本文介绍一种简单、快速的方法，用于表征假定细胞黏附分子的内在黏附特性。将细胞黏附分子分泌的、带有表位标签的胞外结构域从培养基中捕获至小型、均一的功能化微珠上。随后可立即利用这些微珠进行简单的微珠聚集实验。
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摘要
摘要
细胞间黏附对于多细胞生命至关重要，主要由多种细胞表面蛋白介导。然而，许多此类蛋白的黏附相互作用仍不清楚。本文介绍一种简单、快速的方法，用于表征假定的同嗜性细胞黏附分子的黏附特性。将编码细胞表面蛋白分泌型、表位标记的胞外域的DNA质粒转染至培养的HEK293细胞中。利用针对该表位标签的特异性功能化微珠，从培养基中捕获可溶性分泌的融合蛋白。包被后的微珠可直接用于微珠聚集实验或荧光微珠分选实验，以检测同嗜性黏附。如有需要，还可进一步通过定点突变技术解析介导黏附所必需的特定氨基酸或结构域。该方法仅需少量表达蛋白，无需构建稳定细胞系，可在4天内完成。
引言
细胞间黏附对于多细胞生物的发育和结构完整性至关重要，主要由多种细胞表面分子介导。尽管已有许多黏附分子被鉴定和表征，但仍有许多尚未被发现。目前有多种方法用于研究细胞黏附分子（CAMs）的特性，包括细胞分选实验、细胞聚集实验1-8以及生物物理方法，如原子力显微镜和表面力谱法9-12。
即使使用细胞系的简化体外（in vitro）系统也具有复杂性，这使得确定一种假定的细胞黏附分子（CAM）的黏附特性变得困难。通常，如果一个分子在转染到非黏附性细胞系后能够诱导细胞聚集，则被认为是一种CAM。然而，这显然并非黏附活性的直接证据。例如，促进CAM在细胞表面的递送或稳定性也会导致细胞聚集增加1,13。此外，如果细胞系缺乏细胞表面递送或稳定所必需的其他辅助因子，真正的CAM也可能无法介导细胞聚集。
为避免这些复杂因素，可采用更为直接的检测方法，其原理基于黏附相互作用应为细胞外结构域固有的生化特性。尽管最初使用微珠来表征Ng-CAM2，但此类检测方法已被拓展用于研究钙黏蛋白介导的黏附作用12,14,15。Gumbiner实验室通过C-钙黏蛋白胞外域与Fc片段的融合蛋白发现，多个钙黏蛋白重复序列均参与同嗜性相互作用14。利用类似的微珠聚集检测方法，E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白的黏附特性也已被表征12,15，此外还包括多种原钙黏蛋白1,15-18以及来自Drosophila19的Dscam异构体。本文中，我们描述了一种相对简单且快速的检测方法，用于表征分泌型、表位标签标记的假定同嗜性细胞黏附分子（CAMs）胞外域的黏附活性（图1）。我们主要利用该方法对钙黏蛋白超家族成员进行表征。
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方案
1. 细胞准备（第 -2 天至第 0 天）
- 使用0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液以1:5比例传代HEK293细胞，并在37 °C、5% CO2条件下于生长培养基中培养至60–80%汇合度（2–3天）。每种实验条件需在2个100 mm培养皿中分别培养细胞。
2. 细胞转染（第1天）
- 使用转染试剂（如Lipofectamine）将编码Fc融合蛋白的质粒转染HEK293细胞。也可采用其他能达到相当转染效率的替代方法。
- 将转染后的细胞放回培养箱中孵育24小时。
3. 细胞传代（第2天）
- 将不含胎牛血清（-FBS）的生长培养基预热至 37 °C。
- 用 10 ml 不含胎牛血清的生长培养基（-FBS）冲洗培养皿 2 次，并将培养皿放回 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。
- 再用 10 ml 不含胎牛血清的生长培养基（-FBS）冲洗培养皿一次，共计洗涤 3 次。
- 转染后的 HEK293 细胞在无 FBS 条件下于 37 °C 继续孵育 48 小时，然后收集培养上清。
4. 磁珠聚集（第4天）
- 收集培养皿中的培养基时，将每对培养皿中的培养基转移至50 ml锥形管中，在500 × g条件下离心5分钟，以沉淀细胞碎片。
- 使用30 ml注射器和0.45 µm注射式滤器，将50 ml锥形管中的培养基过滤至离心过滤装置中。
- 在4,000 × g、4 °C条件下离心过滤装置，直至浓缩后的培养基体积约为500 µl（约15分钟）。重复此步骤，直至所有培养基均完成添加与浓缩。
- 每个样品取1.5 µl Protein G磁珠，加入含1 ml冰冻结合缓冲液的1.5 ml微量离心管中，置于磁力架上并吸除缓冲液。立即向Protein G磁珠中加入浓缩后的培养基。
- 在4 °C条件下旋转孵育2小时。
- 将离心管置于磁力架上，吸除上清液。用1 ml冰冻结合缓冲液快速洗涤磁珠两次，然后将磁珠重悬于300 µl结合缓冲液中。
- 将重悬的磁珠均分至两个离心管中，每管150 µl，随后分别加入1.5 µl 200 mM CaCl2（“含钙”条件）或200 mM EDTA（“无钙”条件）。
- 从每种条件下各取100 µl转移至凹孔载玻片中，使用透射光显微镜采集显微图像（图2）。在每个实验的每个目标时间点，采集五个视野的图像。
5. 数据分析
- 使用 ImageJ 或类似的图像分析软件，通过 文件 下拉菜单中的 导入/图像序列… 功能打开五个图像数据集中的一个。这些图像将作为图像堆栈打开。
- 在 图像/属性… 对话框中，将图像单位更改为像素，并将像素宽度和像素高度均设置为 1.0。
- 使用 图像 下拉菜单中的 调整/阈值… 命令将图像转换为二值图像。设置阈值以包含构成微珠或微珠聚集体的像素，同时排除背景和微小颗粒。将该阈值应用于堆栈中的所有图像。
- 在 设置测量 对话框中，选中 面积 和 堆栈位置 选项。
- 在 分析 下拉菜单中运行 分析粒子… 功能。这将生成一个已识别粒子的列表，包括每个粒子的大小（面积）及其被识别所在的图像。
- 对每个实验及实验条件重复此过程。
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结果
一个示例实验如下所示 图2，显示N-钙黏蛋白胞外域与Fc融合蛋白（NcadEC-Fc）介导的钙离子依赖性微珠聚集。在无钙离子条件下，微珠几乎不发生聚集，且随时间推移聚集体大小无明显增加（图1A、C）。在钙离子存在的情况下，包被有NcadEC-Fc的微珠表现出显著的聚集现象，且聚集体的尺寸随时间逐渐增大（图1B，C）。该实验重复进行了三次，每次实验包含五个非重叠视野的图像。对五个视野中每个聚集体的像素面积进行颗粒尺寸测定。对每次实验中每个时间点的数据进行平均。对三次实验的数据进行平均，以确定每个时间点的均值和测量标准误（图2C).
图 1. 在磁珠聚集实验中使用...
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讨论
细胞黏附是多细胞生命的基本特征，由多种细胞表面蛋白介导。然而，其中仅有相对较少部分的黏附特性被深入理解。本文介绍了一种简单、快速的实验方案，用于研究分泌型胞外结构域与常用表位标签融合蛋白的同嗜性黏附能力。该方法具有多项重要优势：首先，无需构建稳定表达的细胞系14,20，因为通过瞬时转染100 mm培养皿即可获得足量的蛋白质。这使得能够对更大量的构建体进行筛选—— 例如， 定点或缺失突变体——而无需耗费大量资源构建和维持众多细胞系。其次，这些珠粒检测法可在简化体系中直接检验假定黏附分子的生化特性，从而将黏附效应直接归因于所研究的蛋白质，而非潜在的间接作用。第三，为研究可能的辅助因子效应，可将细胞共转染表达分泌型的假定黏附分子及其假定辅助因子，二者分别带有不同的表位标签。此外，该方法具有灵活性，可适配多种合适的表位标签。例如，已有商品化均一尺寸的磁珠，其表面偶联有Protein A或G（Fc标签）、链霉亲和素（Strep II标签）、谷胱甘肽（GST标签）或TALON/Ni:NTA（6x His标签）。最后，荧光珠粒的可获得性使得同一实验方案可进一步拓展为简单的分选检测，用于研究同嗜性特异性。在此情况...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作得到了美国国家科学基金会/美国复苏与再投资法案资助（IOS 0920357）以及美国国立卫生研究院资助（5R21MH098463）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pFc-N1 质粒 | Addgene | <强>待提交 | |
| HEK293细胞 | 美国典型培养物保藏中心 | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma | F2442 | |
| 100倍青霉素-链霉素溶液（10,000 U/ml） | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668030 | |
| Dynabeads – Protein G | Life Technologies | 10003D | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A3294 | |
| 抑郁症幻灯片 | 电子显微镜科学公司 | 71878-06 | |
| Amicon Ultra-15 离心滤过装置（Ultracel-10 膜） | Millipore | UFC901024 | |
| 0.45 mm 注射器滤器 | Sarstedt | 83.1826 | |
| Dynamag-2 磁铁 | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji（ImageJ）图像分析软件 | http://fiji.sc/Fiji | ||
| 缓冲液/溶液表 | |||
| 培养基 | DMEM + 10% FBS + 青霉素-链霉素 | 过滤除菌，4 ℃保存 °C. | |
| 培养基 –FBS | DMEM + 青霉素-链霉素 | 过滤除菌，4 ℃ 保存 °C. | |
| 结合缓冲液 | 50 mM Tris，pH 7.4，100 mM NaCl，10 mM KCl，0.2% BSA | 涡旋至溶解，置于冰上保存。 |
参考文献
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