中加入 27 μl 聚乙烯亚胺（PEI），一种经济高效的转染试剂¹²，轻轻弹击混匀，室温孵育 5 分钟。
   5. 向 Opti-MEM/PEI 混合液中加入 9 μg 高纯度质粒 DNA，轻轻涡旋混匀，室温孵育 15 分钟。
   6. 将 DNA/PEI 复合物逐滴加入 Plat-E 培养皿中，在 37 °C、5% CO₂ 条件下过夜孵育 。
   7. 次日，吸除含转染试剂的培养基，加入 10 ml 新鲜的 Plat-E 培养基（不含抗生素）。
   8. 将细胞放回培养箱继续培养。

3. NIH 3T3 细胞及感染

1. 建立 NIH 3T3 细胞培养物并进行接种
   1. 在 37 °C 水浴中快速解冻 NIH 3T3 细胞，并转移至 15 ml 离心管中。缓慢加入 9 ml NIH 3T3 培养基（DMEM + 10% FBS）。
   2. 以 180 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   3. 用 10 ml NIH 3T3 培养基重悬细胞，并转移至 10 cm 培养皿中。
   4. 将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育。必须始终使 NIH 3T3 细胞保持低密度（50–60%），因为一旦培养物达到汇合状态，其自发转化频率（从而基础水平的集落形成）会显著增加。
   5. 每 10 cm 培养皿接种 3 × 10⁵ 个细胞，过夜孵育，次日用于感染。
2. 感染
   1. 使用 10 ml 一次性注射器收集 Plat-E 培养皿中的逆转录病毒上清液，经 0.45 μm 孔径的尼龙膜滤器过滤后，转移至 15 ml 离心管中。
   2. 向细胞中加入 10 ml 新鲜的 Plat-E 培养基（不含抗生素），并将培养皿放回培养箱。
   3. 吸去待感染的 NIH 3T3 细胞培养皿中的培养基，加入 5 ml 正常 NIH 3T3 培养基和 5 ml 含病毒的过滤上清液。
   4. 以 6 μg/ml 的终浓度向培养皿中加入 polybrene。
   5. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下过夜孵育细胞。
   6. 次日，重复步骤 3.2.1 – 3.2.5，进行第二轮感染。
   7. 将含病毒的培养基更换为正常的 NIH 3T3 培养基。
   8. 让 NIH 3T3 细胞继续生长 2–3 周，根据需要更换培养基。通过平行培养板的全细胞裂解物进行常规蛋白质电泳和免疫印迹，检测目标蛋白的表达情况。

4. 染色与定量

1. 结晶紫染色
   1. 吸除 NIH 3T3 培养基，将培养皿置于冰上。
   2. 用预冷的 PBS 洗涤培养皿两次。
   3. 用预冷的甲醇固定细胞 10 分钟。
   4. 将培养皿从冰上取出，吸除甲醇，并加入 3 ml 溶于 25% 甲醇中的 0.5% 结晶紫溶液（室温）。
   5. 室温孵育 5 分钟。
   6. 吸除结晶紫溶液，用 Milli-Q H₂O 小心冲洗培养皿，直至冲洗液无色。
   7. 将培养皿在实验台上静置过夜干燥 （不加盖）。
2. 克隆灶定量
   1. 待培养皿完全干燥后，使用直尺测量培养板上深色的细胞集落。仅将直径大于 5 mm 的集落计为“克隆灶”。记录克隆灶数量，并计算相对于对照组的平均值及显著性差异。

结果

MXD3 是一种碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链（bHLHZ）转录因子，属于 MYC/MAX/MAD 调控网络。它是 MAD 家族中一种非典型的成员^13-15，已被报道参与致癌过程^16,17。与 pBABEpuro（阴性对照）和 MYC（阳性对照）相比，MXD3 过表达的 NIH 3T3 培养皿中形成的灶状集落显著减少（图 1A）。图 1B 中的数据来自多次实验，用于确定统计学显著性。

最初人们关注MXD3的致癌潜能，是因为它具有与已知癌基因MYC相似的活性。然而，本实验的结果表明，MXD3并不发挥癌基因的功能。

图1. 集落形成实验结果。 通过集落形成实验（FFA）在N...

讨论

FFA 提供了一种快速简便的方法来评估恶性转化 体外适用于筛选相对大量的候选基因，且其技术要求较低，具有较高的成本效益。此外，可同时共表达两个或更多基因（有时称为“协同作用”检测），以评估基因组合的致瘤潜力。该检测的优势在于操作简便、易于定量以及相对较短的实验周期。然而必须强调的是，该方法也具有所有此类实验共有的局限性 体外 检测。该检测通过测量癌细胞的一种表型特征——即在培养皿中生长超出单层的能力——来评估致癌转化。因此，阴性结果应谨慎解读，因为特定的癌基因可能在不促进该特定表型的情况下诱导转化，或需要与其他基因共表达才能发挥作用。即上述合作）。此时，建议通过其他方法评估转化效果 体外 方法，例如通过软琼脂实验测定增殖速率、血清需求和/或非贴壁依赖性生长能力。

尽管焦点形成分析（FFA）技术较为直接，但仍需遵守若干条件。最重要的是，必须使用自发转化率极低的3T3细胞亚克隆。由于该细胞系具有前癌变特性（这一特征使其对本实验极为敏感），某些冻存管中可能已含有大量预先转化的细胞，导致实验本底水平过高而无法接受。为最...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pBABE-puro 载体	Addgene	质粒 1764	克隆载体
Platinum-E 逆转录病毒包装细胞系，嗜同种型	Cell Biolabs, Inc.	RV-101	用于病毒生产的细胞系
NIH 3T3 小鼠细胞系	Sigma-Aldrich	93061524	用于集落形成实验的细胞系
10 ml BD Luer-Lok 尖端注射器	BD Biosciences	309604	病毒生产试剂
0.45 μm Puradisc 注射器滤器	Whatman	6750-2504	病毒生产试剂
聚乙烯亚胺（PEI）	Polysciences, Inc.	23966-2	细胞转染试剂
Polybrene 感染/转染试剂	EMD Millipore	TR-1003-G	细胞转染试剂
结晶紫	Fisher Scientific	C581-25	细胞染色试剂
质粒大提纯化试剂盒（Plasmid Plus Midi Kit）	QIAGEN	12945	质粒纯化
BD Falcon 组织培养皿	BD Biosciences	353003	细胞培养耗材
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	11995-065	细胞培养基
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054	细胞培养耗材
Opti-MEM I 低血清培养基	Gibco	31985-062	细胞培养基
胎牛血清（FBS）	Gibco	16000-044	细胞培养基