通过鼻部活检联合激光显微切割获取的嗅觉神经元：研究精神疾病治疗反应的一种潜在方法

摘要

本研究开发并验证了一种用于研究双相情感障碍（BD）治疗反应神经元内分子特征的新平台。通过鼻腔活检获取双相情感障碍（BD）患者的嗅觉上皮组织，随后结合激光捕获显微切割与实时逆转录聚合酶链反应（Real Time RT PCR），分析锂盐治疗在双相情感障碍中的分子特征。

摘要

双相情感障碍（BD）是一种严重的神经精神疾病，其病理生理机制尚未完全阐明，通常使用情绪稳定剂碳酸锂进行治疗。动物研究以及人类遗传学研究均表明，锂可影响参与神经元生长、存活和成熟过程的分子靶点，尤其是Wnt信号通路中的相关分子。由于在中枢神经系统（CNS）中获取脑组织活检以研究锂治疗反应相关的动态分子变化存在伦理挑战，因此可考虑利用嗅觉组织来源的神经元来实现这一目标。嗅觉上皮包含处于不同发育阶段的嗅觉感受神经元以及类似胶质的支持细胞，这为通过鼻腔活检安全获取的嗅觉组织来研究神经精神疾病患者中枢神经系统中的动态变化提供了独特机会。为了克服活检所得嗅觉组织中非神经元细胞污染严重的问题，本研究结合鼻腔活检与激光捕获显微切割技术，建立了一种获得富集神经元细胞群体的新方法。本研究建立并验证了一个用于研究治疗相关神经组织中动态分子变化的系统，所用样本为一项关于锂治疗反应分子机制研究中招募的小规模双相情感障碍患者队列。

引言

双相情感障碍（BD）是一种严重的神经精神疾病，其特征是情绪、动机和认知的病理性改变¹。动物研究表明，用于治疗BD的锂盐可改变大量基因的稳态mRNA水平²，但目前尚不清楚这些分子中是否有任何一种与人类的临床治疗反应相关²。要理解锂盐治疗反应的机制，需要研究锂盐在神经组织中诱导的分子变化。然而，在接受锂盐治疗前后获取BD患者脑组织活检样本以识别锂盐反应的分子特征并不可行。尽管已有研究使用死后脑组织来探索BD的生物标志物，但这些样本无法用于评估与情绪、认知和动机动态变化相关的分子标志物；此外，回顾性确定的锂盐治疗反应的准确性可能存在疑问⁴。淋巴细胞和其他血细胞可能具有一定用途，但血细胞中的分子变化可能无法反映神经元的改变^3-5。脑脊液可能不足以提供有关细胞内分子的信息，而这些分子可能反映疾病相关且药物可逆的内在变化。

嗅觉上皮（OE）是中枢神经系统（CNS）中一个独特的部分，在胚胎发育上与边缘系统结构相关⁶；并且可通过鼻腔活检轻松获取。它由胶质细胞样支持（即， 支持细胞、基底增殖细胞以及处于不同发育阶段的嗅觉感受神经元^7-9因此，OE为便捷地研究神经精神疾病患者中枢神经系统（CNS）的动态变化提供了独特的机会⁷研究表明，食管上皮（OE）可作为替代组织，用于研究与脑神经元中发生事件相关的疾病过....

方案

注意：本研究中的所有研究志愿者均签署了经霍华德大学和约翰斯·霍普金斯大学机构审查委员会批准的知情同意书。仅签署知情同意书的参与者被纳入研究。本分析的研究基线包括：20名受试者（12名双相情感障碍患者和10名对照组；30%为男性），平均年龄（标准差）为38.2（14.1）岁。
注意：使用RNase Zap喷洒所有表面，以去除玻璃和塑料表面的RNase污染。

1. 活检操作步骤

1. 在受试者的鼻腔内喷洒4%的表面利多卡因（赛洛卡因）液体和0.05%盐酸羟甲唑啉，静置15分钟以达到麻醉效果。
2. 将½ x 3英寸的外科棉片浸入利多卡因与羟甲唑啉混合液中，置于鼻中隔上部区域的鼻腔内，静置15分钟。
3. 使用30°刚性鼻内窥镜定位鼻腔上部区域，用向上咬合的鼻钳从鼻中隔上部去除鼻黏膜组织，采集数个小组织标本。

2. 组织块的制备

1. 活检前立即用组织冷冻介质填充标准尺寸的冷冻模具。
2. 使用已灭菌的镊子将新鲜组织置于冷冻介质中，并在干冰上速冻。用冷冻介质填满冷冻块的其余部分，在干冰上冷冻冷冻块，并将组织块储存在 -80ºC 条件下。

3. 冷冻切片

1. 在冷冻切片前立即准备聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜载玻片。用RNase Zap溶....

结果

在分子特征研究中，实验方案及故障排除策略已成功优化。用于后续下游实时定量 PCR 分析的样本，其 RNA 质量和神经元富集标准已实现标准化。RIN 值和 RNA 浓度被评估为影响检测表达水平的混杂因素。通过对 RIN 值范围为 1 至 10 的多个样本进行分析，确定本研究中下游分析所需的最低 RIN 值约为 3.0 或更高。因此，cDNA 合成所用的 RNA 量被标准化为 1.0 ng。据此，RIN 值高于约 3.0 且 RNA 量为 1.0 ng 的高质量样本被用于 cDNA 合成。若难以获得足够样本量，RNA 量在 0.1 至 1.0 ng 范围内的样本也可使用。

使用实时荧光定量PCR分析确认神经元富集效果。通过比较显微切割样品与未切割样品中OMP基因的表达水平，以确定神经元层是否得到富集。选择OMP表达水平较未切割组织高两倍或以上的显微切割样品用于后续实验。

因此，通过应用这些标准，验证了该方法用于研究嗅觉上皮神经元中分子变化的可行性。图3表明，GSK-3β的表达水平受锂盐影响，而非非.......

讨论

本研究介绍并验证了一种结合鼻黏膜活检与激光显微切割技术（LCM）以获取富集嗅觉神经元层的新平台。该技术具有广泛的应用前景，可应用于生物标志物研究，包括治疗反应相关研究，以及针对其他神经精神疾病的药物研发，从而在该领域产生更广泛的影响。

为了获得适用于下游应用的高质量神经元，必须注意几个关键步骤和故障排除要点。首先，每位患者应获取 4 至 6 块嗅觉组织，以确保足够的样本量。其次，由于样本容易发生 RNA 降解，需将组织保持在适当的温度下，使用无 RNase 的设备和操作台面，佩戴手套，并避免直接向样本上方呼吸。如果 RNA 质量仍然较低，可考虑在 50 分钟内完成显微切割，并在解剖后立即进行 RNA 提取，或立即涡旋样本并置于干冰上，直至储存于 -80 °C。为提高 RNA 产量，可在激光显微切割（LCM）过程中增加切片数量。

由于难以获取人脑组织，研究神经精神疾病中脑部相关分子变化面临挑战。替代方法包括研究外周血细胞、尸检脑组织和诱导性多能干细胞（iPS细胞）。然而，外周血细胞可能无法代表疾病相关的神经元变化；尸检脑组织无法.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组织制备
Tissue-Tek Cryomold 模具	Sakura Finetek	4557
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	Sakura Finetek	4583
冷冻切片
膜片 1.0 PEN (D)	Carl Zeiss Microscopy	415190-9041-000
RNase Zap	Ambion	AM9780
DEPC 处理水	Quality Biological	351-068-131
显微切割
显微镜：PALM 系列 MicroLaser 系统	Carl Zeiss Microscopy		型号：Axiovert 200M 软件：Robo v3.2
No. 5 Dumont 显微解剖镊	Roboz	RS-49085
RNA 提取
RNAqueous Micro 试剂盒	Ambion	AM1931
cDNA 合成
SuperScript III 第一链合成试剂盒	Invitrogen	18080-051
OMP qPCR
SYBR GreenER qPCR SuperMix	Invitrogen	11760-500
TaqMan qPCR
TaqMan 基因表达检测探针	Applied Biosystems	多种
TaqMan 基因表达主混合液	Applied Biosystems	4369016