血液接触聚合物血流导管会引发异物反应，这种反应与临床并发症有关。本文介绍了钱德勒循环装置（Chandler Loop Apparatus），这是一种模拟血液流经此类导管的实验工具。在这些导管上附加重组CD47可减少异物反应的表现。
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本文内容
摘要
摘要
当人工材料表面被引入体内时，会引发异物反应。其特征是血液蛋白的吸附，以及随之而来的血小板黏附与活化、单核细胞/巨噬细胞的黏附和炎症细胞信号传导事件，从而导致术后并发症。钱德勒循环装置（Chandler Loop Apparatus）是一种实验系统，可使研究人员研究大量血液流经聚合物导管时发生的分子与细胞相互作用。因此，该装置已被用作一种ex vivo模型，用于评估不同聚合物表面修饰的抗炎特性。本实验室已证实，通过光激活化学反应将重组CD47共价修饰于血液导管表面，可赋予聚合物材料表面良好的生物相容性。将CD47连接至聚合物表面可能是提高聚合物血液导管功效的有效手段。本文详细描述了采用光激活化学方法将重组CD47连接至临床相关聚合物血液导管的技术流程，以及利用钱德勒循环装置作为ex vivo实验模型，检测经CD47修饰的导管与对照导管与血液相互作用的方法学。
引言
许多临床操作，例如心肺转流和肾脏透析，需要使用聚合物制的血液导管，且常伴随操作后的并发症1当与血液接触时，这些聚合物会引发机体的异物反应（FBR），导致血液蛋白和血小板吸附、单核细胞/巨噬细胞黏附，以及促炎性细胞因子的释放，上述过程均可能导致术后并发症和（或）装置失效2,3因此，解决这一问题的策略仍是生物材料研究中一个重要的持续性课题。研究人员已尝试通过在接触血液的表面修饰生物活性或生物惰性分子来应对这一挑战。4-6本实验室的研究重点是将重组CD47（recCD47）偶联至聚合物生物材料，作为一种减轻异物反应（FBR）并提高这些材料效能的策略。CD47是一种广泛表达的跨膜蛋白，已知其在免疫逃逸中发挥作用，可赋予表达细胞“自我”识别状态。7-10 在连接到聚合物表面时，显示出赋予生物相容性的潜力11-13信号调节蛋白α（SIRPα）是CD47的同源受体，属于含免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）的跨膜蛋白家族，表达于髓系来源的细胞上14我们先前已证明，CD47通过SIRPα介导的细胞信号传导，可下调机体对聚氨酯（PU）和聚氯乙烯（PVC）的免疫反应 体外, 离体，以及 体内 模型11-13.
我们的研究核心是一种相对较新的光活化化学方法，本文对此进行了描述：通过将聚合物管与一种多功能聚合物（PDT-BzPh）反应，可在管壁上共价连接化学活性的巯基。该多功能聚合物由2-吡啶基二硫代（PDT）、光反应性苯甲酮（BzPh）以及羧基修饰的聚烯丙胺组成11-13。使用三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）11还原共价连接的PDT基团后，可获得含巯基的表面，进而与治疗性分子发生反应。本文及先前研究12,13中详细描述了重组CD47蛋白，其进一步经C端多聚赖氨酸尾修饰12,13，并与磺基琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯（sulfo-SMCC）反应1小时，以生成可与巯基反应的官能团，从而在管材与recCD47之间形成单硫键11。CD47功能化表面的抗炎能力在体外（ex vivo）通过钱德勒循环装置（Chandler Loop Apparatus）结合全人血进行测试，该装置最初于1958年被描述为一种血栓性凝固的体外（in vitro）模型15。该装置依赖于一个部分充气的封闭管路系统，并通过旋转电机驱动血液在管路中循环15。该实验模型提供了研究血液接触修饰与未修饰表面的影响，以及这些表面修饰对血液细胞生理功能影响的机会。
利用这种光活化化学方法，可将recCD47连接至多种聚合物表面，并可通过一种临床相关的模拟血液在聚合物表面灌注的离体模型来评估其抗炎能力11,12。在装置中接触人血时，经recCD47修饰的临床级血液导管相比未修饰的聚合物，血小板和炎症细胞的黏附显著减少。下文详细描述了该修饰过程的逐步操作步骤。
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方案
1. 使用 recCD47 修饰聚合物表面
注意：该方案在图1中以示意图形式进行了总结。图1A展示了巯基反应性聚合物表面的制备过程。图1B展示了巯基反应性recCD47的制备过程。
- 第1天
- 在无菌水中配制PDT-BzPh（1 mg/ml）和碳酸氢钾（KHCO3）（0.7 mg/ml）的溶液。4 °C下避光搅拌过夜（避光保护）。
- 第2天
- 将聚合物管剪成40 cm长的片段（长度足以绕在旋转轮上）。
- 在摇床或Chandler循环装置上，用0.1%的氯化六烷基吡啶水溶液室温浸泡管子90分钟。浸泡后用无菌水冲洗管子3次。
- 通过加入15%的磷酸二氢钾（KH2PO4）水溶液酸化第1天制备的PDT-BzPh溶液。每毫升PDT-BzPh溶液中加入50 µl KH2PO4，形成浑浊的胶束溶液。
- 在摇床或装置上，将管子在酸化后的PDT-BzPh溶液中室温浸泡40分钟。
- 用稀释的乙酸（1:1,000）冲洗管子一次。
- 将管子暴露于紫外光照射下，总时长为60分钟。每隔15分钟将管子旋转¼圈，以确保整个表面被均匀照射。
- 在摇床或装置上，将管子在20 mg/ml碳酸氢钾（KHCO3）溶液中室温浸泡20分钟。
- 用无菌水冲洗管子3次，并在4 °C下保存于无菌水中。
- 第3天
- 将5 mg Sulfo-SMCC溶解于200 µl二甲基甲酰胺（DMF）中（注意： 在通风橱中操作）。
- 将步骤1制备的Sulfo-SMCC溶液50 µl加入到0.1 mg/ml的recCD47多聚赖氨酸溶液中，室温搅拌60分钟。
- 在60分钟搅拌过程中，对无菌杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）进行脱气处理并备用。
- 按照制造商说明，使用7K分子量截断的旋转脱盐柱纯化经Sulfo-SMCC反应的recCD47。收集最终流出液（高质量的巯基反应性recCD47），并用DPBS稀释至足以包被管子内表面的体积。
- 用无菌、脱气的DPBS冲洗第2天的管子3次。
- 用含有20 mg/ml三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）的脱气DPBS溶液与管子修饰表面反应，时间少于2分钟。随后用无菌脱气DPBS冲洗管子4次。
- 将经Sulfo-SMCC反应的recCD47加入管子中，在摇床或装置上4 °C孵育过夜。
2. 改性表面修饰的重组CD47的免疫测定定量分析
- 用DPBS将第3天待定量的修饰管冲洗3次。未用于定量的管子保存在DPBS中，置于4 °C。
- 使用4 mm活检打孔器制备重复的管样品，并将活检样品放入96孔板的孔中。
- 制备阴性对照，即未经修饰且未用检测抗体处理的管样品；制备抗体对照，即未经修饰但用检测抗体处理的管样品；制备经修饰并用检测抗体处理的管测试样品。
- 用含0.4%牛血清白蛋白（BSA）的DPBS在室温下振荡封闭样品60分钟。
- 封闭后，吸除BSA溶液，用含1% Tween-20的Tris缓冲盐水（TBST）振荡洗涤3次，每次10分钟。
- 根据生产商推荐的免疫测定稀释比例，用0.4% BSA配制抗体工作液。将人CD47抗体B6H12-FITC按1:100比例稀释于0.4% BSA中。
- 向相应孔中加入200 µl抗体稀释液。阴性对照孔仅加入0.4% BSA。在室温下振荡孵育60分钟（避光）。
- 用TBST振荡洗涤3次，每次10分钟。吸除最后一次TBST洗涤液后，向管样品孔中加入200 µl DPBS。
- 收集最终的穿流液，即高质量的巯基反应性重组CD47，并稀释至适当体积，用于在DPBS中包被管内表面。
- 使用酶标仪检测FITC信号强度，设定激发波长为485 nm，发射波长为538 nm。
- 根据标准值计算结合到聚合物表面的recCD47量，并校正抗体对照样品的自发荧光和非特异性结合。
3. 钱德勒环路装置方案
在开始采集人血样本之前，须先获得机构审查委员会（IRB）对采血方案及知情同意书文件的批准。获取人血供体的知情同意。
注：装置示意图见图2。
- 向水浴锅中加入蒸馏水，直至水位达到直径轮约一半的位置。向水浴锅中加入足量漂白剂，配制成10%的漂白液。将水浴锅温度设置为37 °C，并等待温度平衡。
- 准备金属适配器（见图1B）、未改性导管和改性导管，并按照图1C所示方式在装置轮周围进行组装。确保在安装金属适配器的情况下，导管能紧密贴合于轮子周围。
- 根据经IRB批准的方案采集30 ml血液样本，置于预先加入2 ml柠檬酸盐或其他抗凝剂的试管中，采集后通过倒置混匀以防止凝血。
- 使用金属阀门和注射器向每根导管中加入约10 ml血液，导管内保留少量空气。拧紧阀门盖，旋转3小时。
- 将血液排入已加入10%漂白液（或根据机构规定）的废液杯中。
- 用DPBS轻柔冲洗导管内部，以去除所有血液残留。冲洗液收集至废液杯中。按照机构规定处理废弃血液。
- 使用10%漂白液或根据机构规定对装置及所有接触血液的表面进行消毒。
- 按照下文所述方法对样品进行荧光显微镜或扫描电子显微镜处理。
4. 荧光显微镜观察与细胞计数
- 配制 4% 多聚甲醛（PFA）溶液（注意： 在通风橱中操作）。
- 将导管在 4% PFA 溶液中于 4 °C 过夜孵育。
- 过夜孵育后，去除 4% PFA 溶液，并用 DPBS 非常轻柔地冲洗薄膜。
- 将导管切成若干片段，以暴露管腔表面用于染色。
- 在室温下，用数滴含 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片介质对导管片段染色 30 分钟（避光保护）。染色后，用 DPBS 非常轻柔地冲洗导管，以降低背景 DAPI 信号。
- 使用配备 DAPI 滤光片和数字相机的荧光显微镜，在 200X 放大倍数下随机选取 9 个视野进行成像，并计数细胞数量。
- 记录每个视野的细胞计数，并进行适当的统计学分析以确定结果的统计学显著性。
5. 扫描电子显微镜
- 配制2%戊二醛溶液（注意： 在通风橱中操作）。
- 将导管置于2%戊二醛溶液中，4 °C过夜孵育。
- 过夜孵育后，用DPBS轻轻冲洗导管3次。
- 配制1%四氧化锇溶液（注意： 有严重吸入危险！须在通风橱中使用）。
- 将导管在1%四氧化锇溶液中室温孵育15分钟。
- 用DPBS轻轻冲洗导管3次。
- 配制一系列浓度的乙醇溶液（25%、50%、75%、95%和100%乙醇）。
- 将导管依次在不同浓度乙醇溶液中孵育以进行脱水处理：分别在25%、50%、75%和95%乙醇中各孵育20分钟，在100%乙醇中孵育30分钟。
- 使用CO2进行临界点干燥45分钟，以彻底去除水分。
- 用银浆或石墨将导管片段固定在样品台（stub）上。
- 在导管片段表面镀12.5 nm厚的金-钯膜。
- 在扫描电子显微镜下观察。
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结果
通过使用PDT-BzPh和TCEP，以及利用SMCC将具有巯基反应活性的重组CD47多聚赖氨酸连接到聚合物表面，可制备出对巯基具有反应活性的聚合物表面。该修饰过程的示意图见图1。此修饰方法的优势在于，只要蛋白质含有足够数量的化学反应性基团（如含氨基的赖氨酸），且聚合物表面具有足够可及的碳氢链段，该方法便可适用于多种不同的蛋白质和多种不同的聚合物表面。
先前已证明，可使用本方案将重组CD47（recCD47）偶联至聚合物表面11-13。如图3A所示，使用与CD47胞外Ig结构域结合的FITC标记抗体进行染色后，recCD47在聚合物薄膜上显示出明显的FITC荧光信号，且该信号定位于薄膜区域，差分干涉相差（DIC）成像结果（图3B）进一步证实了这一点。这些结果表明，recCD47可共价连接至聚氨酯薄膜表面。通过测定荧光强度并结合标准曲线，可确定表面结合的recCD47浓度。我们已证实，recCD47在聚合物表面的偶联水平可超过500 ng/cm2,11-...
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讨论
光激活化学反应（总结见图1）可用于修饰几乎任何含有足够碳氢化合物的聚合物表面，以促进PDT-BzPh的结合，并通过后续的紫外光照射实现PDT-BzPh的光激活。通过在聚合物表面引入反应性巯基，可进一步连接多种待测功能分子。在我们的研究中，选择了重组CD4711-13作为目标分子。所采用的偶联化学反应涉及蛋白质的氨基与双功能交联剂SMCC11-13之间的反应，从而获得具有巯基反应活性的重组CD47（recCD47），用于进一步与巯基化聚合物表面发生反应。最终产物为单硫醚共价键，将recCD47稳定地共价连接至聚合物表面。为确保CD47蛋白中氨基酸残基的氨基未参与该偶联反应，从而避免影响固定化CD47的生物学活性，我们进一步对recCD47进行了改造，在其C末端插入了一段多聚赖氨酸标签。这一分子策略同样可能适用于其他蛋白质。因此，本文及其他文献11-13中所描述的偶联化学方法为评估潜在治疗性分子是否能够赋予合成材料表面生物相容性提供了重要途径。
该方案的一个缺点是，将某些类型的聚合物（如...
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披露
本研究的资助来自美国国立卫生研究院下属的国家生物医学成像与生物工程研究所，资助编号为 R21 EB015612（SJS），以及国家心肺血液研究所，资助编号为 T32 HL007915（JBS 和 RJL）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16% 多聚甲醛（PFA） | Thermo Scientific | 58906 | 注意！在通风橱中使用 |
| 25% 戊二醛 | VWR | AAA17876-AP | 注意！在通风橱中使用 |
| 2-吡啶二硫代苯甲酮（PDT-BzPH） | 实验室合成 | N/A | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A3059-100G | |
| 柠檬酸盐 | Sigma | S5770-50ML | |
| 数码相机 | Leica | DC500 | 已停产 |
| 二甲基甲酰胺（DMF） | Sigma | 270547-100ML | 注意！在通风橱中使用 |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（DPBS） | Gibco/Life Technologies | 14190-136 | |
| 荧光显微镜 | Nikon | TE300 | |
| 冰醋酸 | Fisher Scientific | A38-212 | 注意！在通风橱中使用 |
| 人CD47（B6H12）– FITC 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-12730 | |
| 四氧化锇 | Acros Organics | 197450050 | 注意！在通风橱中使用 |
| 碳酸氢钾（KHCO3） | Sigma | 237205-100G | |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | Sigma | P5655-100G | |
| 聚氯乙烯导管（心血管手术套件） | Terumo Cardiovascular Systems | 60050 | 大多数临床级导管均可使用 |
| 扫描电子显微镜 | JEOL | JSM-T330A | |
| 氯化钠（NaCl） | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| 酶标仪 | Molecular Devices | Spectramax Gemini EM | |
| Sulfo-SMCC | Sigma | M6035-10MG | 对湿气敏感！ |
| 三(2-羧乙基)膦（TCEP-HCl） | Thermo Scientific | 20491 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531 | |
| 含DAPI的Vectashield封片剂 | Fisher Scientific | H-1200 | 避光！ |
| Zeba 脱盐离心柱 – 7 K 分子量截留 | Thermo Scientific | 89891 |
参考文献
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