血液接触聚合物血流导管会引发异物反应，这种反应与临床并发症有关。本文介绍了钱德勒循环装置（Chandler Loop Apparatus），这是一种模拟血液流经此类导管的实验工具。在这些导管上附加重组CD47可减少异物反应的表现。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
当人工材料表面被引入体内时，会引发异物反应。其特征是血液蛋白的吸附，以及随之而来的血小板黏附与活化、单核细胞/巨噬细胞的黏附和炎症细胞信号传导事件，从而导致术后并发症。钱德勒循环装置（Chandler Loop Apparatus）是一种实验系统，可使研究人员研究大量血液流经聚合物导管时发生的分子与细胞相互作用。因此，该装置已被用作一种ex vivo模型，用于评估不同聚合物表面修饰的抗炎特性。本实验室已证实，通过光激活化学反应将重组CD47共价修饰于血液导管表面，可赋予聚合物材料表面良好的生物相容性。将CD47连接至聚合物表面可能是提高聚合物血液导管功效的有效手段。本文详细描述了采用光激活化学方法将重组CD47连接至临床相关聚合物血液导管的技术流程，以及利用钱德勒循环装置作为ex vivo实验模型，检测经CD47修饰的导管与对照导管与血液相互作用的方法学。
引言
许多临床操作，例如心肺转流和肾脏透析，需要使用聚合物制的血液导管，且常伴随操作后的并发症1当与血液接触时，这些聚合物会引发机体的异物反应（FBR），导致血液蛋白和血小板吸附、单核细胞/巨噬细胞黏附，以及促炎性细胞因子的释放，上述过程均可能导致术后并发症和（或）装置失效2,3因此，解决这一问题的策略仍是生物材料研究中一个重要的持续性课题。研究人员已尝试通过在接触血液的表面修饰生物活性或生物惰性分子来应对这一挑战。4-6本实验室的研究重点是将重组CD47（recCD47）偶联至聚合物生物材料，作为一种减轻异物反应（FBR）并提高这些材料效能的策略。CD47是一种广泛表达的跨膜蛋白，已知其在免疫逃逸中发挥作用，可赋予表达细胞“自我”识别状态。7-10 在连接到聚合物表面时，显示出赋予生物相容性的潜力11-13信号调节蛋白α（SIRPα）是CD47的同源受体，属于含免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）的跨膜蛋白家族，表达于髓系来源的细胞上14我们先前已证明，CD47通过SIRPα介导的细胞信号传导，可下调机体对聚氨酯（PU）和聚氯乙烯（PVC）的免疫反应 体外, 离体，以及 体内 模型11-13.
我们的研究核心是一种相对较新的光活化化学方法，本文对此进行了描述：通过将聚合物管与一....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 使用 recCD47 修饰聚合物表面
注意：该方案在图1中以示意图形式进行了总结。图1A展示了巯基反应性聚合物表面的制备过程。图1B展示了巯基反应性recCD47的制备过程。
- 第1天
- 在无菌水中配制PDT-BzPh（1 mg/ml）和碳酸氢钾（KHCO3）（0.7 mg/ml）的溶液。4 °C下避光搅拌过夜（避光保护）。
- 第2天
- 将聚合物管剪成40 cm长的片段（长度足以绕在旋转轮上）。
- 在摇床或Chandler循环装置上，用0.1%的氯化六烷基吡啶水溶液室温浸泡管子90分钟。浸泡后用无菌水冲洗管子3次。
- 通过加入15%的磷酸二氢钾（KH2PO4）水溶液酸化第1天制备的PDT-BzPh溶液。每毫升PDT-BzPh溶液中加入50 µl KH2PO4，形成浑浊的胶束溶液。
- 在摇床或装置上，将管子在酸化后的PDT-BzPh溶液中室温浸泡40分钟。
- 用稀释的乙酸（1:1,000）冲洗管子一次。
- 将管子暴露于紫外光照射下，总时长....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
通过使用PDT-BzPh和TCEP，以及利用SMCC将具有巯基反应活性的重组CD47多聚赖氨酸连接到聚合物表面，可制备出对巯基具有反应活性的聚合物表面。该修饰过程的示意图见图1。此修饰方法的优势在于，只要蛋白质含有足够数量的化学反应性基团（如含氨基的赖氨酸），且聚合物表面具有足够可及的碳氢链段，该方法便可适用于多种不同的蛋白质和多种不同的聚合物表面。
先前已证明，可使用本方案将重组CD47（recCD47）偶联至聚合物表面11-13。如图3A所示，使用与CD47胞外Ig结构域结合的FITC标记抗体进行染色后，recCD47在聚合物薄膜上显示出明显的FITC荧光信号，且该信号定位于薄膜区域，差分干涉相差（DIC）成像结果（图3B）进一步证实了这一点。这些结果表明，recCD47可共价连接至聚氨酯薄膜表面。通过测定荧光强度并结合标准曲线，可确定表面结合的recCD47浓度。我们已证实，recCD47在聚合物表面的偶联水平可超过500 ng/cm2,11-.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
光激活化学反应（总结见图1）可用于修饰几乎任何含有足够碳氢化合物的聚合物表面，以促进PDT-BzPh的结合，并通过后续的紫外光照射实现PDT-BzPh的光激活。通过在聚合物表面引入反应性巯基，可进一步连接多种待测功能分子。在我们的研究中，选择了重组CD4711-13作为目标分子。所采用的偶联化学反应涉及蛋白质的氨基与双功能交联剂SMCC11-13之间的反应，从而获得具有巯基反应活性的重组CD47（recCD47），用于进一步与巯基化聚合物表面发生反应。最终产物为单硫醚共价键，将recCD47稳定地共价连接至聚合物表面。为确保CD47蛋白中氨基酸残基的氨基未参与该偶联反应，从而避免影响固定化CD47的生物学活性，我们进一步对recCD47进行了改造，在其C末端插入了一段多聚赖氨酸标签。这一分子策略同样可能适用于其他蛋白质。因此，本文及其他文献11-13中所描述的偶联化学方法为评估潜在治疗性分子是否能够赋予合成材料表面生物相容性提供了重要途径。
该方案的一个缺点是，将某些类型的聚合物（如.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
本研究的资助来自美国国立卫生研究院下属的国家生物医学成像与生物工程研究所，资助编号为 R21 EB015612（SJS），以及国家心肺血液研究所，资助编号为 T32 HL007915（JBS 和 RJL）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16% 多聚甲醛（PFA） | Thermo Scientific | 58906 | 注意！在通风橱中使用 |
| 25% 戊二醛 | VWR | AAA17876-AP | 注意！在通风橱中使用 |
| 2-吡啶二硫代苯甲酮（PDT-BzPH） | 实验室合成 | N/A | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A3059-100G | |
| 柠檬酸盐 | Sigma | S5770-50ML | |
| 数码相机 | Leica | DC500 | 已停产 |
| 二甲基甲酰胺（DMF） | Sigma | 270547-100ML | 注意！在通风橱中使用 |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（DPBS） | Gibco/Life Technologies | 14190-136 | |
| 荧光显微镜 | Nikon | TE300 | |
| 冰醋酸 | Fisher Scientific | A38-212 | 注意！在通风橱中使用 |
| 人CD47（B6H12）– FITC 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-12730 | |
| 四氧化锇 | Acros Organics | 197450050 | 注意！在通风橱中使用 |
| 碳酸氢钾（KHCO3） | Sigma | 237205-100G | |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | Sigma | P5655-100G | |
| 聚氯乙烯导管（心血管手术套件） | Terumo Cardiovascular Systems | 60050 | 大多数临床级导管均可使用 |
| 扫描电子显微镜 | JEOL | JSM-T330A | |
| 氯化钠（NaCl） | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| 酶标仪 | Molecular Devices | Spectramax Gemini EM | |
| Sulfo-SMCC | Sigma | M6035-10MG | 对湿气敏感！ |
| 三(2-羧乙基)膦（TCEP-HCl） | Thermo Scientific | 20491 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531 | |
| 含DAPI的Vectashield封片剂 | Fisher Scientific | H-1200 | 避光！ |
| Zeba 脱盐离心柱 – 7 K 分子量截留 | Thermo Scientific | 89891 |
参考文献
- Bruck, S. D. Medical applications of polymeric materials. Med. Prog. Technol. 9 (1), 1-16 (1982).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Levy, J. H., Tanaka, K. A.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
