珠聚集测定假定的细胞粘附分子的表征

摘要

在这里，我们提出了一种简单、快速的方法，用于表征推定的细胞粘附分子的内在粘附特性。 细胞粘附分子的分泌的、带有表位标记的胞外域从培养基中捕获在小的、均匀的功能化珠子上。 然后，这些微珠可立即用于简单的微珠聚集分析。

摘要

细胞 - 细胞粘连是基本多细胞生命，并通过细胞表面的蛋白质得到大量不同的介导。然而，对于许多这些蛋白质的粘合剂的相互作用是知之甚少。在这里，我们提出一个简单，快速的方法表征假定同嗜细胞粘附分子的粘接性能。培养HEK293细胞被转染的DNA质粒，编码细胞表面蛋白的分泌，抗原表位标记的胞外结构域。使用特定的表位标签官能珠，可溶的，分泌的融合蛋白是从该培养基中捕获。经涂覆的珠粒然后可以在珠凝集测定法或荧光珠分选试验来测试同嗜性粘附直接使用。如果需要的话，诱变可以被用来阐明所需粘附特定氨基酸或结构域。该测定中，只需要少量的表达的蛋白质，不要求生产稳定的细胞系，并且可以ACCOmplished在4天。

引言

细胞 - 细胞粘连是多细胞生物体的发展和完整性必不可少的，是由细胞表面分子的大量不同的介导。许多这些粘附分子已经确定和特点，尽管很多有待发现。有几种方法用于研究细胞粘附分子的性质（粘附分子），包括细胞分选测定法，细胞聚集测定法^1-8和生物物理方法，如原子力显微镜和表面力谱^9-12。

偶数简化在使用的细胞系的体外系统的复杂性使得很难确定推定的CAM的粘合性能。通常情况下，分子被认为是CAM，如果它诱导细胞聚集时，转染到非粘着的细胞系。然而，很明显，这不是粘附活性的直接证据。例如，便于在细胞表面输送的或稳定CAM也会导致更多的细胞聚集^1,13。此外，一个真正的CAM可能无法介导细胞聚集，如果该细胞系缺乏所需的细胞表面运送或稳定等共同因素。

为了避免这些复杂的因素，即是基于这样的构思更直接测定法可以采用该粘合剂的相互作用应该是胞外结构域的一个固有的生化特性。而珠最初用于表征伍-CAM ^2中 ，已扩展这些测定已为了研究钙粘蛋白介导的粘附^12,14,15。使用融合在C-cadherin的胞外域Fc融合后，Gumbiner实验表明，多种钙粘蛋白重复导致同种相互作用^14。使用类似的珠子聚集试验，E-钙粘蛋白和N-cadherin的附着力也被定性^12,15，因为有许多protocadherins ^1,15-18和唐氏综合症黏附分子亚型的果蝇 ^19。在这里，我们描述了一种相对简单并迅速测定法用于表征分泌，表位标记的推定的同嗜性粘附分子（ 图1）胞外结构域的粘附活性。我们已经使用该测定主要表征的钙粘蛋白家族的成员。

方案

1，细胞的制备（日-2至0）

1. 分裂的HEK293细胞1:5使用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液孵育在生长培养基，在37℃，5％CO _2，直到60 - 80％汇合（2 - 3天）。对于每种条件，培养的细胞在2×100毫米培养皿中。

2，细胞转染（第1天）

1. 转染HEK293细胞与质粒编码的Fc-融合使用转染试剂，如脂质体。也可以使用这导致可比较的转染效率的替代方法。
2. 回到转染的细胞来孵化24小时。

3，细胞增殖（第2天）

1. 预热生长培养基不胎牛血清（-FBS）至37℃。
2. 涮菜2倍用10毫升生长培养基-FBS，并返回菜到37℃培养箱中培养1小时。
3. 涮菜的文化再一次用10毫升生长培养基-FBS，共3次洗涤。
4. INCU大怒的转染HEK293细胞，在37℃下再48小时无FBS收集媒体面前。

4，珠聚合（4日）

1. 收集从培养皿媒体，从各对菜肴传输媒体到50ml锥形管中并旋转，在500×g离心5分钟以沉淀细胞碎片。
2. 从50ml锥形管中的过滤介质为使用30ml的注射器和0.45微米注射器式滤器的离心过滤。
3. 旋转离心过滤器在4000 XG和4℃直至浓缩培养基的体积为约500微升（约15分钟）。重复，直到所有培养基添加了浓缩。
4. 加入1.5微升蛋白G磁珠到1ml冰冷的1.5ml微量离心管中的每个样品结合缓冲液，代替上的磁铁和除去缓冲。立即将浓缩的培养基加入到蛋白G磁珠。
5. 旋转管在4℃下搅拌2小时。
6. PL在磁铁的王牌管和删除媒体。迅速用冰冷的洗两次珠1ml结合缓冲液，然后重悬珠300μL结合缓冲液。
7. 分裂悬浮珠粒成2管，加入150μl到每一个试管中，然后加入1.5微升200mM的_氯化钙或200mM的EDTA为“钙”和“无钙”的条件下，分别。
8. 传递来自每个条件100μl到一个凹陷以及滑动并收集用透射光显微镜（ 图2）的显微照片。收集从图5场图像的每个实验中，在每个期望的时间点。

5，数据分析

1. 使用ImageJ，或类似的图像分析软件， 使用 Import /图像序列......从文件下拉菜单中的五个图像数据集开放的。这些将被打开的图像堆栈。
2. 在图像 / 属性...对话框中，更改I法师单位为像素，并设置像素宽度和像素高度为1.0。
3. 转换的图像通过调整/阈值...命令，在图像下拉菜单中的二进制文件。设置阈值，以包括有助于珠或珠粒料的像素，但排除背景和小颗粒。适用于堆叠中的所有图像。
4. 在设置测量对话框，检查区和堆栈中的位置框。
5. 运行分析颗粒...在分析下拉菜单。这将产生鉴定粒子，包括它们的尺寸（面积），并在其被识别的图像的列表。
6. 重复此过程的实验和实验条件。

结果

一个示例实验示于图2，其示出钙依赖性珠聚合用N-钙粘蛋白与Fc融合（NcadEC-Fc）的胞外域。在不存在的钙，珠表现出很小或没有聚集倾向并有随时间（ 图1A，C），没有增加的聚集体尺寸。在钙离子的存在下，珠粒涂有NcadEC-Fc的节目健壮聚集，以聚集体大小随时间增加（ 图1B中的C）。本实验重复3次，以每一个实例包括图像从五个非重叠领域。粒径在像素区域中的五个字段每个骨料进行测定。这些数据的平均值在每个时间点，在每个实验中。来自三个实验中的数据进行平均，以确定装置和测量的标准误差在每个时间点（ 图2C）。

1762 / 51762fig1highres.jpg“/>
图1：使用分泌，表位标记的珠子聚集测定胞外结构域。 （一）示意图显示了一个典型的单次跨膜细胞粘附分子（上方）的组织，其中有一个信号序列（S），胞外域，跨膜结构域（T）和胞内结构域（ICD）。来产生胞外结构域，一个段缺少融合到人Ig...

讨论

细胞粘附是多细胞生命的一个基本特征，是由细胞表面蛋白的一系列广泛的介导。在这些中，具体的粘合性能被理解为仅一个相对小的比例。在这里，我们描述了一个简单，快速的协议，用于研究融合到一个方便的表位标签分泌的胞外结构域的同种粘附能力。这种方法具有许多重要的优点。第一，稳定细胞株不要求^14,20，如可以通过100毫米培养皿中的瞬时转染来产生足够量的蛋白质。这使得构建大数量的筛选- 如点或缺失突变体-没有精力和费用产生和保持大量的细胞系。其次，这些磁珠检测是公认的粘附分子的生物化学特性的降低了系统的直接考验。因此，粘附可直接归因于蛋白质根据调查，而不是潜在的间接影响。第三，探讨可能的辅因子的作用，细胞可以被共转染的推定的粘附分子的分泌形式和其假定的辅因子，每一个不同的表位标签。此外，这种方法是灵活的，因为它可以适于与多种合适的表位标签的使用。例如，均匀尺寸的磁珠可被缀合到蛋白质A或G（Fc的标记），链亲和素（链球菌II标签），谷胱甘肽（GST​​标签），或者TALON或Ni：NTA（6倍His标签）。最后，荧光珠的可用性允许适于相同的协议进行简单的排序分析，调查同嗜特异性。在这种情况下，红色和绿色的荧光珠，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pFc-N1 质粒	Addgene	<强>待提交
HEK293 细胞	美国典型培养物保藏中心	CRL-1573
DMEM	Mediatech - 康宁	10-013-CV
胎牛血清 （FBS）	Sigma	F2442
100x Pen-Strep （10,000 U/ml）	Life Technologies	15140-122
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	25300054
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668030
Dynabeads –Protein G	Life Technologies	10003D
牛血清白蛋白	Sigma	A3294
抑郁载玻片	电子显微镜科学	71878-06
Amicon Ultra-15 离心过滤装置，带 Ultracel-10 膜	Millipore	UFC901024
0.45 mm 针式过滤器	Sarstedt	83.1826
Dynamag-2 Magnet	Life Technologies	12321D
斐济 （ImageJ） 图像分析软件	http://fiji.sc/Fiji
缓冲液/溶液生长
培养基	DMEM + 10% FBS + 笔式链球菌	过滤器灭菌并储存在 4 &°C。
成长媒体 –FBS	DMEM + 笔式链球菌	过滤器消毒并储存在 4 &°C 下。
结合缓冲液	50 mM Tris，pH 7.4,100 mM NaCl，10 mM KCl，0.2% BSA	涡旋直至溶解，保持冰上。