本文展示了一种通过向新生小鼠脑内脑室内注射腺相关病毒实现广泛神经元转导的技术。该方法可快速、简便地实现病毒递送的转基因在生命全程中的持续表达。
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方法文章
新生小鼠脑室内病毒注射以实现持续且广泛的神经元转导
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
随着科学进步的不断加速，实验神经科学领域亟需新的方法，以快速、简便地操控小鼠大脑中的基因表达。本文描述了一种由 Passini 和 Wolfe 首次提出的技术，即通过直接颅内递送病毒编码的转基因至新生小鼠大脑。该方法最基本的操作仅需一个冰桶和一支微升注射器即可完成。然而，对于初学者，该方案也可结合立体定位仪使用，以提高操作的一致性和精确性。该技术依赖于腺相关病毒（AAV）在出生后最初 12 至 24 小时内，当脑室管膜层尚未成熟时，能够自由地从脑室扩散至脑实质的特性。在此时期进行脑室内注射 AAV，可实现全脑神经元的广泛转导。基因表达在注射后数天内开始，并可持续至动物整个生命周期。通过调整病毒滴度可控制转导神经元的密度，而共表达的荧光蛋白则为转导细胞提供了重要的标记。随着越来越多的病毒核心平台能够提供即用型预包装试剂以及定制化病毒制备服务，这一方法为小鼠大脑基因表达操控提供了一种及时、快速、简便且远比传统种系工程成本更低的手段。
引言
传统的神经基因表达修饰方法需要耗时且昂贵的种系操作。替代性的从头方法，如子宫内电穿孔或立体定位慢病毒注射，虽然结果更快、成本更低，但存在需要复杂外科干预的缺点1-3。此外，这些方法的转基因表达空间范围有限。本文中，我们描述了一种快速、简便且经济的方法，通过向新生小鼠脑内侧脑室注射腺相关病毒（AAV），实现广泛性的神经元操控。该方法最早由 John Wolfe 和 Marco Passini 于 2001 年提出，他们指出 AAV 粒子体积小，可在脑脊液中扩散，随着脑脊液从侧脑室穿过未成熟的室管膜屏障进入脑实质4,5。在出生后 24 小时内进行 AAV 的脑室内注射，可实现病毒对跨越全脑各区域——从嗅球到脑干——的多种神经细胞亚群的广泛转导6,7。病毒递送的转基因在注射后数天内即可表达并具有活性，且在转导后可持续表达长达一年。因此，这种灵活的操控手段适用于从出生后早期脑发育到成年期衰老与退行性变等多种研究。
在将该技术调整以适应我们特定的实验需求时，我们主要聚焦于AAV8血清型，因为其在转导神经元方面效率最高6。我们证明，可通过稀释病毒滴度来调控被转导神经元的密度，从而适用于研究基因操作对细胞内在特性影响的实验。此外，我们还展示了可共注射两种病毒，以产生偏向于不同或重叠神经元群体的表达模式，具体取决于病毒包装所选用的血清型。我们的工作拓展了该技术的适用性，使其可广泛应用于多种实验神经科学场景中。
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方案
所有涉及动物的实验操作和方案均须依照美国国立卫生研究院（NIH）发布的《实验动物护理和使用指南》进行。本文所述操作流程已通过贝勒医学院机构动物护理和使用委员会的审查与批准。
用于在啮齿类动物脑内递送转基因的复制缺陷型腺相关病毒（AAV）载体适用于生物安全一级（Biosafety Level 1）操作。有关正确的防护措施和病毒操作程序的具体要求，请参阅美国疾病控制与预防中心（CDC）网站发布的美国政府文件《微生物学与生物医学实验室生物安全（BMBL）》。请咨询本地的兽医和环境安全工作人员，了解本机构针对病毒操作程序的具体规定。关于操作室、隔离检疫以及生物危害动物笼具标识的规定，各机构之间可能存在差异。
1. 准备P0代幼崽和代孕母鼠
- 为所有怀孕和哺乳期的雌性小鼠提供高脂饲料，以满足繁殖和哺乳期间的能量需求。
- 傍晚时，将一至两只健康的雌鼠放入单只雄鼠的笼中进行配种。次日早晨检查雌鼠是否有交配栓，并在发现交配栓后将雌鼠与雄鼠分笼。
- 对于母性行为较差的遗传背景（例如 C57BL/6 或 C3HeJ）的幼崽，使用代孕母鼠进行哺育。若寄养的幼崽出生时间与代孕母鼠自身产仔时间相差不超过四天，则代孕母鼠通常能够接受这些幼崽。
- 同时使用 ICR 或 FVB 品系雌鼠设立独立的配种笼，使其与实验组繁殖鼠的分娩时间大致相同。
- 雌鼠通常在发现交配栓后的 19 ± 1 天内分娩。分娩前 3 天（即栓查后第 16 天），将怀孕雌鼠转移至清洁笼盒中，并提供新鲜筑巢材料和带顶盖的庇护所。
- 从预计分娩日前 2 天（即栓查后第 17 天）开始，每天检查两次是否有新生幼崽。检查时应尽量减少对母鼠的应激，可通过观察笼底是否有粉红色的新生幼崽来判断。小鼠通常在上午分娩，但偶尔也会在下午分娩。
- 应在幼崽开始哺乳（可通过可见的乳斑判断）或出生后 6 小时内进行注射操作，以较早者为准。
2. 准备注射设备
- 使用32 G 针头的10 µl注射器准备对P0新生小鼠进行注射。若进行立体定位注射，将注射器安装至操纵臂上。
- 若使用立体定位仪进行注射，通过在模块前端的储液槽中加入100%乙醇和干冰，将新生小鼠操作台冷却至4–8 °C。保持温度高于1 °C，以避免幼鼠发生冻伤。
3. 准备用于注射的病毒稀释液
- 配制1%的台盼蓝染料溶液（20倍浓缩液）。
- 在II级生物安全柜内准备5–25 µl的腺相关病毒（AAV）原液分装样品，并将其置于-80 °C冰箱中保存以备后续使用。避免反复冻融，以免导致病毒转导效率下降。
- 从-80 °C冰箱中取出一份AAV分装样品，置于冰上解冻。
- 将病毒加入预冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制用于注射的病毒溶液。初始优化转导模式时，建议进行十倍系列稀释（每半脑1010至108个病毒颗粒）。
- 向AAV溶液中加入20倍浓缩的台盼蓝染料，使其终浓度为0.05%。
4. 新生幼崽注射前的准备
- 将一小块铝板放在冰上冷却。在铝板上放置一张干燥的擦拭巾，以保护幼鼠皮肤免受冷金属刺激。此装置可作为麻醉和注射幼鼠时的平坦低温操作面。
- 准备一个适用于新生小鼠的加热垫，用于注射前后维持其体温。
- 当新生幼鼠开始哺乳后，将约一半幼鼠从笼中取出，另一半留在母鼠身边。将取出的幼鼠置于加热垫上，等待注射。
注意：若亲生母鼠不照顾幼鼠，应立即将整窝幼鼠移出笼子，并将其放置于加热垫上等待注射。此情况可能出现在C57BL/6品系雌鼠的首胎，或其他繁殖性能较差的近交品系中。此种情况下，新生幼鼠体表将不可见乳斑。 - 将一只幼鼠从加热垫转移至冷金属板上，以诱导低温麻醉。等待2–3分钟，直至幼鼠完全麻醉。通过轻轻捏压一只前爪并观察是否无运动或呼吸反应，以确认麻醉状态。
5. 腺相关病毒注射至新生小鼠
- 新生小鼠颅内AAV的徒手注射：
- 将5 µl含0.05%台盼蓝的稀释AAV溶液装入注射器中。
- 用浸有70%乙醇的棉签轻轻擦拭麻醉后幼鼠的头部。
- 确定注射位点：从人字缝到每只眼睛距离的2/5处。另一个可选注射位点位于矢状缝外侧约0.8–1 mm处，处于人字缝与前囟中点位置。这些解剖标志在P0期可通过皮肤观察到。
- 使用无毒实验室记号笔标记注射位点。
- 持注射器时确保刻度可见，以便监测所注射液体的体积。
- 确保拇指可触及推杆顶部。在调整针头位置时，应将拇指从推杆上移开，以避免意外释放病毒液。
- 通过将肘部置于实验台面并使手臂倚靠在冰桶上，找到一个稳定舒适的注射姿势。
- 将幼鼠侧卧，头部正对注射器下方。转动其头部，使标记的注射位点朝上，并用手掌稳固但轻柔地固定该位置。
- 将注射器垂直于颅骨表面，将针头插入标记的注射位点，深度约为3 mm。继续进针直至阻力轻微下降，提示针头已进入侧脑室。如需参考，可用无毒记号笔在针尖上方3 mm处做标记。根据染料在脑室中的分布情况，针对不同品系和体型的幼鼠调整注射深度。
- 牢固固定注射器，确保按压推杆时针头不会进一步深入脑组织。若注射位置偏移至丘脑，病毒扩散将受到严重限制。
- 开始缓慢注射病毒，同时密切观察注射器上液体体积的变化。每个脑室最多注射2 µl。若针头位置正确，染料将扩散并充满脑室。
- 缓慢撤出针头。
- 待第一侧注射位点闭合后，再对另一侧半球进行注射。
注意：同一部位不得重复注射。重新插入针头会导致已注射的病毒外漏，并可能造成幼鼠损伤或死亡。 - 采用相同操作对对侧脑室进行注射。
- 新生小鼠颅内AAV的立体定位注射：
- 将5 µl含0.05%台盼蓝的稀释AAV溶液装入由立体定位操纵器固定的注射器中。
- 将幼鼠头部轻轻置于新生鼠固定架的耳杆之间。通过确认人字缝与前囟连线与载物台平行，确保头部在Y轴（前后方向）上保持水平；通过确认两耳之间或两眼之间的假想连线与载物台平行，确保头部在X轴（左右方向）上保持水平。
- 用浸有70%乙醇的棉签轻轻擦拭麻醉后幼鼠的头部。
- 使用立体定位操纵器将注射器移至人字缝上方，然后将X和Y坐标归零。将立体定位臂移动至(X, Y) = (0.8, 1.5) mm，适用于标准P0期幼鼠。
注意：幼鼠体型及立体定位坐标可能因品系和年龄而异。应根据染料注射结果调整坐标，以准确靶向侧脑室。 - 缓慢将针头下降至注射位点。当针头穿透皮肤时，颅骨表面会先凹陷后释放。将针头略微回撤，直至颅骨恢复正常的凹面形态，但保持针尖斜面仍位于皮肤下方。在此位置将Z坐标归零。
- 将针头插入至Z = -1.7 mm，然后回撤至-1.5 mm。
- 缓慢注射病毒。每侧半球最多可接受2 µl溶液。
- 注射完成后保持针头静置30–60秒，然后在1–2分钟内缓慢撤出针头。
- 对对侧半球重复上述操作，注射位点使用X轴的负坐标。
注意：其他可选注射坐标为(X, Y, Z) = (0.8, 2.0, -1.5) mm 和 (1.2, 1.0, -1.5) mm。首先在(0.8, 2.0)处注射，随后移动至(0.8, -2.0)、(1.2, 1.0)，最后至(1.2, -1.0)。每个位点注射1 μl溶液，每侧半球共注射2 μl。各注射点之间应快速移动，确保整个操作在10分钟内完成。
6. 注射后护理
- 完成双侧半球注射后，将幼鼠放回加热垫上，直至其体温和皮肤颜色恢复正常，并开始活动。
- 若使用亲生母鼠哺育注射后的新生鼠，在幼鼠恢复正常活动后将其送回亲生母鼠身边。将未注射的其余幼鼠继续留在加热垫上。重复此操作，直至所有小鼠完成注射。
- 若使用代孕母鼠哺育注射后的新生鼠，在幼鼠恢复正常活动后，将其全部转移至代孕母鼠处进行护理。
- 将代孕母鼠所生的大部分或全部幼鼠从笼中移除，以确保注射幼鼠被成功接纳。
- 若代孕母鼠的幼鼠与注射幼鼠具有相同的眼部和皮肤颜色，需用实验标记笔对代孕母鼠的幼鼠进行标记，以便后续区分。
- 将代孕母鼠的幼鼠及其部分垫料与注射后的幼鼠一同放置，确保注射幼鼠沾染到代孕母鼠亲生幼鼠的气味，以提高其被接纳的可能性。
- 仅将注射后的幼鼠放回代孕母鼠的笼中，并处死代孕母鼠原有的其余幼鼠。
- 确保母鼠在幼鼠放入笼中后10分钟内开始照料并哺乳注射幼鼠 。若母鼠在此时间内未主动聚集幼鼠，则应将幼鼠转移至另一只代孕母鼠处。
- 用生物危害警示卡标记笼具，表明其中含有病毒注射动物。将笼具置于经批准的区域中饲养72小时。
- 72小时隔离期结束后，将母鼠和幼鼠（不包括垫料或其他笼内物品）转移至清洁笼具中。此操作应在二级生物安全柜内进行，以避免接触可能被病毒污染的垫料。随后将装有注射动物的清洁笼具送回常规小鼠饲养设施。
- 将污染的笼具放入生物危害袋中，经高压灭菌消毒后，再送回动物房。
7. 清理
- 将剩余的病毒溶液置于 4 °C 保存以备后续使用。病毒在 4 °C 条件下储存至少 2 个月仍可保持转导效率8。
- 使用 2% 次氯酸钠对注射针头和注射器进行消毒，随后用去离子水反复冲洗。
- 用 2% 次氯酸钠清洁工作区域，再用 70% 乙醇擦拭。
- 将所有一次性物品（包括移液器吸头、离心管、口罩和手套）收集至塑料生物危害袋中。根据当地法律法规和机构规定处理废弃物（即高压灭菌或焚烧）。
8. 准备小鼠大脑用于成像
- 注射后3-4周，将注射过的小鼠放入二氧化碳安乐死舱中。遵循机构指南进行正确的安乐死操作。不要用多聚甲醛灌注动物，因为这会淬灭荧光标记。
- 从颅骨中取出完整的大脑，并在4 °C条件下，用含4%多聚甲醛的PBS固定3-12小时。
- 将固定后的大脑转移至30%蔗糖溶液中进行冷冻保护。在4 °C孵育，直至大脑沉入底部。
- 准备一桶细碎的干冰。沿中线将大脑切成两半。将脑半球埋入干冰中进行冷冻。
- 通过加入干冰和100%乙醇冷却切片机的载台。
- 用PBS将脑组织固定在载台上，切面朝下，使其冷冻固定。
- 使用冷冻滑动切片机对大脑进行30-45 µm厚度的连续切片。
- 将切片转移至含有防冻液（250 ml 甘油，300 ml 乙二醇，500 ml 0.1 M 磷酸缓冲液，pH 7.4）的24孔板中。用锡箔纸覆盖孔板，并在-20 °C保存以备后续使用。
- 从1-4个孔中取出切片，在PBS中清洗3次。
- 将切片贴附到显微镜载玻片上并加盖盖玻片。将载玻片置于避光处干燥。
- 使用适合检测内源性YFP或tdTomato的滤光片对载玻片进行成像，以检查病毒转导模式。
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结果
成功的脑室注射病毒可实现广泛且强健的神经元表达。本研究中，我们采用在鸡β-肌动蛋白启动子（CBA启动子）调控下的YFP或tdTomato荧光基因来评估病毒转导效果。这些载体被包装为AAV8型病毒，并注射至新生（P0）ICR小鼠的侧脑室。高病毒滴度（每半脑1010个颗粒）可导致嗅球、纹状体、大脑皮层、海马和小脑呈现密集标记（图1A，左）。标记在小脑浦肯野神经元中也明显可见，但小脑颗粒神经元中则显著缺失，这是由于在P0时期这些细胞尚未大量出现。注射较少的病毒颗粒（107）则导致标记稀疏且表达强度较低（图1A，右）。我们通常使用AAV8病毒，其浓度范围为每半脑107至1010个颗粒，以此作为一种简便且可靠的方法来调控注射所产生的转基因嵌合程度（图1B）。我们还改进了该技术，通过共注射两种或多种病毒来表达多个转基因。将两种病毒包装于同一血清型（即均为AAV8）并共注射，会使转导结果偏向于重叠的神经元群体，从而使多数细胞同时表达两种转基因（<...
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讨论
我们介绍了一种利用腺相关病毒（AAV）作为载体，广泛递送至新生小鼠脑内以操控神经元基因表达的多功能方法。与其他神经元转基因技术（如胎内电穿孔1或立体定位颅内注射2,3）相比，新生期病毒注射相对简便易行。基本操作可在数分钟内完成，仅需一个冰桶和一支微升注射器即可。通过注意若干技术细节，可实现最佳的动物存活率和外源基因表达，其中最重要的因素包括病毒原液的质量、注射的时机与准确性，以及出生后的护理。
病毒制备的质量对于成功转导至关重要。质量不佳的病毒制备会显著降低神经元的感染效率，并可能导致星形胶质细胞的显著转导，可能是由于吞噬了无感染性的病毒颗粒所致。许多大学校内设有专门从事病毒包装的核心实验室，而北卡罗来纳大学和宾夕法尼亚大学的大型设施则以多种血清型提供高质量、即用型试剂，并享有成本优惠。这些机构还可为无法获得预包装库存的载体提供定制包装服务。病毒制剂运抵实验室后，需注意腺相关病毒（AAV）颗粒在 -80 ºC 条件下可长期保持稳定，但对温度波动极为敏感。因此，应将分装样品储存于 -80 °C，且解冻后不得再次冷冻。
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
本研究由 Robert A. 和 Rene E. Belfer 家族基金会、NIA R21 AG038856（JLJ）、BrightFocus 基金会阿尔茨海默病研究基金 A2010097（JLJ）以及 NIA 衰老生物学培训基金 T32 AG000183（支持 SDG）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ICR远交系小鼠 | Harlan | Hsd:ICR（CD-1） | 该品系也称为 CD-1 |
| FVB 近交系小鼠 | 杰克逊实验室 | 1800 | 5-6周龄 |
| Nestlets | 实验室耗材 | 雀巢小熊糖 | |
| 牧羊人小屋 | 实验室耗材 | SS-小鼠 | |
| 高脂啮齿类动物饲料 | 普瑞纳饲料公司 | PicoLab 小鼠饲料 20，#5058 | 这是我们的标准繁殖用饲料 |
| 高脂啮齿类动物饲料（替代品） | Harlan Laboratories | Teklad Global 19%蛋白啮齿类动物饲料 #2019S | 若需低植物雌激素、可高压灭菌的饮食 |
| 注射器 | Hamilton | 7653-01 | 10 ml 注射器 |
| 注射针头 | Hamilton | 7803-04，RN 6PK PT4，0.375" | 32 G，用于标准的 P0 注射 |
| 用于冷冻麻醉的金属板 | McMaster Carr | 8975K439 | 原始铝板，6” ×12”, 0.25” 较厚，需由当地机加工车间切割为3个相等的部分，并打磨边缘 |
| 小型动物立体定位仪（带数字读数） | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| 通用注射器支架，带针头支撑脚 | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
| 新生儿固定架 | 斯托尔廷 | 51625 | 正式名称为小鼠与新生大鼠适配器 |
| 带有无菌指示剂的生物危害废物处理袋 | VWR | 14220-030 | 重要！ – 咨询当地兽医和环境安全人员，了解您所在机构的规定’生物危害废物处理方案 |
参考文献
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- Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Curr Protoc Neurosci. 4, (2010).
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重印与许可
