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小鼠皮肤平铺成像及其在毛囊排列模式与感觉轴突形态分析中的应用

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DOI：

10.3791/51749

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2014年6月25日

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1Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neuroscience, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Ophthalmology, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

本文内容

摘要

哺乳动物的皮肤包含多种结构——如毛囊和神经末梢——这些结构具有独特的空间分布模式。将皮肤作为平铺标本进行分析，可利用该组织的二维几何特性，获得皮肤结构的全层高分辨率图像。

摘要

皮肤是一种高度异质性的组织。皮肤内结构包括毛囊、立毛肌、表皮特化结构（如默克尔细胞簇）、皮脂腺、神经和神经末梢以及毛细血管。这些结构的空间排列在微观尺度上受到严密调控——例如单个毛囊内不同细胞类型的有序排列——同时也在宏观尺度上表现出精确性——例如皮肤局部区域内成千上万个毛囊近乎一致的取向。由于皮肤器官具有二维几何特性，因此无需物理切片即可实现对这些结构的可视化观察。在本实验方案中，我们展示小鼠皮肤可被完整解剖、固定、通透化、染色并作为完整的二维平面样本（即平铺标本）进行透明化处理。该方案通过光学切片与三维重建，可轻松实现对大面积皮肤全层厚度内各种结构的整体可视化。这些结构的图像还可与它们相对于身体轴线的位置和方向信息进行整合。

引言

皮肤是人体最大的器官之一，在躯体感觉、绝缘/体温调节以及免疫防御方面具有重要功能1。由于皮肤作为一个生物系统具有根本重要性，并且与皮肤病学密切相关，因此理解其发育和功能的分子与细胞基础长期以来备受关注。哺乳动物的皮肤包含多种多细胞结构，包括分层排列的角质形成细胞、真皮结缔组织、多种类型的毛囊、皮脂腺、竖毛肌、血管，以及至少十余种不同类型的传入（感觉）和传出神经纤维（图1）。身体不同区域具有特征性不同的皮肤类型。在大多数哺乳动物中，几乎整个体表都被密集分布毛囊的皮肤所覆盖。[人类和裸鼹鼠是这一模式的例外。] 手掌和足底表面无毛发，但具有特化的表皮纹路（皮纹）、外分泌腺以及感觉神经末梢。控制毛囊内细胞生长、分化和空间排列的细胞与分子事件尤其受到关注，因为每个毛囊都微型地展现出器官发生过程中的许多核心特征2。这些特征包括干细胞及其微环境的存在、精确调控的细胞迁移，以及由胚胎起源不同的组分组装成多细胞结构的过程。

本文介绍了将小鼠皮肤作为完整的二维薄片（称为“整体装片”或“平展装片”制备）进行解剖、固定、标记和成像的方法。由于小鼠皮肤相对较薄，可利用常规共聚焦显微镜对展平皮肤的全层进行成像。这种平展装片的哺乳动物皮肤成像方法在技术上具有优势，因为它避免了物理切片的需要，从而能够完全通过光学切片重建结构。由于几乎整个皮肤都被作为一个单一整体进行处理，平展装片法还能在保留相对于身体轴的位置和方向信息的同时，实现对体表多个区域的成像。最后，皮肤内的结构通常以规律间隔重复排列，因此便于从某一特定结构的多个实例中采集图像。这些特征对于研究视网膜（中枢神经系统的一个二维部分，在神经元形态学研究中具有类似优势）的神经生物学家而言是熟悉的3。

本文所述的平铺制片方法特别适用于研究在皮肤二维平面内具有较大尺度空间组织结构的生物学构造。一种典型的宏观空间组织形式是毛囊及其相关结构——默克尔细胞簇、立毛肌、皮脂腺和神经末梢——的协调极性4。毛囊相对于皮肤平面呈一定角度排列，其在皮肤二维平面内的分量通常相对于身体轴线具有精确确定的方向，且该方向随身体位置的不同而不同。例如，背部的毛囊指向从头侧到尾侧，足部背侧的毛发则指向从近端到远端。毛囊的方向由平面细胞极性信号通路（PCP；也称为组织极性5）调控。该信号系统最初在Drosophila中被发现，其中一组核心PCP基因被证实可控制表皮刚毛和刺毛的取向。三个核心PCP基因的哺乳动物同源基因——卷曲蛋白6同源物（Fzd6，也称为Fz6）、EGF-LAG七次跨膜G型受体钙黏蛋白1（Celsr1）以及vang样2（Vangl2）——在哺乳动物皮肤中发挥类似作用，协调毛囊方向与身体轴线的一致性。对Fz6基因敲除小鼠（Fzd6tm1Nat，下文简称为Fz6-/-）的研究表明，在缺乏PCP信号时，主要缺陷表现为毛囊初始方向的随机化或紊乱，但并不影响毛囊本身的内在结构6-8。此外，还存在第二种非PCP系统，在后期发挥作用，促进相邻毛囊的局部对齐，从而形成如旋毛和簇毛等大尺度毛发图样。

皮肤内大尺度空间组织的另一个例子体现在感觉轴突树突的形态上。支配皮肤的感觉神经元其胞体位于背根神经节和三叉神经节中。这些神经元能够感知温度、疼痛、瘙痒以及作用于皮肤和毛发的各种机械形变9。可根据轴突直径和传导速度、终末神经末梢结构以及受体、通道和其他分子的表达模式，将这些神经元划分为不同的亚型。由于皮肤内的神经支配密度很高，通过可视化所有轴突（例如，抗神经丝蛋白免疫染色）或甚至单一类别的全部轴突（如通过荧光报告基因标记单一细胞类型时所见）的方法，通常只能观察到大量轴突的密集重叠，从而无法界定单个树突的形态。为克服这一问题，我们采用了极为稀疏的遗传定向标记方法，获得背侧皮肤样本，使单个且彼此分离良好的轴突树突通过组织化学报告基因——人胎盘碱性磷酸酶的表达得以可视化10。该方法可清晰地显示单个轴突树突的形态特征，并基于形态学标准对体感神经元类型进行定义。

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方案

本研究严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。所有动物操作均按照约翰斯·霍普金斯医学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案 MO11M29 执行。有关安乐死的批准方法，请参考您所在机构的动物护理与使用委员会指南。处理醛类固定剂或有机溶剂时，应佩戴手套、实验服和护目镜。

1. 材料准备

  1. 浇注 Sylgard 平板
    1. 按照制造商的说明，将固化剂与基础剂混合，并用塑料棒搅拌。
    2. 每个直径为 10 cm 的组织培养皿中加入约 35 ml 液态 Sylgard。组织培养皿比标准细菌培养皿更深，可为昆虫针提供足够的垂直空间。
    3. 将培养皿置于室温下的水平表面上静置过夜。混合过程中产生的气泡将自行消失。
    4. 聚合完成后，将 Sylgard 平板在室温下保存。
      注意：Sylgard 平板可在室温下保存多年，并可多次重复使用，直至 Sylgard 从培养皿上脱落。
  2. 溶液配制
    1. 苯甲酸苄酯与苄醇（BBBA）。将 2 体积的苯甲酸苄酯与 1 体积的苄醇混合。避光保存于带玻璃塞或聚四氟乙烯（Teflon）盖的玻璃瓶中。
      警告：使用过的 BBBA 应作为有机溶剂废物妥善处理。避免 BBBA 接触塑料材料。
    2. 磷酸盐缓冲液（PBS）。将 4 g 多聚甲醛（PFA）加入 80 ml 水中，再加入 0.1 ml 1 N NaOH，在加热板上约 70 °C 搅拌约 5 分钟，直至 PFA 完全溶解，然后加入 10 ml 10× PBS，并加水定容至 100 ml。
      警告：为减少甲醛/PFA 和 BBBA 蒸气的吸入，应将这些溶液保存在带盖容器中。甲醛/PFA 为致癌物。
    3. 油红 O。用异丙醇配制 0.5% 储存液。使用前立即用水稀释至终浓度为 0.3% 油红 O，然后经 0.2 µm 滤膜过滤。

2. 皮肤解剖、固定与透明化

  1. 用于免疫染色和黑色素成像的背部皮肤
    1. 对于非常年幼的小鼠（例如，胎儿和出生后第（P）0–P3天的幼鼠），通过吸入异氟烷实施安乐死。对于年龄较大的小鼠，可通过吸入异氟烷，或注射氯胺酮/赛拉嗪后进行颈椎脱位实施安乐死。
    2. 使用电动剃刀和脱毛膏去除毛发。对于年龄小于P8的小鼠，此步骤可省略。
    3. 使用刀片从尾部基部开始，沿身体两侧各做一条水平切口，经过四肢基部的背侧，越过耳侧，最终延伸至鼻部。
    4. 戴上手套，用手指夹住皮肤，从后向前轻轻剥离皮肤，避免使用镊子夹紧皮肤。剥离至耳部区域时，先用剪刀剪除耳朵，并特别缓慢操作，因为此处皮肤容易撕裂。
    5. 此后，将皮肤内侧朝上放置。使用约20枚昆虫针将皮肤均匀地固定在Sylgard板上，针距大致相等，注意不要过度拉伸皮肤（图2B）。用10–20 mL PBS覆盖皮肤。
    6. 使用斜头或弯头镊子清除皮肤附着的脂肪和结缔组织，操作时使镊子尖端水平朝向，以降低穿透皮肤的风险。用棉签轻轻滚动皮肤表面，挤出皮肤下方滞留的气泡。
      注：若皮肤将用于平铺免疫染色或组织化学染色，应尽可能彻底清除结缔组织；若皮肤用于基于黑色素沉积观察毛囊，则结缔组织的清除程度可稍低。产前皮肤所附着的结缔组织仅需轻微“清理”即可。
    7. 向固定好的皮肤中加入20 mL新配制的4%多聚甲醛/PBS或每10 cm Sylgard板加入20 mL新配制的10%缓冲福尔马林（若皮肤用于黑色素成像或碱性磷酸酶（AP）组织化学染色），或加入20 mL新配制的2%多聚甲醛/PBS（若皮肤用于免疫染色或观察转基因Keratin（Krt）17-GFP11），并在4°C冷室中轻轻旋转过夜。次日，用PBS洗涤超过>10分钟。
      注：标准福尔马林含37%甲醛，因此“10%福尔马林”相当于3.7%甲醛。
    8. 对于AP染色和免疫染色，继续进行第3节操作。对于黑色素成像，将皮肤依次经梯度乙醇脱水（70%、95%、100%），每步一天，室温下轻轻水平旋转。同时清除残留的结缔组织。
    9. 当皮肤处于100%乙醇中时，移除昆虫针；如需要，可用剪刀修剪皮肤，去除带有针孔的最外周1–2 mm皮肤。
    10. 将皮肤转移至直径10 cm的玻璃培养皿中，将两片载玻片压在皮肤上以防止卷曲，然后加入20 mL BBBA。BBBA可快速硬化组织，因此在加入BBBA前，必须确保皮肤在载玻片重量下已充分展平。
    11. 在接下来的数小时内，每隔数秒将载玻片短暂抬起，使BBBA充分流过皮肤表面。
      注：操作BBBA时需佩戴手套。根据皮肤的年龄和取材部位，BBBA处理可能导致高达30%的组织收缩。
  2. 用于毛囊排列分析的足部皮肤
    注：通常分析的年龄范围为P1–P8。
    1. 安乐死后，于踝关节上方切断足部，并沿足底腹侧做一条直线切口。
    2. 从近端向远端方向，轻轻剥离皮肤与下方组织。
    3. 剪开脚趾以释放皮肤，并将其内侧朝上固定于Sylgard板上（图2C）。足部皮肤的结缔组织极少。
    4. 转基因Krt17-GFP皮肤现已可用于成像。若需进行黑色素成像，则按第2.1节所述进行固定、脱水和BBBA透明处理。
  3. 用于皮脂腺观察的足部皮肤
    1. 安乐死后，用戴手套的手指在皮肤表面涂抹脱毛膏并揉搓，静置10分钟。
      注：请勿使用电动剃刀，以免损伤足部娇嫩的皮肤。
    2. 用自来水清洗皮肤表面，然后按第2.2节所述进行解剖并固定于Sylgard板上。
    3. 在室温下用1%多聚甲醛/PBS固定30分钟，随后用PBS洗涤。
      注：足部皮脂腺在出生后第一周后才开始发育，使用油红O染色进行分析的最佳时间为P21，因为此时处于第一毛发生长周期中毛发色素沉着的最低点12，皮脂腺更易观察。对于白化小鼠，可在任何年龄进行该分析。为获得白化后代，可将有色毛发的突变小鼠与酪氨酸酶突变品系（如C57BL/6J-Tyrc-2J）杂交。
  4. 用于分析黑色素分布、毛囊方向及皮脂腺观察的尾部皮肤制备
    1. 安乐死后，在尾部基部做一圈环形切口，然后沿尾腹侧全长做一条纵向切口。
    2. 从尾尖开始剥离尾部皮肤，用一对镊子牢固夹住尾骨和/或结缔组织，另一对镊子夹住皮肤进行剥离。将尾部皮肤固定于Sylgard板上。
    3. 若分析黑色素分布和毛囊方向，按第2.1节所述进行固定和处理。若分析皮脂腺，应在固定前将尾部皮肤切成一系列长约0.5至1 cm的片段，并将皮肤片段在PBS/5 mM EDTA中37 °C孵育过夜，以减弱真皮-表皮粘附力13。
    4. 轻轻将表皮从真皮剥离，将表皮内侧朝上固定于Sylgard板上，并在室温下用4%多聚甲醛/PBS固定1小时。用PBS洗涤后，按以下方法进行油红O染色。
      注：解剖较年长尾部皮肤（例如，P21）前可使用电动剃刀和/或脱毛膏，但由于尾部毛发密度低于身体其他部位，此处理为可选步骤。

3. 染色反应

  1. 人胎盘碱性磷酸酶（AP）组织化学法用于可视化基因标记的轴突分支10,14,15 (图3A、B)
    1. 在Sylgard上用PFA固定后，将固定的皮肤组织放入10 cm玻璃培养皿中，并浸没于含1 mM MgCl₂的PBS中2在70 °C的水浴中轻轻旋转培养皿90分钟，以破坏内源性磷酸酶活性。
    2. 在室温下，将组织样本于含有 0.1 M Tris（pH 9.5）、0.1 M NaCl 和 50 mM MgCl₂ 的溶液中孵育 4–48 小时，通过组织化学方法显色检测碱性磷酸酶报告基因活性。2，0.34 µg/ml NBT 和 0.175 µg/ml BCIP，通常每张 P21 背部皮肤使用 10–15 ml 显色液。在解剖显微镜下监测反应过程，注意不要超过最佳显色时间，具体时间以轴突染色强度与非特异性 NBT 沉积的对比情况通过肉眼判断为准。
    3. 通过在1小时内用三份PBS/0.1%吐温-20溶液洗涤终止反应，将皮肤重新固定至硅胶板，经乙醇梯度脱水，然后将皮肤转移至含BBBA的10 cm培养皿中。
      注意：BBBA 会缓慢溶解 NBT 沉淀。在 BBBA 中的最初几小时内，细小的 NBT 沉淀背景将逐渐溶解，导致 BBBA 溶液颜色变深，而皮肤颜色变浅。数小时后应更换新鲜的 BBBA。
    4. 成像AP染色的皮肤后，将其转移至乙醇中 >室温下孵育1小时，然后将其保存在新鲜的乙醇中，置于-20 °C。碱性磷酸酶染色的皮肤样本以此方式可保存数月，信号无明显减弱。
  2. 油红O染色法用于可视化皮脂腺4 （图 3C-F）
    1. 移除昆虫针，将固定较轻的足部或尾部皮肤从Sylgard板转移至6孔组织培养板的孔中，每孔最多放置两个皮肤样本。在室温下用60:40异丙醇:水溶液洗涤5分钟。
    2. 在室温下，用2 ml 0.3% 油红O（溶于60:40异丙醇:水，见1.2节）染色2小时。
    3. 用60:40的异丙醇:水溶液在室温下洗涤5分钟，随后用水洗涤。用精细剪刀小心修剪皮肤边缘，包括针孔部位，使皮肤表面尽可能平整。
    4. 将皮肤置于载玻片上，外表面朝上，滴加几滴水或水溶性封片剂，盖上盖玻片，然后用胶带轻轻固定盖玻片边缘，以进一步压平皮肤。
  3. 平铺免疫染色4,16,17 (图3G,H)
    1. 切割一块PFA固定的皮肤组织，呈矩形（例如 1 cm × 0.5 cm），并通过不对称切口标记其方向（例如 剪去右前角。在水平旋转平台上轻轻旋转，进行孵育和洗涤步骤。在6孔或12孔组织培养板的孔中，用PBS多次洗涤以去除残留的PFA，随后在室温下用0.3% Triton X-100的PBS溶液（0.3% PBST）换液约10次，持续5–8小时，以通透皮肤组织。
    2. 在室温下，用含5%山羊血清和20% DMSO的0.3% PBST封闭液孵育一抗，持续五天。使用透明胶带或粘性塑料膜覆盖板孔，以防止蒸发损失。
    3. 用0.3% PBST更换10–15次，洗涤5–8小时，在含5%正常山羊血清和20% DMSO的0.3% PBST中，室温下与二抗孵育3天。
    4. 用 0.3% PBST 洗涤，5–8 小时内换液 10–15 次。
    5. 在25%、50%和75%甲醇中各脱水5分钟，然后在100%甲醇中脱水3次，每次20分钟。
    6. 在室温下用 BBBA 溶液避光孵育过夜。
      注意：出生后约 P1 之前的皮肤组织平铺免疫染色可按上述方法进行，但孵育和洗涤时间应相应缩短。例如，P1 皮肤使用一抗孵育过夜，二抗孵育数小时，中间以 0.3% PBST 洗涤 2–3 小时即可。如上所述，更年轻的皮肤组织足够薄，无需 BBBA 透明处理即可直接成像。
  4. 利用荧光神经末梢染料摄取法观察Merkel细胞簇图3I-L)
    AMI-43（绿色）和 AM4-65（红色）是可通过非选择性阳离子通道进入细胞的可固定荧光染料18在活体皮肤中，这些染料会被默克尔细胞选择性摄取并富集。
    1. 将1 mg AM1-43或AM4-65溶解于2 ml PBS中，分装后于-80 °C保存。
    2. 使用29 G针头，按每克体重2-10 µg的剂量，对新生幼鼠进行皮下注射染料。
    3. 一天后，处死小鼠并解剖背部皮肤。
    4. 在4%多聚甲醛/PBS中4 °C过夜固定皮肤，用PBS洗涤，然后按照第3.2节所述方法将皮肤组织封片。

4. 成像与图像分析

  1. 成像毛囊方向（图4）
    1. 使用解剖显微镜对浸没在BBBA中、置于载玻片下压平且仍位于玻璃培养皿中的背部、足部或尾部皮肤进行成像——此方法可最大限度减少BBBA对显微镜的污染。
    2. 从下方照亮培养皿。为减少视野内光照强度的空间差异，将玻璃培养皿抬高至距解剖显微镜标准工作面约10 cm的高度，并在光源上方放置一块漫射塑料板或玻璃板。
    3. 将皮肤放回100%乙醇中，于-20 °C长期保存。
      注意：皮肤在BBBA中停留超过一天会导致黑色素颗粒破裂。一旦皮肤经过BBBA处理，便会硬化并从此保持平整状态。不同皮肤样本可在其前缘和/或后缘通过一系列刻痕进行编码，以便共同存放，节省冰箱空间。
  2. 成像与追踪轴突分支（图3A,B）
    1. 将经过AP染色的皮肤（第3.1.3节）置于用于小型蛋白质凝胶的两块载玻片之间。避免在载玻片与皮肤之间引入气泡，然后用纸巾小心吸除多余的BBBA。将载玻片-皮肤-载玻片的夹心结构放置于显微镜载物台上（图2D）。
    2. 使用10X物镜，明场或微分干涉差（DIC）照明，Z轴步长为2 µm或5 µm。利用机械化的X-Y载物台采集一系列X-Y图像，拼接形成单一的三维灰度数据集。
      注意：对于单个较大的轴突分支，该数据集大小可达5 GB。
    3. 使用多种软件包对轴突分支进行手动、自动或半自动追踪。
      注意：Neuromantic软件（http://www.reading.ac.uk/neuromantic/）是一种可在PC环境中运行的免费神经元重建工具，相对易于掌握10。

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结果

明场成像可用于观察皮肤平铺片中的皮肤感觉传入神经（图3A10）以及基于黑色素沉着的毛囊排列模式（图4）。共聚焦成像可用于界定以下结构的几何形态：（1） Merkel细胞簇，可通过抗角蛋白6抗体标记或AM染料摄取显示（图3I-L）；（2）立毛肌，可通过抗平滑肌肌动蛋白抗体标记显示（图3G,H）；（3）皮脂腺，可通过油红O染色显示（图3C-F）；（4）毛囊，可通过Krt17-GFP转基因表达或抗Krt17抗体染色显示4（图3E-G,K,L）。通过在图像中使用Adobe Photoshop或Illustrator对结构添加已知方向的矢量，可手动评估这些结构的方向和空间排列，并进一步量化所得的矢量群体。尽管该方法适用于数百个矢量规模的分析，但在大10倍或100倍的规模下将变得极为繁琐，难以实施。

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讨论

掌握上述解剖方法仅需耐心、稳定的手法以及一些优质的解剖工具。背部皮肤解剖相对容易，但尾部和足部皮肤的解剖——尤其是在出生后早期阶段——更具挑战性。在较早的胚胎期（例如，E15之前），皮肤极易撕裂，难以完整剥离。幸运的是，对于许多关于小鼠皮肤结构生长与模式形成的研究而言，关键事件发生在出生后阶段，例如竖毛肌生长的研究即为一例19。

以平铺方式对皮肤深层进行成像具有挑战性，因为皮肤是一种折射率较高的组织。随着皮肤成熟，其结构层发生分化且厚度增加，这一挑战进一步加大。解决该问题的一种部分方法是将真皮与表皮分离，并将表皮作为独立结构进行分析（“表皮全层制片”）。该方法适用于观察毛囊及其相关结构，尤其适用于小鼠尾部皮肤。然而，从小鼠背部皮肤获取高质量的表皮全层制片较为困难，推测原因可能包括：（1）毛囊密度较高且深入真皮层；（2）间毛囊表皮较薄13。

根据我们的经验，BBBA 处理是一种非常有效的方法，可在无需分离表皮和真皮层的情况下使皮肤在光学上透明，同时保留免疫荧光信号。苯...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Amir Rattner博士对本文手稿提出的有益意见。本研究由霍华德·休斯医学研究所资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-溴-4-氯-吲哚磷酸盐（BCIP）Roche11383221001
AM1-43Biotium70024
AM4-65Biotium70039
苯甲醇Sigma402834
苯甲酸苄酯Sigma B-6630
共聚焦显微镜ZeissLSM700
Cy3-α-平滑肌肌动蛋白抗体Sigma C61981:400
细胞角蛋白-8 发育研究杂交瘤库TROMA-I-c1:500
解剖显微镜
解剖工具 精细科学工具公司剪刀和镊子
电动剃须刀
Fluoromount GEM Sciences17984-25
福尔马林SigmaHT501320
玻璃培养皿Pyrex 直径6 cm和10 cm
玻璃板Amersham BiosciencesSE202P-1010 cm × 8 cm × 1 mm
脱毛剂 Nair
水平旋转平台 HoeferPR250 Orbital shaker
昆虫针Fine Science Tools 26002-20
氯胺酮/赛拉嗪SigmaK113
硝基蓝四氮唑（NBT）Roche 11383213001
油红OSigmaO0625
多聚甲醛Sigma P6148
剃刀刀片VWR55411-055
二抗 InvitrogenAlexa染料偶联 
Sylgard-184赛默飞世尔科技NC9020938
组织培养塑料培养皿直径10 cm
组织培养板6孔和12孔 

参考文献

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