高通量检测方法以 体外 表型 沙门氏菌 或高通量检测细菌在吞噬细胞中的定植、侵袭及复制能力的方法已被建立。该方法已被用于评估 沙门氏菌 基因敲除突变菌株在宿主-病原体相互作用中的作用研究。
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摘要
摘要
沙门氏菌 某些物种是人畜共患的病原体，也是导致人类和家畜食源性疾病的主要原因1. 理解其潜在机制 沙门氏菌-宿主相互作用是 阐明分子发病机制至关重要 沙门氏菌 感染。用于表型分析的庆大霉素保护实验 沙门氏菌 在吞噬细胞中的黏附、侵袭和复制能力的检测方法已改进，可用于高通量筛选，以明确缺失突变体的功能作用 肠道沙门氏菌 使用RAW 264.7小鼠巨噬细胞研究伤寒沙门菌血清型Typhimurium在宿主相互作用中的作用. 在此方案下，由于可在同一培养皿中同时检测野生型和多种突变株，测量结果的变异显著低于标准方案。使用多通道移液器可提高通量并增强操作精度。此外，本方案还解决了在96孔培养板中每孔使用较少宿主细胞的相关问题。以下是该改进方案的 体外沙门氏菌 使用吞噬细胞的侵袭实验成功用于表型分析38个个体 沙门氏菌 用于检测结合、侵袭和胞内复制的缺失突变体。 体外 表型被呈现出来，其中一些随后被证实具有 体内 动物模型中的表型。因此，经过改进的标准化表型分析方法 沙门氏菌 可利用具有高通量能力的巨噬细胞相关性、侵袭和复制研究方法更广泛地分析细菌与宿主之间的相互作用。
引言
非伤寒沙门氏菌 沙门氏菌 是所有脊椎动物肠道疾病的重要病因。人类沙门菌病是主要的细菌性食源性疾病之一1分子机制的表征，这些机制支撑着相互作用 沙门氏菌 与其动物宿主之间的相互作用主要通过以下研究实现 鼠伤寒沙门氏菌 血清型鼠伤寒沙门氏菌（STM）在组织培养和感染动物模型中的研究。深入了解STM与宿主之间的相互作用将有助于我们理解其致病机制 沙门氏菌 在宿主细胞内存活并生长。研究这些相互作用的首要挑战是尽可能鉴定出宿主和病原体双方参与的因子，但这一努力在很大程度上受到同时处理两个独立且复杂的生物系统所带来显著困难的阻碍， 即宿主和 沙门氏菌, 在生理条件下。此外，其庞大的功能谱系 沙门氏菌 而可能编码参与宿主相互作用因子的宿主基因，需要高通量生物平台来应对这一挑战。
一种改良的标准化表型分析方法 沙门氏菌 结合，侵袭 并在巨噬细胞中建立了具有高通量能力的复制实验，用于检测一组可能参与其中的基因 沙门氏菌-宿主相互作用。庆大霉素保护实验于1973年建立2，但首次被Elsinghorst于1994年进行了详尽描述3,4它现已成为研究多种胞内细菌病原体的标准工具 离体，包括 沙门氏菌5,6. 内化细菌可避免被某些无法穿透真核细胞的抗生素（如庆大霉素）杀死3通过利用这一现象，庆大霉素保护实验可检测胞内细菌病原体的存活与增殖情况。感染过程中的三个事件， 即，与真核细胞的结合、侵袭和复制，可根据感染、庆大霉素处理及后续孵育之间的时间间隔来评估胞内细菌病原体的这些特性（图 1真核细胞系为宿主-病原体相互作用研究提供了比相关动物模型更简单的生理环境。
庆大霉素保护实验是研究沙门氏菌与宿主相互作用的合适平台，但使用24孔培养板的标准实验方法通量较低。计算分析 体内 数据集鉴定了149个 沙门氏菌 预测可与约300种宿主基因产物相互作用的基因产物（未发表数据）。标准的庆大霉素保护实验无法高效地对如此数量的突变体进行表型分析。
此外，庆大霉素保护实验理论上能够检测到单个细菌的侵袭。由于其固有的高灵敏度，重复实验在不同时间进行时，原始数据容易受到技术性差异的影响。因此，通过标准化处理后的内部对照和相对数据呈现对于结果的合理解读至关重要。鉴于上述因素，本研究建立了一种经过改进的标准化庆大霉素保护实验方法，以提高检测通量并增强实验的精确性。
以下方案详细描述并图示了如何使用96孔培养板和小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系进行改良的庆大霉素保护实验。与传统的24孔培养板标准方案相比，该改良方案具有以下优势：1）使用96孔培养板可同时对多达10种不同的突变菌株进行表型分析，包括设置内部阳性和阴性对照，且具备足够的统计学效力；2）由于所有突变菌株在同一块培养板中同时进行测试，实验结果的变异显著降低；3）多通道移液器的使用提高了实验通量，同时减轻了操作人员的疲劳。最后，针对96孔板每孔宿主细胞数量较24孔板更少的担忧，本方案通过优化和标准化流程予以解决。
总之，这种经过改进的标准化检测方法 体外 表型 沙门氏菌 或通过其他细菌在吞噬细胞中的定植、侵袭和复制来提高精确度，并在降低操作者疲劳的同时实现高通量能力。
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方案
1. 小鼠巨噬细胞 RAW264.7 培养
- 在T-75细胞培养瓶（带透气滤盖）中培养低传代次数的小鼠巨噬细胞RAW264.7（ATCC®编号：TIB-71），使用添加10%胎牛血清（FBS）、0.5% NaHCO3和1% 100倍非必需氨基酸（NEAA）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），于37°C、5% CO2培养箱中培养。
- 当细胞在培养瓶中达到60–80%融合度时，使用细胞刮收集细胞，用血细胞计数板计数并计算细胞浓度。
- 重悬细胞，并用新鲜DMEM细胞培养基将细胞浓度调整至2.5 × 105/ml。使用多通道移液器将含5 × 104个细胞的200 μl DMEM细胞培养基接种至96孔细胞培养板的每孔中。
- 每种沙门氏菌（Salmonella）菌株接种四个孔。为一组吞噬细胞侵袭实验准备三块独立的96孔板，并分别标记为“黏附”、“侵袭”和“复制”。
- 将培养板置于37°C、5% CO2培养箱中过夜培养，使巨噬细胞贴附于孔底。
2. 准备 沙门氏菌 野生型与突变体
- 在准备巨噬细胞RAW264.7细胞的同一天，挑取野生型（WT）Salmonella enterica 伤寒血清型Typhimurium 14028s、DinvA 突变株、DphoP 突变株以及所需测试突变株的单菌落，并在适当添加抗生素的Luria-Bertani（LB）肉汤中培养。每组吞噬细胞侵袭实验最多可同时检测10种突变株（其中DinvA 突变株在侵袭能力方面存在缺陷，DphoP 突变株则在胞内复制方面存在缺陷）。
- 将细菌在5 ml LB肉汤中，于37 °C、220 rpm振荡条件下，在14 ml带松盖聚丙烯圆底管中培养14小时。LB肉汤中需加入适当的抗生素，本实验中大多数突变株对卡那霉素具有抗性，浓度为50 µg/ml。
- 次日，将前夜培养的各株Salmonella菌液按1:50比例接种至5 ml普通LB肉汤中，继续在220 rpm振荡条件下培养4小时。
- 使用分光光度计测定各细菌培养物的OD600值，理想范围应为0.6–1.2，以优化Salmonella致病岛-1 III型分泌系统（SPI-1 TTSS）基因的表达，促进侵袭能力。
- 利用公式1 OD600 = 7.5 × 108 CFU/ml估算细菌浓度，随后将细菌用新鲜DMEM细胞培养基稀释至5 × 106 CFU/ml的浓度。
3. 96 孔培养板中的侵袭实验
- 从 CO2 培养箱中取出三个 96 孔细胞培养板，每孔用 200 μl 的 1× PBS 缓冲液清洗一次。
- 清洗并完全移除 PBS 后，向每孔加入 200 μl 含细菌的 DMEM 培养基（见上文）。这将使每孔含有 1 × 106 个 Salmonella 细胞，感染复数（MOI）为 20:1。
- 将培养板在密封转子中以 1,000 × g 离心 10 分钟，然后将培养板放回 37 °C、5% CO2 培养箱中继续孵育 30 分钟（时间零点）。对每种菌株至少设置四个重复孔。
- 30 分钟后，从培养箱中取出培养板，用 200 μl 1× PBS 洗涤三次，以去除未结合的细菌。
- 洗涤后，保留标记为“结合”（association）的培养板用于后续处理。向标记为“侵袭”（invasion）和“复制”（replication）的培养板各孔中加入 200 μl 含 100 μg/ml 庆大霉素的 DMEM 培养基，以杀灭细胞外的 Salmonella。将培养板放回 37 °C、5% CO2 培养箱中继续孵育 1 小时。
- 为每种感染菌株保留一个孔用于记录巨噬细胞数量，其余“结合”板上的孔则每孔加入 200 μl 含 1% Triton X-100 的 1× PBS 处理 10 分钟。Triton 溶液将裂解巨噬细胞并释放结合的 Salmonella。
- 从每孔收集 Salmonella 并转移至 1.5 ml Eppendorf 管中。对每孔收集的样品用 900 µl 1× PBS 进行连续三轮 10 倍梯度稀释，每次稀释之间需涡旋混匀。
- 取第三次稀释液（10-3）接种于 LB（WT）或 LB Kan（突变株）平板上。在平板上标注相应的 Salmonella 菌株名称、稀释倍数、时间点和日期。
- 第三次稀释管涡旋混匀后，取 10 µl 样品滴加到琼脂表面，重复操作共 5 次，总计 5 滴。确保将 5 个 10 μl 的液滴均匀分布在培养皿表面7。
- 待液滴完全渗入琼脂后，将平板倒置，在 37 °C、5% CO2 培养箱中过夜孵育。
- 对保留用于巨噬细胞计数的孔，加入 150 µl 含 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 的 1× PBS 处理 10 分钟。
- 胰蛋白酶消化后，将巨噬细胞转移至 1.5 ml Eppendorf 管中，加入 50 µl FBS 以中和胰蛋白酶/EDTA 溶液，用 0.4% 台盼蓝染色，并通过血细胞计数板进行计数。
- 1 小时孵育结束后，从 CO2 培养箱中取出“侵袭”和“复制”培养板，各孔按“步骤 3.4”进行洗涤。
- 保留“侵袭”板用于后续“步骤 3.6–3.12”的处理。
- 向“复制”板每孔加入 200 μl 含 10 μg/ml 庆大霉素的 DMEM 培养基，以持续清除培养基中细胞外的 Salmonella。将培养板放回 37 °C、5% CO2 培养箱中继续孵育 22.5 小时。
- 次日，从 37 °C、5% CO2 培养箱中取出“复制”板，各孔按“步骤 3.4”进行洗涤，并按“步骤 3.6–3.12”进行处理。
- 最后，从 37 °C 培养箱中取出过夜孵育后的琼脂平板，计数细菌菌落数量。
- 理想的菌落分布应为每块平板上 10 至 100 个菌落，每个点大约包含 2 至 20 个菌落， 若单个点菌落数超过 20 个则难以准确计数。若计数过高或过低，应根据需要重新接种 10 倍更高或更低稀释度的样品。
4. 数据分析
- 根据接种体积和稀释倍数，计算每块平板的 CFU（每毫升菌落形成单位）。
- 通过各菌株记录的巨噬细胞数量，确定每个巨噬细胞内的 Salmonella 数量。
- 分别计算至少三次独立实验中每巨噬细胞 CFU 的几何平均值，用于细胞黏附、侵袭或复制，并进一步以野生型（WT）为基准进行归一化处理以获得相对值。
- 分别采用 Student’s t-检验对黏附、侵袭和复制数据进行分析，将每种菌株与野生型（WT）进行比较，并通过 p 值确定统计学显著性。
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结果
根据改良的吞噬细胞侵袭实验绘制数据后，可得到代表性结果（图2）。数据包含五种不同菌株：WT、ΔinvA、ΔphoP、突变株A和突变株B。ΔinvA因侵袭能力缺陷，ΔphoP因复制能力缺陷8，被用作阳性对照以评估实验的有效性。事实上，在改良的侵袭实验中，ΔinvA突变株被RAW264.7细胞内化的能力显著降低，而ΔphoP突变株在24小时后复制能力下降。突变株A和突变株B是使用本实验方案检测的代表性菌株。突变株A表现出显著的复制能力降低（图2），与ΔphoP突变株相似；有趣的是，突变株B则表现出复制能力显著增强（图2）。这些数据明确表明，这两个突变株在巨噬细胞中的侵袭和存活表型均发生了改变。
总之，大量 沙门氏菌 缺失突变体通过改良的侵袭实验，分别进行了表型分析，以评估其在细菌与RAW264.7巨噬细胞的黏附、侵袭及复制...
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讨论
庆大霉素保护实验被广泛用于研究胞内细菌病原体在宿主细胞内的侵袭与复制过程，尤其是一种重要的生物学工具，用于研究诸如Salmonella等以侵袭作为建立感染先决条件的病原体1。在Salmonella研究领域，标准的庆大霉素保护实验通常在24孔培养板中进行5。尽管先前已有讨论使用48孔甚至96孔板以实现高通量检测9，但尚未有详细描述并成功应用于细菌突变体集合检测的实际方案。本文开发了一种经修改和标准化的实验方案，采用96孔培养板对Salmonella突变体进行表型分析。需特别指出的是，该方案仅针对Salmonella和吞噬性细胞进行了测试，因此 在应用于其他细菌或宿主细胞时，显然需要进行相应的修改和优化。
改良的庆大霉素保护实验在表型分析方面具有多种优势 沙门氏菌 与吞噬细胞的黏附、侵袭及复制。首先，96孔培养板的格式支持高通量检测与分析，可同时检测多达10种不同菌株，并具备足够的重复次数以进行统计学分析和设置内部对照。其...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本项目部分得到了美国国立卫生研究院过敏与传染病研究所资助（A.J.B. 和 L.G.A.，R01 AI076246）。 沙门氏菌 突变体文库的构建部分得到了美国国立卫生研究院基金（M.M.：U01 AI52237-05、R01 AI07397-01、R01 AI039557-11 和 R01 AI075093-01）以及美国国立卫生研究院基金（H.A.P.：R21 AI083964-01、1R01 AI083646-01、1R56AI077645、R01 AI075093）的部分支持。我们感谢 Steffen Prowollik 在复制平板接种及文库中突变体验证方面的工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM） | Life Technologies | 11965 | |
| 胎牛血清 | HyClone | SH30910.03 | |
| 带透气滤盖的T-75细胞培养瓶 | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100倍非必需氨基酸溶液（100x Non-Essential Amino Acids） | Life Technologies | 11140 | |
| 细胞刮刀 | BD Falcon | 353086 | |
| 96孔细胞培养板 | Corning Incorporated | 3595 | |
| LB液体培养基（Luria-Bertani broth） | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 ml 聚丙烯圆底离心管 | BD Falcon | 352059 | |
| 磷酸盐缓冲液，pH 7.4（1x PBS） | Life Technologies | 10010 | |
| 曲拉通 X-100（Triton X-100） | Sigma | T-8787 | |
| 卡那霉素溶液 | Sigma | K0254 | |
| 庆大霉素溶液 | Sigma | G1272 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Life Technologies | 25200 | |
| 台盼蓝染液（Trypan blue） | Sigma | T8154 |
参考文献
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