本文展示了一种通过向新生小鼠脑内脑室内注射腺相关病毒实现广泛神经元转导的技术。该方法可快速、简便地实现病毒递送的转基因在生命全程中的持续表达。
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方法文章
新生小鼠脑室内病毒注射以实现持续且广泛的神经元转导
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
随着科学进步的不断加速，实验神经科学领域亟需新的方法，以快速、简便地操控小鼠大脑中的基因表达。本文描述了一种由 Passini 和 Wolfe 首次提出的技术，即通过直接颅内递送病毒编码的转基因至新生小鼠大脑。该方法最基本的操作仅需一个冰桶和一支微升注射器即可完成。然而，对于初学者，该方案也可结合立体定位仪使用，以提高操作的一致性和精确性。该技术依赖于腺相关病毒（AAV）在出生后最初 12 至 24 小时内，当脑室管膜层尚未成熟时，能够自由地从脑室扩散至脑实质的特性。在此时期进行脑室内注射 AAV，可实现全脑神经元的广泛转导。基因表达在注射后数天内开始，并可持续至动物整个生命周期。通过调整病毒滴度可控制转导神经元的密度，而共表达的荧光蛋白则为转导细胞提供了重要的标记。随着越来越多的病毒核心平台能够提供即用型预包装试剂以及定制化病毒制备服务，这一方法为小鼠大脑基因表达操控提供了一种及时、快速、简便且远比传统种系工程成本更低的手段。
引言
传统的神经基因表达修饰方法需要耗时且昂贵的种系操作。替代性的从头方法，如子宫内电穿孔或立体定位慢病毒注射，虽然结果更快、成本更低，但存在需要复杂外科干预的缺点1-3。此外，这些方法的转基因表达空间范围有限。本文中，我们描述了一种快速、简便且经济的方法，通过向新生小鼠脑内侧脑室注射腺相关病毒（AAV），实现广泛性的神经元操控。该方法最早由 John Wolfe 和 Marco Passini 于 2001 年提出，他们指出 AAV 粒子体积小，可在脑脊液中扩散，随着脑脊液从侧脑室穿过未成熟的室管膜屏障进入脑实质4,5。在出生后 24 小时内进行 AAV 的脑室内注射，可实现病毒对跨越全脑各区域——从嗅球到脑干——的多种神经细胞亚群的广泛转导6,7。病毒递送的转基因在注射后数天内即可表达并具有活性，且在转导后可持续表达长达一年。因此，这种灵活的操控手段适用于从出生后早期脑发育到成年期衰老与退行性变等多种研究。
在将该技术调整以适应我们特定的实验需求时，我们主要聚焦于AAV8血清型，因为其在转导神经元方面效率最高6。我们证明，可通过稀释病毒滴度来调控被转导神经元的密度，从而适用于研究基因操作对细胞内在特性影响的实验。此外，我们还展示了可共注射两种病毒，以产生偏向于不同或重叠神经元群体的表达模式，具体取决于病毒包装所选用的血清型。我们的工作拓展了该技术的适用性，....
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方案
所有涉及动物的实验操作和方案均须依照美国国立卫生研究院（NIH）发布的《实验动物护理和使用指南》进行。本文所述操作流程已通过贝勒医学院机构动物护理和使用委员会的审查与批准。
用于在啮齿类动物脑内递送转基因的复制缺陷型腺相关病毒（AAV）载体适用于生物安全一级（Biosafety Level 1）操作。有关正确的防护措施和病毒操作程序的具体要求，请参阅美国疾病控制与预防中心（CDC）网站发布的美国政府文件《微生物学与生物医学实验室生物安全（BMBL）》。请咨询本地的兽医和环境安全工作人员，了解本机构针对病毒操作程序的具体规定。关于操作室、隔离检疫以及生物危害动物笼具标识的规定，各机构之间可能存在差异。
1. 准备P0代幼崽和代孕母鼠
- 为所有怀孕和哺乳期的雌性小鼠提供高脂饲料，以满足繁殖和哺乳期间的能量需求。
- 傍晚时，将一至两只健康的雌鼠放入单只雄鼠的笼中进行配种。次日早晨检查雌鼠是否有交配栓，并在发现交配栓后将雌鼠与雄鼠分笼。
- 对于母性行为较差的遗传背景（例如 C57BL/6 或 C3HeJ）的幼崽，使用代孕母鼠进行哺育。若寄养的幼崽出生时间与代孕母鼠自身产仔时间相差不超过四天，则代孕母鼠通常能够接受这些幼崽。
- 同时使用 ICR 或 FVB 品系雌鼠设立独立的配种笼，使其与实验组繁殖鼠的分娩时间大致相同。
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结果
成功的脑室注射病毒可实现广泛且强健的神经元表达。本研究中，我们采用在鸡β-肌动蛋白启动子（CBA启动子）调控下的YFP或tdTomato荧光基因来评估病毒转导效果。这些载体被包装为AAV8型病毒，并注射至新生（P0）ICR小鼠的侧脑室。高病毒滴度（每半脑1010个颗粒）可导致嗅球、纹状体、大脑皮层、海马和小脑呈现密集标记（图1A，左）。标记在小脑浦肯野神经元中也明显可见，但小脑颗粒神经元中则显著缺失，这是由于在P0时期这些细胞尚未大量出现。注射较少的病毒颗粒（107）则导致标记稀疏且表达强度较低（图1A，右）。我们通常使用AAV8病毒，其浓度范围为每半脑107至1010个颗粒，以此作为一种简便且可靠的方法来调控注射所产生的转基因嵌合程度（图1B）。我们还改进了该技术，通过共注射两种或多种病毒来表达多个转基因。将两种病毒包装于同一血清型（即均为AAV8）并共注射，会使转导结果偏向于重叠的神经元群体，从而使多数细胞同时表达两种转基因（<.......
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讨论
我们介绍了一种利用腺相关病毒（AAV）作为载体，广泛递送至新生小鼠脑内以操控神经元基因表达的多功能方法。与其他神经元转基因技术（如胎内电穿孔1或立体定位颅内注射2,3）相比，新生期病毒注射相对简便易行。基本操作可在数分钟内完成，仅需一个冰桶和一支微升注射器即可。通过注意若干技术细节，可实现最佳的动物存活率和外源基因表达，其中最重要的因素包括病毒原液的质量、注射的时机与准确性，以及出生后的护理。
病毒制备的质量对于成功转导至关重要。质量不佳的病毒制备会显著降低神经元的感染效率，并可能导致星形胶质细胞的显著转导，可能是由于吞噬了无感染性的病毒颗粒所致。许多大学校内设有专门从事病毒包装的核心实验室，而北卡罗来纳大学和宾夕法尼亚大学的大型设施则以多种血清型提供高质量、即用型试剂，并享有成本优惠。这些机构还可为无法获得预包装库存的载体提供定制包装服务。病毒制剂运抵实验室后，需注意腺相关病毒（AAV）颗粒在 -80 ºC 条件下可长期保持稳定，但对温度波动极为敏感。因此，应将分装样品储存于 -80 °C，且解冻后不得再次冷冻。
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
本研究由 Robert A. 和 Rene E. Belfer 家族基金会、NIA R21 AG038856（JLJ）、BrightFocus 基金会阿尔茨海默病研究基金 A2010097（JLJ）以及 NIA 衰老生物学培训基金 T32 AG000183（支持 SDG）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ICR远交系小鼠 | Harlan | Hsd:ICR（CD-1） | 该品系也称为 CD-1 |
| FVB 近交系小鼠 | 杰克逊实验室 | 1800 | 5-6周龄 |
| Nestlets | 实验室耗材 | 雀巢小熊糖 | |
| 牧羊人小屋 | 实验室耗材 | SS-小鼠 | |
| 高脂啮齿类动物饲料 | 普瑞纳饲料公司 | PicoLab 小鼠饲料 20，#5058 | 这是我们的标准繁殖用饲料 |
| 高脂啮齿类动物饲料（替代品） | Harlan Laboratories | Teklad Global 19%蛋白啮齿类动物饲料 #2019S | 若需低植物雌激素、可高压灭菌的饮食 |
| 注射器 | Hamilton | 7653-01 | 10 ml 注射器 |
| 注射针头 | Hamilton | 7803-04，RN 6PK PT4，0.375" | 32 G，用于标准的 P0 注射 |
| 用于冷冻麻醉的金属板 | McMaster Carr | 8975K439 | 原始铝板，6” ×12”, 0.25” 较厚，需由当地机加工车间切割为3个相等的部分，并打磨边缘 |
| 小型动物立体定位仪（带数字读数） | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| 通用注射器支架，带针头支撑脚 | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
| 新生儿固定架 | 斯托尔廷 | 51625 | 正式名称为小鼠与新生大鼠适配器 |
| 带有无菌指示剂的生物危害废物处理袋 | VWR | 14220-030 | 重要！ – 咨询当地兽医和环境安全人员，了解您所在机构的规定’生物危害废物处理方案 |
参考文献
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).
- Sun, B., Gan, L. Manipulation of g....
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重印与许可
