小鼠多巴胺能神经元的原代培养

摘要

多巴胺能神经元在大脑中发挥着重要的调节作用，其丢失与帕金森病相关。在本视频中，我们展示了如何从胚胎小鼠中脑分离培养原代中枢多巴胺能神经元。此类培养体系可用于研究这些神经元对各种应激因素高度敏感的特性。

摘要

多巴胺能神经元占大脑神经元总数不到1%。尽管数量稀少，这类神经元却调控着运动控制、动机以及工作记忆等重要的脑功能。在帕金森病（PD）中，黑质纹状体多巴胺能神经元会发生选择性退化。这种进行性的神经元丢失与疾病的运动症状（如运动迟缓、静止性震颤和肌肉强直）明确相关。目前，导致多巴胺能神经元退化的主因仍不明确。然而，这些神经元在多种条件下表现出极高的易损性。原代培养是研究多巴胺能神经元特性和功能的最重要模型之一。此类培养体系可暴露于多种模拟PD病理的应激因子中，也可用于评估神经保护化合物是否能够阻止或延缓神经元退化。过去十年中，大量帕金森病转基因小鼠模型的建立进一步提升了科研人员对多巴胺能神经元培养的兴趣。本视频方案重点介绍胚胎小鼠脑组织的精细解剖过程。准确切除中脑腹侧区域对于获得富含多巴胺能细胞的神经元培养体系至关重要，以确保后续实验研究的可行性。该方案适用于胚胎期转基因小鼠，可用于免疫荧光染色、定量PCR、第二信使定量分析或神经元死亡/存活评估。

引言

多巴胺是大脑中一种重要的神经递质^1,2，主要由中脑多巴胺能（DA）神经元释放。大多数DA神经元位于中脑的腹侧区域^2-6。从解剖和功能上看，中脑DA神经元可划分为三个结构和功能上不同的投射系统：黑质纹状体通路、中脑边缘通路和中脑皮层通路^2,5。其中，黑质纹状体通路参与运动行为调控，中脑边缘通路在强化、动机和学习过程中发挥重要作用，而投射至前额叶皮层的多巴胺能通路则与认知功能相关²。

多巴胺能神经元参与多种人类神经系统疾病，如精神分裂症、注意力缺陷、多动障碍以及帕金森病（PD）^2,4。帕金森病的特征是连接黑质致密部（SNc）与纹状体的多巴胺能神经元发生进行性且选择性的退化。黑质-纹状体多巴胺能神经元的丧失导致纹状体中多巴胺严重耗竭，从而引发帕金森病的运动症状（运动迟缓、静止性震颤和肌强直）⁷。特发性帕金森病的初始病因尚未明确，目前的治疗手段仅能缓解症状，旨在恢复纹状体中的多巴胺水平。最常用的药物是左旋多巴（L-Dopa），即多巴胺的天然前体。尽管左旋多巴的使用可在一定时间内补偿多巴胺的缺失，但长期治疗后会出现运动并发症（异动症和“开关”现象）^8,9。

关于多巴胺能神经元和帕金森病（PD）的研究正在不断推进，人们正大力开展基于细胞移植、基因治疗或神经保护剂的治疗方法开发

方案

 本研究中使用的小鼠均按照欧洲联盟关于实验动物使用指南（86/609/EU）的规定进行饲养和操作。

1. 所需溶液的配制

1. 储备溶液
   1. 10× 多聚-L-鸟氨酸（PLO）溶液：称取10 mg PLO氢溴酸盐（分子量 = 30,000–70,000），溶于70 ml无菌水中。使用0.2 µm 注射器滤器过滤，分装后于-20 °C保存。
   2. 30% 葡萄糖溶液：称取30 g D(+)-葡萄糖，用无菌水定容至100 ml。过滤、分装后于4 °C保存。
   3. 5× DMEM/F-12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基/Ham F-12营养混合物）：称取6 g DMEM/F-12 Ham粉末，用无菌水定容至100 ml。过滤、分装后于4 °C保存。
   4. 7.5% 碳酸氢钠（NaHCO₃）溶液：称取7.5 g NaHCO₃，用无菌水定容至100 ml。过滤、分装后于4 °C保存。
   5. 1 M HEPES溶液：称取23.8 g HEPES，用无菌水定容至100 ml。过滤、分装后于4 °C保存。
   6. 70%（v/v）乙醇：将70 ml无水乙醇与30 ml无菌水混合稀释。
2. 含葡萄糖和抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS-GAB）：向500 ml杜氏磷....

结果

中脑培养步骤的图示流程见图1。简言之，从怀孕的Swiss小鼠中获取E13.5胚胎后，从中完整胚胎中分离出腹侧中脑组织。分离的脑组织依次进行酶消化和机械解离。解离后的细胞经离心沉淀，重悬于培养基中，并接种于预先包被的12孔或24孔板中。细胞培养最长可达15天，期间无需更换培养基。

与步骤3.2相对应的腹侧中脑解剖详细流程图如图2所示。虚线红框表示E13.5小鼠脑示意图上的三条主要切割线（改编自Prestoz et al.³⁰），并图示了切割步骤。

培养1天、4天和7天后的相差显微图像 体外 （体外培养天数，DIV）如图所示 图3神经元迅速长出突起并出芽（图3A）。在DIV4和DIV7时，分支和分枝更为延伸（图3B-3C).

使用抗TH抗体通过免疫细胞.......

讨论

本方案介绍了从胚胎小鼠制备中脑神经元原代培养所需的步骤和试剂，以及通过免疫荧光检测多巴胺能神经元的方法。该操作的关键步骤包括胚胎的解剖和收集到的脑组织碎片的机械性分离。高质量的解剖器械有助于掌握解剖技术。多巴胺能（DA）神经元在中脑中所占比例较小，因此准确获取腹侧中脑的特定区域对于获得含有2-4% DA神经元的培养物至关重要。机械分离过程应谨慎轻柔地进行。如果培养物中存在未充分解离的神经元团块，应增加一至两次吹打步骤。

本实验方案采用无血清培养基进行神经元培养。然而，需要用血清包被以增强细胞的贴壁。激素混合物可替代血清，其成分为明确组分，能够支持神经元生长，同时最大限度地抑制胶质细胞的存活与增殖。因此，非神经元细胞约占培养细胞总数的2-3%（通过GFAP染色进行定量）。另一种方法是，在培养基中添加血清，并在接种后两天加入阿糖胞苷（cytosine-β-D-arabinofuranoside, ara-C，5–8 μM），以抑制胶质细胞的增殖²⁶。除激素混合物外，还可使用成分明确的培养基及补充物²⁹。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胎牛血清	Lonza	14-801F
含L-谷氨酰胺的DMEM（4.5 g/L葡萄糖）	Lonza	BE12-604F
0.05%胰蛋白酶-EDTA（1×），含酚红	Life Technologies	25300-054
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	Life Technologies	15140122
L-谷氨酰胺，200 mM溶液	Life Technologies	25030123
Dulbecco’磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco’s改良Eagle’s培养基/营养混合物F-12 Ham	Sigma-Aldrich	D0547	粉末
层粘连蛋白 - Tris缓冲NaCl溶液中1 mg/ml	Sigma-Aldrich	L2020
聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	P3655
猪胰岛素	Sigma-Aldrich	I5523
人脱铁转铁蛋白	Sigma-Aldrich	T1147
盐酸亚精胺	Sigma-Aldrich	P5780
孕酮	Sigma-Aldrich	P8783
亚硒酸钠	Sigma-Aldrich	S5261
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G7126	1 M水溶液储备液
明胶	Sigma-Aldrich	G9391	2%（w/v）水溶液储备液
曲拉通X-100	Sigma-Aldrich	T8532
水中16%多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	RT 15710-S
碳酸氢钠（NaHCO3）	Merck Millipore	106329
D(+)-葡萄糖一水合物	Merck Millipore	4074-2
盐酸 - c(HCl) = 1 mol/L（1 N）Titripur	Merck Millipore	109057
无菌水 - Aqua B. Braun	Braun
绝对乙醇 NORMAPUR 分析纯试剂	VWR	20821.321
无菌培养皿	VWR	82050-566
普通玻璃巴斯德吸管 - Wilhelm Ulbrich GdbR.	VWR	612-2297
Malassez计数板	VWR	631-0975
带Supor膜的无菌血清Acrodisc注射器滤器，GF/0.2 µm，37 mm	PALL Life science	4525
外科剪刀 - 直型，尖-尖刃，14.5 cm长	Fine Science Tools	14002-14	用于切开腹壁
剪刀 - 直型，尖头，精细，10 cm长	MORIA	4877A	用于切开子宫壁
镊子 - 弯型，普通，带锯齿夹头（1 mm）	MORIA	2183	用于操作胚胎
Vannas剪刀 - 弯型，尖头，7 mm刀片	MORIA	MC50	用于取出中脑
超细镊子 - 弯型，精细，13 cm长	MORIA	9987	用于去除脑膜
BD BioCoat 聚-D-赖氨酸24孔多孔板	BD Bioscience	356414
BD Falcon 12孔细胞培养板，平底带盖	BD Bioscience	353043
SuperFrost显微镜载玻片，磨边90º	MENZEL-GLÄSER	AG00008032E
精密盖玻片，厚度No. 1.5H，圆形，直径18 mm Ø	MARIENFELD	117580
兔多克隆抗微管相关蛋白2（MAP2）抗体	Chemicon Millipore	AB5622	1/200
小鼠单克隆抗谷氨酸脱羧酶（GAD67）抗体，克隆1G10.2	Chemicon Millipore	MAB5406	1/400
大鼠单克隆抗多巴胺转运体（DAT）抗体，克隆DAT-Nt	Chemicon Millipore	MAB369	1/500
小鼠单克隆抗5-HT抗体			1/8,000 - 由瑞士Yves Charnay慷慨赠送（Yves.Charnay@hcuge.ch）
新西兰来源山羊血清	Life Technologies	16210-064
Alexa Fluor 405山羊抗兔IgG（H+L）抗体	Life Technologies	A-31556	1/200
Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG（H+L）抗体	Life Technologies	A-11001	1/1,000
Alexa Fluor 594山羊抗大鼠IgG（H+L）抗体	Life Technologies	A-11007	1/1,000
VECTASHIELD HardSet封片介质	Vector Laboratories	H-1400
体视显微镜	Carl Zeiss microscopy	Stemi-2000C
Bunsen Burner FIREBOY	VWR	451-0136