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使用差示扫描荧光法测定蛋白质-配体相互作用

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DOI：

10.3791/51809

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2014年9月13日

 ,  ,  , 
1Department of Biosciences, University of Exeter

本文内容

摘要

差示扫描荧光法是一种广泛用于筛选小分子文库与蛋白质相互作用的方法。本文介绍了一种简单的方法，可将此类分析扩展至估算小分子与其靶标蛋白之间的解离常数。

摘要

目前已有多种方法可用于测定蛋白质与相互作用小分子之间的解离常数。然而，大多数方法需要使用专业设备，且通常要求研究人员具备一定的专业知识，以有效建立可靠的实验并分析数据。差示扫描荧光法（DSF）正日益被用作对蛋白质进行小分子相互作用初筛的可靠方法，既可用于鉴定生理学伴侣分子，也可用于苗头化合物的发现。该技术的优势在于仅需一台适用于定量PCR的PCR仪，因此大多数科研机构均具备相应的仪器设备；目前已存在大量优秀的实验方案；文献中也有大量该方法多方面应用的先例。以往研究提出了多种从DSF数据计算解离常数的方法，但这些方法在数学上较为复杂。本文演示了一种利用适量DSF实验数据估算解离常数的方法。这些数据通常可在一天内完成收集与分析。我们展示了如何使用不同模型拟合来自简单结合事件的数据，以及在存在协同结合或独立结合位点情况下的数据拟合方法。最后，我们给出了一个标准模型不适用情况下的数据分析示例。本方法通过商用对照蛋白质以及我们研究项目中的两种蛋白质所获得的数据加以说明。总体而言，本方法为研究人员利用DSF技术快速深入理解蛋白质-配体相互作用提供了一条简便途径。

引言

所有蛋白质都会以不同的亲和力与多种多样的其他分子结合，这些分子从小分子离子到其他大型大分子不等。在许多情况下，蛋白质与其小分子配体的结合是其正常功能的一部分例如， 一种与ATP结合的激酶）。其他相互作用可能与功能无关，但在实验中可作为工具使用（例如， 稳定蛋白质以提高结晶成功率或帮助维持蛋白质在溶液中的小分子；而结合蛋白质活性位点和变构位点的小分子可作为抑制剂，从而调节酶的活性。

可用于测定蛋白质与其相互作用分子之间亲和力的技术种类繁多。等温滴定 calorimetry1 被广泛视为“金标准”，因为它能提供丰富的反应信息，无需标记，且实验中产生人为假象的可能性较低。然而，尽管近年来仪器的灵敏度和实验操作的自动化程度有所提升，该方法在蛋白质用量方面仍相对昂贵，通量最多仅为低至中等水平，且最适合用于中等到高亲和力的相互作用（解离常数 Kd 为 10 nM 至 100 µM）2。其他无需标记的方法，如表面等离子共振或双层干涉技术3，可实现更高的通量，并已达到可检测小至 100 Da 分子的灵敏度。然而，这些方法的高通量仪器相对昂贵，仅在持续有相关项目需求的情况下才具有使用合理性，因此许多学术实验室可能难以获得。

差示扫描荧光法（DSF，或称thermofluor）最早于2001年被提出4，作为一种药物发现的方法。该方法中，蛋白质与一种荧光染料（最初使用萘磺酸类染料）共同孵育，染料在结合到蛋白质的疏水区域时其荧光特性会发生改变。随后对蛋白质-染料样品进行加热，并监测随着温度升高荧光信号的变化。蛋白质的 unfolding（去折叠）过程会暴露出其疏水区域，从而导致荧光信号随温度变化呈现出特征性的曲线模式（图1A）。该实验可在任何商用定量PCR仪中以微小体积进行，因此单次实验可同时检测大量样品（通常为48、96或384个样品，具体取决于仪器型号）。实验通常耗时约一小时，可实现对样品的高通量分析5。

该方法的进一步改进包括采用了光谱特性更优的染料6,7、通用的数据分析工具以及建议的初筛实验方案8,9。该方法的应用范围也已拓展，尤其集中在建立蛋白质制备与保存的最佳条件10，以及鉴定有助于结晶的潜在结合分子11。由于该方法具有相对较高的通量、较低的蛋白消耗量（约每反应 2 µg），且适用于研究弱结合分子，因此差示扫描荧光法（DSF）已成为基于片段的药物设计中一种有价值的工具，尤其在学术研究环境中具有重要意义12-14。

尽管差示扫描荧光法（DSF）已广泛应用于蛋白质-配体相互作用的研究，但很少有研究描述如何从这类实验中确定解离常数。然而，已有方法倾向于建立复杂的方程来描述蛋白质的去折叠过程，这些方程包含多个参数，需拟合稀疏的数据，或在某些情况下进行估算7,15-17。这些方法在一些具有挑战性的情况下尤为适用，例如强结合化合物或表现出异常变性曲线的蛋白质。但对于许多实验室而言，这类详细分析在常规使用中过于繁琐。因此，我们提出了适用于不同实验场景的替代处理方法，并展示了如何利用这些方法拟合来自不同蛋白质-配体相互作用的实验数据。本方法采用StepOne qPCR仪，该仪器配有专用的数据分析软件；虽然这可加快数据分析速度，但其他仪器获得的结果也可通过已发表的方法9进行处理，并进行相同的后续分析。

方案

1. 解离常数近似值的测定（即， 在一个数量级之内

  1. 准备下述混合物 表1.
  2. 制备感兴趣配体的储备液，浓度为可达到的最高浓度，然后将其进行六次十倍系列稀释。若仅有近似 Kd 根据先前数据可知，应至少设置两个高于和低于该值的浓度 Kd.
  3. 将18 µl混合物分装至qPCR板的八个孔中。向第一孔加入2 µl溶剂。向其余七个孔中分别加入2 µl配体梯度稀释液（步骤1.2）中的每一种。
  4. 将 qPCR 密封膜覆盖在板上。为确保板密封良好，将手动压膜器（见特定试剂表）置于板中央，向一侧平滑压紧密封膜，然后在板的另一半重复此操作。
  5. 以 500 × g 离心 2 分钟以去除气泡。
  6. 将培养板放入 StepOne qPCR 仪器中。选择“熔解曲线”选项、ROX 滤光片，并选择快速升降温速率（该设置包含在 25 °C 下暂停 2 分钟，随后在 40 分钟内升至 99 °C，最后再暂停 2 分钟）。运行热变性程序。
    注意：用于执行运行的脚本文件可在线获取，网址为 http:// www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular
  7. 仪器运行结束后，点击屏幕上的“Analyze”按钮，保存结果文件。
  8. 打开蛋白质热迁移软件。
    1. 创建一项新研究；在属性选项卡中为其命名，并在条件选项卡中详细列出配体。
    2. 切换到实验文件选项卡，导入保存的结果文件（XXX.eds），并设置每个孔的内容（模板文件可向作者索取）。
    3. 切换到分析选项卡，然后点击“分析”按钮。
      注意：这将分析结果。可使用“导出”选项卡将结果导出，以便在 Excel 中进一步分析。结果将以制表符分隔的格式导出。建议在 Excel 中打开导出的文件后，立即另存为 Excel 格式。
  9. 检查仅在溶剂存在下蛋白质的结果是否与图中所示结果相似 图1A接下来，检查“重复”面板中结果所显示的熔解温度。应确保熔解温度随配体浓度增加而呈现明显上升趋势。
    注意：理想情况下，这将提供一个清晰的最高熔解温度（假设蛋白质完全与配体结合），以及一个近似值 Kd 其中熔解温度位于无配体蛋白与最高熔解温度之间的中点。

2. 测定解离常数的实验设置

  1. 按照 表2 中详述的配方配制主混合液。
  2. 配制配体的15种不同浓度储备液，这些储备液在最终实验中将被十倍稀释。理想情况下，浓度范围应至少涵盖估计 Kd 值上下各两个数量级，并以估计的 Kd 为中心。重点在估计 Kd 值的一个数量级范围内设置7个浓度点，在此范围两侧各再设置4个点；如有选择余地，应优先增加饱和浓度区域的测量点数。
    注意：如有必要，可调整实验条件，使配体储备液浓度为实验浓度的两倍，以应对配体溶解度受限的情况。
  3. 将120 µl主混合液加入96孔U型底板的八个孔中，作为主混合液的储备液以便于分装。使用8通道移液器将18 µl主混合液加入PCR板的一列中。重复此操作，共填充六列，使板上形成6×8共48个已填充孔的阵列。
  4. 将20 µl不同浓度的配体储备液或溶剂分别加入U型底96孔板的不同孔中。使用8通道移液器吸取8种不同配体储备液（或溶剂）各2 µl，加入步骤2.3中已填充主混合液的PCR板的一列中。对另外两列重复相同操作。再吸取剩余8种配体或溶剂储备液各2 µl，加入板中的第四列。对另外两列重复此操作。这样可为全部16种配体和溶剂样本各获得三个重复样本。
  5. 在板上覆盖qPCR密封膜（见步骤1.4）。
  6. 以500 × g离心2分钟。
  7. 将板放入qPCR仪器中。按照步骤1.6中指定的参数运行热变性程序。
  8. 仪器运行结束后，点击屏幕上的“分析”按钮，保存结果文件。
  9. 打开Protein Thermal Shift软件。创建新研究；在“属性”选项卡中为其命名，在“条件”选项卡中详细填写配体信息。
  10. 切换到“实验文件”选项卡，导入已保存的结果文件（XXX.eds），并设置每个孔的内容。
    注意：模板文件可在线获取，网址为 http:// www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.
  11. 切换到“分析”选项卡，点击“分析”按钮。
    1. 从屏幕左侧菜单中选择“重复样本”选项卡，以三重复形式显示结果。根据三重复数据的接近程度评估数据可靠性。若三重复结果重复性差，应仔细检查原始数据。
    2. 使用Boltzmann法和导数法分析数据，以确定熔解温度。选择“重复结果”选项卡，在“重复结果图”中切换“绘图依据：”按钮，分别查看“Tm – Boltzmann”和“Tm – Derivative”结果。选择对样本重复性更优的方法。通过“导出”选项卡将结果导出至Excel进行进一步分析。
      注意：对于呈现多个变性峰的样本，通常最佳选择是在多峰熔解模式下使用导数法。导出结果为制表符分隔格式。建议在Excel中打开导出文件后立即另存为Excel格式。
    3. 至少重复实验两次，且其中一次应在不同日期进行，以确保结果的可重复性。若数据分析（见下文步骤3）表明测得的 Kd 值与初始估计值有显著差异，应相应调整配体浓度（见步骤2.2），以确保在 Kd 周围有充分的浓度覆盖范围。

3. 通过热变性实验确定解离常数的数据分析

  1. 在 Excel 中创建一个配体浓度与熔解温度的表格。
  2. 打开 GraphPad Prism 软件，创建一个 XY 表格。将数据输入 X 列作为配体浓度，Y 列作为熔解温度结果。
    注：示例见图 1B。包含预载方程的脚本以及使用 SPSS 统计软件包的替代说明可在线获取，网址为 http:// www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular。
  3. 在“分析”选项卡中，选择更改分析参数（Ctrl+T）。为输入正确的模型，选择“新建”和“创建新方程”。将表 3中详述的方程作为“单一位点配体结合”插入。
    注：这些步骤的示例见图 1C。当使用预载方程的脚本时，可直接从列表中选择相应方程，而无需手动输入。该方程的推导过程见附录。
  4. 选中“初始值设定规则”框，并按照表 3中详述的内容输入初始值的规则。
  5. 将参数 P 设为“常数”，并输入蛋白质的终浓度（单位需与配体浓度单位一致）。
  6. 点击“确定”以执行分析。
    注：这些步骤的示例见图 1D。绘图软件将生成显示数据及模型拟合结果的图表。代表性数据中展示了此类分析的示例。

4. 将数据拟合到协同模型

为了将数据拟合到协同模型，可选择简单的协同模型，或定义两个独立解离常数的模型。在负协同效应的情况下，或作为初步分析时，优先采用第一种方法。然而，原则上在正协同效应的情况下，最好采用两个不同的解离常数进行建模18。此时，建模可基于配体的逐次结合，或配体的独立结合两种假设进行。

  1. 遵循与方案3相同的初始步骤。但在步骤3.3中，插入表3中列出的“简单协同模型”、“两个配体的顺序结合”或“两个配体的独立结合”方程之一18。
  2. 根据所选方程，在表3中选择相应的初始值设定规则。
  3. 检查模型对数据的拟合情况。若拟合效果不佳，应考虑更换其他模型。
    注意：还需仔细评估蛋白质热迁移软件（步骤2.9）对熔解温度与数据的拟合情况：有时需要在此处调整参数以获得最佳结果。另一个需考虑的因素是数据点的范围是否理想，以及是否存在异常点：在Kd两侧数据点过少，或出现单个异常点（尤其是在最高配体浓度下），均可能显著影响结果。
  4. 至少重复实验两次（参见步骤2.12），以确保结果的可重复性。

5. 将数据拟合到显示熔解温度二元变化的曲线

有时，蛋白质对配体的响应并非梯度式，而是呈现二元响应，即结合样本与未结合样本之间有明显区分。代表性结果中提供了示例（图4）。在此情况下，对熔解温度进行拟合将无法获得良好的 Kd 拟合结果。

  1. 导出蛋白质热移位软件的原始数据输出结果。针对每个温度点，计算无配体以及最高配体浓度下的平均荧光值。将各数据点的结果与这些数值并列整理成表格。
    注意：此处产生的误差小于拟合熔解温度时的误差。
  2. 打开 SPSS 统计软件包。将温度数据、两组平均数据集以及每次实验的数据复制到 SPSS 的数据窗口中。在变量标签页中，将无配体的平均数据集设为“low”，将最高配体浓度的平均数据集设为“high”。
  3. 从 http:// www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular 在线下载语法文件。选择“Run → Run all”运行全部命令。
  4. 将结合比例结果连同相应的配体浓度复制到一个新的 Excel 工作簿中。
  5. 打开 Graphpad 软件，创建一个 XY 表格。输入数据，X 列用于配体浓度，Y 列用于熔解温度结果。在分析标签页中，选择“change analysis parameters”。为输入正确的模型，选择“New”和“Create new equation”，然后输入表 3 中列出的方程“Analysis of binary shifts in melting temperature”（熔解温度中二元变化的分析）。
  6. 选中“Rules for Initial Values”（初始值设定规则）框，并输入 表 3 中详细说明的初始值规则。将参数 P 设为“Constant equal to”（恒定等于），并输入蛋白质的终浓度（单位需与配体浓度单位一致）。
    注意：图 1C、D 展示了第 3 节实验方案中填写这些参数框的示例。
  7. 若拟合效果良好，可通过外推至无限配体浓度时的预期结果来进一步优化分析结果。根据每个配体浓度下结合比例的模型，检查最高配体浓度对应的数值。若该值为 0.99 或更高，则进一步分析不太可能显著改善结果。
  8. 若结合比例低于 0.99，则需要额外步骤以校正最高配体浓度样品中未结合蛋白的影响。在第 5.2 步中，将第 5.7 步所得最高配体浓度点的配体结合比例填入单元格 R2（也可使用其他单元格，相应地在 表 3 的方程中替换 R2）。在最高配体浓度结果的平均值列后新增一列。在第一行单元格中，输入 表 3 中列出的“Extrapolation to infinite ligand concentration”（外推至无限配体浓度）的公式，并将该公式复制到该列其余单元格中。
    注意：该计算消除了最高配体浓度中未结合蛋白的影响。通过将无配体蛋白与最高配体浓度之间的差值乘以最高配体浓度下结合比例的倒数，得到在每个温度点上完全结合状态与未结合状态之间的预期差值。该差值被加或减至未结合状态，以获得完全配体结合蛋白的预期荧光值。
  9. 用新生成的列替换 SPSS 数据表中最高配体浓度的原始列，并重复数据拟合过程。
    注意：若模型提示在最高配体浓度下的结合比例仍有显著变化，则可能需要重复第 5.7 至 5.9 步（若如此，建议重复实验并增加更高的配体浓度点）。
  10. 当蛋白表现出二元变化并呈现协同行为时，应将第 5.5 步建议的方程替换为第 4.1 步中的方程。“Top”和“Bottom”参数应分别替换为 1 和 0。
  11. 至少重复实验两次（参见第 2.12 步），以确保结果的可重复性。

结果

该方法的理想测试底物是己糖激酶。其优点在于可轻松获得商业化产品，且具有两种大多数实验室都具备的底物，可在检测中提供清晰、可重复的结果。初步浓度筛选（方案1），使用己糖激酶和葡萄糖（图2A），表明可能的Kd值范围在0.2至1.7 mM之间。因此，进行了更大范围的筛选（方案2），所用浓度如表4所示。结果（图2B）与单一位点配体结合方程（方案第3.3节）[9]具有良好的拟合度，得到的Kd值为1.2 ± 0.1 mM。

推测的庚糖-鸟苷转移酶 WcbM 19,20 在结合 GTP 时表现出显著的热漂移（图 3A）。初步筛选表明，其 Kd 值大约在 100 µM 范围内。因此，我们设置了完整的实验，使用 表 5 中所示的浓度进行测定。将结果拟合至方程 3.3 后，拟合效果较好（R2 为 0.981；图 3B）。然而，数据与模型之间存在明显差异，提示需要采用不同的方程进行分析。利用 WcbM 序列在蛋白质数据库 21 中进行搜索发现，已解析结构的最接近同源蛋白均以二聚体形式存在。因此，采用三种描述两个配体协同、顺序及独立结合的方程对数据进行分析（方案 4）。协同结合模型的拟合统计结果显示 R2 为 0.998，残差标准偏差（Sy.x）为 0.215；而顺序结合和独立结合模型的 R2 值分别为 0.992，Sy.x 分别为 0.480 和 0.461。这表明协同模型对数据的拟合最优：在此模型中，观察到 K½ 为 230 ± 10 µM，n 值为 0.52 ± 0.02（图 3C），提示结合过程具有负协同性。需要注意的是，此处使用 K½ 而非 Kd，因为若使用 Kd，其单位将为不便于表达的 µM0.52。

推测的GDP-6-脱氧-β-d-manno-庚吡喃糖2-O-乙酰转移酶WcbI22在差示扫描荧光法中表现出相当不寻常的结果。在无任何配体存在时，其变性曲线清晰且单一（图4A）。通过差示扫描荧光法（DSF）鉴定出辅酶A（CoA）为此蛋白的配体，并按照本方案所述方法研究了该蛋白对此配体的亲和力。在高浓度CoA存在下，观察到明显的向高温方向的转变，熔解温度升高了15 °C。然而，在中等浓度时，WcbI并未表现出在中间熔解温度处的单相熔解，而是呈现双相熔解行为，即蛋白似乎在无配体时的熔解温度或完全结合状态下的熔解温度发生熔解（图4A）。两种构象的比例随浓度呈剂量依赖性变化，随着底物浓度增加，在较高温度下熔解的蛋白比例也随之增加（图4B）。对这些数据的直接分析具有挑战性：采用Boltzmann方程拟合效果极差，而导数法虽能揭示存在两个熔解事件，却无法有效展示随配体浓度增加而发生的变化。

因此采用了一种较为非常规的方法来分析这些数据（方案5）。将无配体以及在最高配体浓度下的荧光导数结果，分别视为蛋白质几乎全部处于较低熔解温度状态或较高熔解温度状态。其余各数据点的导数曲线被拟合为上述两种状态按一定比例的加权和，且两状态比例之和为1（图4C）。随后，采用与之前相同的方程对所得数据进行拟合，以获得表观 Kd。该分析表明，“高”配体浓度点的配体结合程度可能仅为95%。接着，将数据外推至预测100%结合状态下的结果，并重新进行数据拟合，得到表观 Kd 为 58 ± 2 µM。该拟合结果与结合模型对实验数据具有极好的吻合度（图4D）。

热变性分析；荧光值随温度变化的曲线图，葡萄糖对蛋白质稳定性的影响。
图1. 实验设置与数据分析示例。（A）热变性曲线的预期形状示例（数据来源于酵母己糖激酶）。原始数据具有典型特征：荧光信号随温度升高逐渐上升至峰值，随后出现轻微下降（详见文献9中的详细讨论）。该曲线的一阶导数呈现单一峰值。 （B） 在Graphpad中输入数据的示例。X轴表示配体浓度，Y轴表示观测到的熔解温度。 （C） 在Graphpad中定义方程的示例。 （D） 正确设置变量初始值以及固定蛋白质浓度的示例，以确保准确计算解离常数。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示酶热稳定性的 Tm 与葡萄糖关系图；己糖激酶分析的数据与模型拟合。
图 2. 通过差示扫描荧光法测定己糖激酶与葡萄糖的相互作用。(A) 初步实验测试了较宽范围的葡萄糖浓度，结果表明其Kd值可能在 0.2 - 1.7 mM 范围内。(B) 详细实验测试了 16 种葡萄糖浓度，可确定表观Kd值为 1.12 ± 0.05 mM。数据与单个结合事件模型高度吻合（底部（T1）和顶部（T2）温度分别拟合为 35.4 ± 0.2 ºC 和 49.3 ± 0.5 ºC）。请注意，这些数据是在含有 10 mM MgCl2 的条件下采集的。这些图像使用 GraphPad 软件制作。请点击此处查看该图的放大版本。

热稳定性分析，Tm 与 GTP 浓度的关系，比较 WcbM 数据与模型预测的线图。
图 3. WcbM 与 GTP 的相互作用显示出反协同结合。（A） 初步实验测试了较宽范围的 GTP 浓度，表明其Kd 可能在 200 - 500 µM 范围内。（B） 一项更详细的实验测试了 16 种 GTP 浓度，提示表观 Kd 值为 120 ± 20 µM。然而，当横坐标采用对数尺度时，模型与数据之间存在显著差异。（C） 使用协同结合模型对相同数据进行分析，在采用简单协同模型时，数据拟合效果极佳。在此模型中，测得 K½ 为 230 ± 20 µM，协同性系数 n = 0.52 ± 0.02（基线温度 T1 和上限温度 T2 分别拟合为 69.63 ± 0.06 ºC 和 79.9 ± 0.1 ºC）。由于 WcbM 表现为二聚体，这表明该酶在结合 GTP 时表现出完全的反协同性。这些图像使用 GraphPad 软件绘制。请点击此处查看该图的高清版本。

CoA结合分析的差示扫描荧光法温度变化图。
图4. WcbI在辅酶A（CoA）存在下呈现双相熔解模式。（A）） 在无配体（蓝色）时，WcbI表现出简单的单相熔解模式。在高配体浓度（1 mM；绿色线）下，观察到类似模式。然而，在中等配体浓度（60 µM；红色线）下，观察到两个明显的熔解峰，分别对应于无配体和配体结合状态。（B） 两组峰之间的转变在整个浓度范围内呈剂量依赖性。（C） 将双相熔解曲线建模为无配体与高配体状态结果的加权和，可很好地拟合实验数据（虚线紫色线，与红色线对比）。通过将高配体浓度下的结果（模型提示约95%占据率）外推至完全占据状态，拟合效果进一步改善（虚线蓝色线）。（D） 获得的WcbI与CoA结合比例数据与简单的结合模型高度吻合，其Kd值为58 ± 2 µM（这些数据来自两天独立实验，第二天的配体浓度根据第一天的结果略作调整）。图（A - C）使用Excel绘制，图（D）使用Graphpad绘制。请点击此处查看该图的放大版本。

表1. 初始实验配方。

试剂混合物体积 (µl)
蛋白质至终浓度为 0.11 mg/ml
5000X SYPRO Orange0.3
0.5 M HEPES pH 7.03.7
5 M NaCl5.6
水加至 180 µl

这描述了用于初步筛选实验的“主混合液”，包含蛋白质、检测试剂和缓冲液，以估算 Kd，如方案第1部分所述。该缓冲液体系适用于一般性蛋白质。若已有实验结果提示应使用其他缓冲液，则应进行替换。如果蛋白质储备液浓度较低（即低于 0.3 mg/mL），可能需要减少额外添加的缓冲液体积，以补偿蛋白质样品中已存在的缓冲液成分。

表2. 确定Kd的配方。

试剂混合物体积 (µl)
蛋白质至终浓度为 0.11 mg/ml
5,000X SYPRO Orange1.78
0.5 M HEPES pH 7.022.2
5 M NaCl33.3
水加至 180 µl

这描述了用于完整测定蛋白质样品Kd的“主混合液”，包括蛋白质、检测试剂和缓冲液，如方案第2部分所述。该缓冲液体系适用于一般性蛋白质。若先前实验结果提示应使用其他缓冲液，则应进行相应替换。如果蛋白质储备液浓度较低（即低于0.3 mg/ml），可能需要减少额外添加的缓冲液体积，以补偿蛋白质样品中已存在的缓冲液成分。

表3. 数据分析所用方程与参数。

实验方案中的步骤所需方程所需参数变量与参数说明
3.3
单一位点配体结合Y=Bottom + ((Top-Bottom)*(1-((P-Kd-X+sqrt(((P+X+Kd)^2)-(4*P*X)))/(2*P))))P：蛋白质浓度。Kd：解离常数。P 和 Kd 的单位与配体浓度所用单位相同。Top、Bottom：分别为配体浓度无限大和无配体时的熔解温度。
3.4Bottom = *YMINYMIN：Y 的最小值（本例中为最低实验蛋白质 Tm）
Top = *YMAX YMAX：Y 的最大值（最高实验蛋白质 Tm）
Kd = *X at YMIDYMID：对应于 YMIN 与 YMAX 平均值的 Y 值。X 是相应的 X 值（此处为相关配体浓度）
P = (初始值，待拟合)
4.1
简单协同模型Y=Bottom+((Top-Bottom)*(((X/Kd)^n)/(1+((X/Kd)^n))))n：Hill 系数。该系数描述蛋白质的协同性或其他生化特性，不一定代表蛋白质中配体结合位点的数量估计。Hill 系数为 1 表示无协同性；小于 1 的值表示负协同性，大于 1 的值表示正协同性。
Bottom = *YMIN
Top = *YMAX
Kd = *X at YMID
P = (初始值，待拟合)
n = (初始值，待拟合)
两种配体的顺序结合Y=Bottom+((Top-Bottom)*((X^2)/(Kd*K2))/(1+(X/Kd)+((X^2)/(Kd*K2))))K2：第二次结合事件的解离常数。
Bottom = *YMIN
Top = *YMAX
Kd = *X at YMID
K2  = *X at YMID
P = (初始值，待拟合)
两种配体的独立结合Y=Bottom+((Top-Bottom)*((X^2)/(Kd*K2))/(1+(2*X/Kd)+((X^2)/(Kd*K2))))
Bottom = *YMIN
Top = *YMAX
Kd = *X at YMID
K2  = *X at YMID
P = (初始值，待拟合)
5.5
熔解温度二元偏移分析Y=1-((P-Kd-X+sqrt(((P+X+Kd)^2)-(4*P*X)))/(2*P))
Bottom = *YMIN
Top = *YMAX
Kd = *X at YMID
P = (初始值，待拟合)
5.8
外推至无限配体浓度(C2-((1-$R$2)*B2))/$R$2B2：不含配体时结果所在的单元格。C2：含最大配体浓度时结果所在的单元格。$R$2：最大配体浓度下结合比例所在的单元格。

步骤 3、4 和 5 需要在分析软件中添加详细的方程式，并精确定义数据分析的起始参数。文中展示了每个相关步骤对应的方程式，并列出了参数的正确选择。同时提供了变量与参数含义的说明，以供参考。

表4. 己糖激酶与葡萄糖相互作用筛选的浓度设置。

样品点配体（葡萄糖）浓度（mM）
10
20.001
30.005
40.01
50.03
60.1
70.3
80.4
90.7
101.1
112.1
123.7
135.3
147
159
1611

根据方案所述，将来自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的己糖激酶加入主反应混合液中，并补充10 mM MgCl2，因为镁是一种已知的辅因子。初步估计的Kd值在0.5至2 mM之间。实验设置为提供指定的葡萄糖终浓度。

表5. WcbM与GDP相互作用筛选的浓度。

样本点配体（GTP）浓度（μM）
10
20.5
31
45
510
625
750
8100
9250
10500
111,000
122,500
135,000
147,500
1510,000
1620,000

Burkholderia pseudomallei 的 WcbM 按照方案所述加入主反应混合液中。Kd 的初始估计值约为 100 µM。实验设置了一系列 GTP 的终浓度，旨在覆盖 Kd 值上下至少两个数量级的范围。

讨论

差示扫描荧光法已展现出其作为一种强大且多功能的方法，在蛋白质表征及潜在蛋白质配体鉴定中的优势。该方法在加速蛋白质稳定化、药物发现（尤其在资金有限的实验室中）以及结晶过程方面已有大量成功案例10,23-25，使其成为化合物初筛的优选方法。向蛋白质中添加化合物后，其表观熔解温度呈现出明显的剂量依赖性升高7,9。然而，目前极少有研究尝试利用此类实验结果来确定表观结合常数，以辅助对化合物亲和力进行排序。本文中，我们提出一种系统测定蛋白质在配体存在下的表观解离常数的方法。

本文展示的结果表明，差示扫描荧光法（DSF）能够快速且可靠地提供蛋白质-配体组合的解离常数估计值。通过市售工具对观测数据进行处理，可快速确定Kd，且无需对参数的可能取值做出假设。该方法相较于某些类似方法具有显著优势，即在蛋白质用量和实验时间上均更为节省。本文所述实验每次消耗约0.13 mg蛋白质（若实验重复三次，则总共消耗约0.4 mg）。与等温滴定 calorimetry（ITC）相比，该用量更具优势，因为单次ITC实验对于分子量约为40 kDa的蛋白质即需消耗相近数量的蛋白质。完成本方案所需的全套实验（包括样品制备）大约需要4小时。同样，该时间明显短于ITC或表面等离子体共振（SPR）等方法，尽管这些方法功能强大，但通常需要大量优化才能获得最佳数据。

我们的结果表明，仍有必要仔细检查原始数据、这些数据拟合以确定熔解温度的过程，以及熔解温度数据的拟合以确定解离常数的过程。第一个挑战来自蛋白质熔解过程中产生的原始数据的形状。在某些情况下，其形状可能与观察到的典型形态相差较大 图1A常见问题包括配体结合时温度偏移较小、背景荧光较高以及温度变化过程中出现异常的多重转变。在结合多种配体时均可能观察到较小的温度偏移。对于本方法而言，最关键的参数是 T 的误差m 测量结果相比，数据通常可以得到较好的拟合，前提是三次重复测量的标准偏差不超过未结合与完全结合状态下蛋白质熔解温度变化值的10%。根据我们的经验，当此类温度变化较小时 2 °C，如果各个数据点非常准确，则这可能足以用于数据拟合。第二个问题是形状异常的曲线。这些曲线在游离蛋白与配体结合形式之间通常存在差异，因为配体结合会影响蛋白的去折叠模式。在此类情况下，用户必须考虑是否可以在适当评估用于确定熔解温度和解离常数的模型后，合理使用这些数据。另一个常见问题是向蛋白中添加辅因子（例如， MgCl2 在我们的己糖激酶示例中，为获得最可靠的数据，必须在初始读数阶段仔细考虑实验中所有可能的影响因素。根据我们的经验，这是获得最佳结果的关键。此外，不同的理论处理方法可以揭示这些数据的某些特征 15,17最后，一些天然暴露疏水区域的蛋白质出现高背景荧光的情况并不少见。针对这些问题已有多种解决方案，相关研究已在其他文献中得到系统综述。6,9.

特别是，用户必须考虑使用Boltzmann模型还是导数模型（例如， 图4），以及在使用导数时，是否需要对多个熔解峰进行建模。这两种热变性建模方法的区别在于：Boltzmann 方法将实验数据拟合到 Boltzmann 方程，假设变性曲线呈规则的S型；而导数法则对每个数据点处的实验数据求一阶导数（见下图下层面板） 图1A），并将熔解温度定义为一阶导数的最大值点。该导数法通常所得的熔解温度较高，大约高出 2 - 3 °C大多数蛋白质将产生更一致的结果（即， 对于两种方法之一，三次重复实验的熔解温度标准误差更低。这通常与蛋白质解折叠曲线的精确形状密切相关，因此有必要通过实验在每种情况下确定最佳方法。当使用导数模型时，还需考虑多个熔解事件。某些数据明显显示出多个相变的证据，在这些情况下，若能对多个熔解事件进行建模，结果可能更易于解释。在本实验方案的背景下，常会观察到配体的加入可使蛋白质从具有多个熔解相变转变为仅出现单一相变例如， 通过稳定最热不稳定的亚结构域），或 反之亦然因此，我们建议在确定最佳使用方法之前，先对原始数据进行综合检查。

在对各个熔解温度进行建模后，可能还会出现将这些数据拟合到本实验方案部分所展示模型时的相关问题。必须使用对数尺度仔细检查解离常数方程的拟合情况，因为该分析通常能揭示观测数据与模型之间的差异（例如， 图3尽管所获得的结果通常较为可靠，但在解读时仍需谨慎，以便从数据中提取出更优的结果和更充分的信息。

这些数据引发的一个特殊问题是，应如何解释在DSF中表现出协同性或多步结合事件的蛋白质。迄今为止，我们仅在预期具有多个特异性结合事件的蛋白质中观察到这一现象例如， WcbM，一种其最佳同源蛋白为多聚体的蛋白质 26，且在尺寸排阻色谱中表现为多聚体（数据未显示）。目前尚不明确DSF变性实验中观察到的负协同效应是否意味着该酶最终会表现出负协同性；相反，这可能提示存在复杂的结合行为，需采用更广泛的方法进行深入探究。然而，这确实提示我们，对这类蛋白质开展更系统的研究，有可能发现有趣的效应。

采用此方法测得的解离常数通常与其他方法（如等温滴定 calorimetry 和表面等离子共振）提供的数值处于同一数量级。然而，该方法测得的绝对值通常高于这些方法所得结果。这至少部分归因于解离常数是在蛋白质-配体复合物的熔解温度下测定的。该温度下的 Kd 通常高于生理温度下的值。解离常数与反应温度之间的关系由以下方程描述：

平衡常数方程，\(K_d = cθe^{Δ_rG/RT}\)，热力学公式。[1]

热力学方程 ΔG=ΔH-TΔS，吉布斯自由能公式 [2]

（其中 cθ 是标准参考浓度，ΔrG 是反应的吉布斯自由能变化， R 是摩尔气体常数，ΔH 是反应的焓变，且ΔS 是反应中的熵变。

通常，该方法可测量范围内具有解离常数的反应其ΔrG为负值，因此温度升高对方程[1]的影响是使解离常数增大。构成吉布斯自由能的ΔH和ΔS项（方程[2]）均具有温度依赖性27，对解离常数的影响取决于这些温度依赖性的大小和符号，并且必然依赖于具体的相互作用。因此，该方法测得的解离常数有时高于在室温下运行的其他方法所得结果，这并不意外。当然，温度依赖性也是许多其他方法的局限性，这些方法通常提供的是低于生理温度下的解离常数。

DSF 方法的另一个局限性在于它是一种标记方法，而等温滴定量热法（ITC）则无需标记。所使用的荧光标记物（SYPRO Orange）具有疏水性，因此在某些情况下可能与疏水性配体竞争结合蛋白质。因此，由于与标记物的竞争作用，测得的解离常数可能会被人为地升高。然而，在比较不同配体时（这也是 DSF 的主要用途），这种差异通常不足以显著影响化合物亲和力排序的结果。

该方法的一个潜在缺点是其可达到的检测限。原则上，不应能够准确测量出某一数值 Kd 低于蛋白质浓度50%的数值，甚至该范围内的数值，其准确性也可能存疑。尽管通过降低蛋白质和染料的浓度可在一定程度上略微延伸该范围低端的检测限，但仪器的灵敏度将限制蛋白质浓度的进一步降低。同样，灵敏度的上限将由配体的溶解度决定。为获得数学上稳健的估算值 Kd，最重要的是获得蛋白质有90%以上处于配体结合状态的数据，这要求配体浓度约为其解离常数的十倍 Kd （假设无协同性）。因此，检测限必然是配体在相应缓冲液中溶解度的十分之一。这意味着该方法的检测限通常介于 1 µM 且在1至100 mM之间，具体取决于蛋白质和配体。

综上所述，差示扫描荧光法是一种适用于多种蛋白质的多功能技术。利用本文所述方法，可快速且低成本地测定蛋白质对不同配体的亲和力。该技术在蛋白质纯化与稳定化、揭示宏基因组来源酶的功能或特异性以及药物发现领域具有广阔的应用前景，尤其适用于小型实验室。

披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本工作由英国生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）向埃克塞特大学提供的资助（资助编号 BB/H019685/1 和 BB/E527663/1）支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
StepOne 实时荧光定量 PCR 仪Life Technologies4376357DSF 实验可使用多种其他仪器完成。StepOne 仪器配备非常便捷的数据分析软件。
蛋白质热迁移软件 v1.0Life Technologies4466037
MicroAmp 快速光学 48 孔板 Life Technologies4375816
光学封板膜 Life Technologies4375323Bio-rad 货号 223-9444 为可替代供应商
U 型底 96 孔板Fisher11521943
SYPRO OrangeLife TechnologiesS6650若需更小包装供应商，可使用 Sigma 货号 S5692
SPSS 统计软件版本 20IBM其他统计软件包可提供类似功能
GraphPad Prism 6.02GraphPad其他统计软件包可提供类似功能
手动压膜器（PA1）3M75-3454-4264-6
酿酒酵母来源己糖激酶Sigma-AldrichH5000
葡萄糖Fisher scientific10141520

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