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利用高密度功能性蛋白质微阵列检测蛋白质-蛋白质相互作用

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DOI：

10.3791/51872

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2015年8月2日

 ,  , 
1Department of Genetics, Stanford University, 2Stanford Center for Genomics and Personalized Medicine, Stanford University

本文内容

摘要

利用包含几乎整个S. cerevisiae蛋白质组的蛋白质微阵列，可并行快速、无偏倚地检测数千种蛋白质-蛋白质相互作用。该方法还可用于小分子-蛋白质、翻译后修饰及其他高通量检测。

摘要

使用含有约 4,200 种重组酵母蛋白的高密度功能蛋白微阵列，通过亲和纯化的酵母激酶融合蛋白检测激酶-蛋白相互作用，该融合蛋白带有 V5 表位标签用于信号检测。通过培养一种经过优化的高拷贝蛋白表达酵母菌株来获得纯化的激酶，该菌株携带一个质粒，其中包含受 GAL 诱导型启动子调控的激酶-V5 融合构建体。酵母在含有中性碳源的限制性培养基中培养 6 小时，随后用 2% 半乳糖诱导表达。接着收集菌体培养物，并采用标准的亲和层析技术纯化激酶，以获得高纯度的蛋白激酶用于后续检测。将纯化的激酶用激酶缓冲液稀释至适合检测的浓度范围，并在与蛋白微阵列杂交前对微阵列进行封闭处理。杂交完成后，使用单克隆 V5 抗体对微阵列进行探针孵育，以鉴定被激酶-V5 蛋白结合的靶蛋白。最后，利用标准的微阵列扫描仪对芯片进行扫描，并提取数据进行下游生物信息学分析1,2，以确定一组高置信度的蛋白相互作用，用于后续的体内验证 in vivo。

引言

进行蛋白质生物化学与结合活性的全局分析的需求 体内 已推动了用于分析蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）及全蛋白质组翻译后修饰的新方法的发展1,3-8蛋白质微阵列使用全长功能蛋白制备成功能性蛋白质微阵列4-6,8,9或含有抗体的分析型蛋白质微阵列10,11它们被设计为在显微镜载玻片上以高密度排列蛋白质，载玻片表面具有多种化学修饰，以适应广泛生化分析所需的各类实验条件。12硝酸纤维素和醛基表面化学法，用于通过赖氨酸进行化学偶联，或采用亲和偶联方法（如用于偶联带组氨酸标签蛋白的镍螯合载片，以及用于亲和偶联的谷胱甘肽）等其他方法13.

利用功能蛋白微阵列检测蛋白质-蛋白质相互作用需要获得高质量的功能蛋白文库14。S. cerevisiae 可通过高拷贝数的亲和标签蛋白构建体与高通量色谱纯化技术相结合，适用于构建此类文库。酵母基因组的绝大部分已被测序，几乎整个蛋白质组均可通过高拷贝质粒进行表达，用于纯化及生化分析12。一旦获得蛋白质并以384孔板格式排列，即可将其点样至显微镜载玻片上，从而实现快速、并行、多参数的生化分析以及生物信息学解析8,14-16。蛋白微阵列已被广泛应用于酶学检测，以及蛋白质、脂类、小分子和核酸等多种分子间的相互作用研究。蛋白质组微阵列表面的蛋白质具有良好的可及性，适用于多种分析检测方法，包括免疫亲和检测、表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance）、荧光检测及其他多种技术。此外，该方法还可实现对实验条件的精细调控，而这些调控在体内（in vivo）实验中往往难以实现。

本实验方案的目的是展示如何正确使用功能蛋白微阵列来检测蛋白质-蛋白质相互作用。该应用能够利用高度纯化的目标分析物（蛋白质）对蛋白质结合活性进行高通量平行生化分析。目标C端（羧基端）带有V5标签的融合诱饵蛋白通过高拷贝质粒在一种优化用于蛋白质纯化的酵母菌株中表达。C端标记可确保全长蛋白已被翻译。本研究中使用的蛋白为Tda1-V5融合蛋白激酶，通过His6X标签利用镍亲和树脂进行纯化。Tda1-V5融合蛋白通过咪唑梯度进行连续洗脱，以获得高度富集的组分用于后续检测。

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方案

1. 探针制备

  1. 培养并纯化用于检测与其他蛋白质相互作用的V5融合激酶探针，步骤如下：
    1. 使用新鲜划线的酵母菌株 Y258 (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112)，该菌株含有 V5 融合蛋白（由 GATEWAY 载体 pYES-DEST52 表达）。将分离的蛋白用作微阵列的探针。将酵母接种于合成完全型-尿嘧啶（Sc-Ura）/2%葡萄糖/琼脂平板上，在 30 °C 培养。 从冷冻培养物（-80 °C 甘油菌种）复苏培养3天。
    2. 从单菌落接种起始培养物（5–20 ml），在Sc-Ura/2%葡萄糖培养基中，于30 °C在摇床（220–250 rpm）或旋转仪上过夜培养。
    3. 次日早晨，接种400 ml Sc-Ura/2% 棉子糖培养液中加入足量的起始培养物，使终末OD600 0.1 的
    4. 将接种物培养至OD600 0.6，随后通过加入3x溶液进行半乳糖诱导，表达V5-激酶融合构建体 添加足量的6%半乳糖至酵母提取物/蛋白胨（YEP）培养基中，使诱导培养基稀释3倍，最终半乳糖浓度为2%。
    5. 在30 °C条件下诱导细胞6小时 在摇床上。使用 2 L 锥形瓶，以确保适当的通气。
    6. 使用JA-10（或相当型号）转子离心400 ml收集细胞 在4 °C下以1,000 × g离心5分钟，收集细胞悬液。
    7. 用50 ml洗涤细胞一次 冰冷的PBS缓冲液 并转移至 50 ml 锥形管。用冰预冷的裂解用PBS缓冲液（不含去污剂或其他添加剂）再次洗涤沉淀，转移至2 ml 用于裂解的带盖离心管
    8. 在 4 °C 条件下以 20,000 x g 离心 1 分钟，使细胞沉淀，用移液器吸除上清缓冲液。
    9. 将试管置于冰上，并进行裂解步骤。
    10. 使用0.5 mm氧化锆珠，在细胞沉淀、珠子与磷酸盐缓冲液（PBS）裂解缓冲液按1:1:1体积混合的条件下裂解细胞（250–350 µl沉淀），并在4 °C下使用振荡平台以2分钟间隔涡旋振荡混合物3次。
    11. 在4 °C条件下，使用台式微量离心机以20,000 x g离心裂解液10分钟。
    12. 将上清液用移液器转移至聚碳酸酯高速离心管中，在4 °C、150,000 × g条件下超速离心30分钟以澄清。
    13. 将澄清的裂解液转移至含有预洗涤Ni的离心管中2+ 亲和树脂（约100 µl），在旋转摇床中孵育2小时 在 4 °C 下孵育以捕获带有六次组氨酸（His）标签的 V5 融合蛋白。
    14. 用10分钟时间洗涤树脂三次 在 4 °C 下用洗涤缓冲液洗涤。使用台式离心机在 4 °C、1,000 × g 条件下离心 5 分钟，使树脂沉淀，然后吸去上清液。每次洗涤均加入新鲜洗涤缓冲液，并将离心管放回旋转混合仪中进行洗涤时的振荡。
    15. 洗涤步骤完成后，将洗涤后的树脂上样至新的G-25柱中进行洗脱。
    16. 以100 mM咪唑开始，以50 mM为增量逐步增加至500 mM咪唑，共9个梯度，每个梯度加入25 µl洗脱缓冲液。
    17. 使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色分析收集的组分，以确定富集程度最高的组分用于后续检测，并加入甘油至终浓度30%，于-80 °C保存 直至用于检测。

2. 探测阵列

注意：在开始检测之前，请参见本节步骤 2.6 以配制抗体溶液。

  1. 为了检测相互作用，稀释V5-荧光染料偶联抗体（即 AlexaFluor 647 至 260 ng/ml 在探针缓冲液中充分振荡混匀。
    注意：在30分钟前配制此抗体溶液 使用前将试管置于振荡器或滚轴混合仪上，以确保抗体充分混合并形成均匀的悬浮液。
  2. 将V5融合蛋白探针稀释至5–500 μg/ml的浓度范围。
    注意：针对每种蛋白质-蛋白质相互作用检测，使用探针缓冲液进行优化。优化过程包括向探针缓冲液中添加更多探针。通常以10 µg/ml为起始浓度，根据信号强度相应调整。
  3. 从−20 °C冰箱中取出蛋白微阵列，使用前置于4 °C冰箱中平衡。
  4. 将封闭缓冲液直接加入含有蛋白质微阵列的载片架中，并用封口膜封住顶部以防止泄漏。在封闭缓冲液中封闭微阵列1小时。 在4 °C条件下，以50 rpm的转速振荡。
  5. 封闭后，将芯片转移至预冷至 4 °C 的湿盒中，并加入 90 μl 将稀释的探针直接加到芯片表面。用带凸起的盖片覆盖芯片，并在加湿的孵育盒中于4 °C静置孵育（不振荡）。 1.5 小时。
  6. 用探针缓冲液在三个50 ml容器中各清洗芯片3次，每次1分钟 锥形管。将玻片加入含有足量预冷探针缓冲液的锥形管中，确保缓冲液完全浸没玻片。让升举器垫片轻轻从蛋白质微阵列上滑落（切勿强行剥离，以免损伤阵列表面）。
  7. 在完成洗涤步骤（步骤 2.5）后，立即将抗体溶液直接加到芯片上，并如前所述覆盖带有凸起的盖玻片。将芯片置于湿化 chamber 中，4 °C 孵育 30 分钟。
  8. 重复之前的洗涤步骤（在探针缓冲液中洗涤3次，每次1分钟），并在50 ml离心管中离心 在室温下，于台式离心机中以800 × g离心5分钟。将芯片置于载片架中，避光空气干燥30分钟，随后在647 nm波长下扫描芯片。

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结果

使用标准芯片读取仪观察蛋白质-蛋白质相互作用活性，以Tda1-V5蛋白激酶融合构建体作为诱饵蛋白，针对包含约4,200种独特S. cerevisiae GST融合蛋白的酵母功能蛋白微阵列进行检测。通过Genepix软件进一步分析，发现多种不同强度的结合事件。信号强度呈梯度变化，该信号来源于与靶标（V5-激酶）结合的单克隆V5-荧光染料偶联抗体，据此评估结合亲和力。采用ProCat评分算法2，对每种被检测蛋白在两个独立蛋白微阵列上的重复检测结果（每种蛋白在芯片上点样两次）进行蛋白质-蛋白质相互作用的识别，随后确定评分阈值以判定观察到的相互作用。

通过比较两个芯片阵列，可获得4个技术重复（n = 4），可用于通过相关性分析（R）评估不同批次检测间的变异程度2每个蛋白质在芯片上的两个点的信号强度。利用预设的阈值，通过微阵列共鉴定出Tda1-V5诱饵蛋白与阵列上其他蛋白质之间的9个蛋白质-蛋白质相互作用。1此外，为了评估可能引起假阳性的表面干扰因素，相同的蛋白质被点样在芯片的不同位置作为对照。通过比较不同激...

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讨论

本方案最初使用85种独特的酵母蛋白激酶-V5融合蛋白，比较了不同且相关的酵母蛋白激酶家族之间的结合活性，从而在体内鉴定了新的激酶相互作用网络in vivo1。作为一种新兴的蛋白质组学分析技术，利用蛋白质微阵列进行高通量（HTP）筛选平台的开发，最初依赖于肽库以及真核和原核模式生物8,17；随后，该检测平台被应用于植物和人类等更高等的真核生物5,7。目前尚无商业化可获得的酵母蛋白质芯片，但已有多个资源可提供序列验证的cDNA文库

尽管该技术可能非常有效，但需要注意的是，该检测是在体外进行的 体外 和, 因此会产生假阳性结果。因此，优化检测条件并采用合理的过滤策略有助于获得有意义的数据。下一代蛋白质微阵列技术包含大量高度纯化的功能性蛋白质，可用于对多种生物体进行生化分析，包括 拟南芥，酿酒酵母，以及 智人.

新型蛋白质微阵列所具备的高度精密设计使其能够执行多种多样的生化分析。利...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）的资助支持。图1所示的实验由Joseph Fasolo博士完成。我们感谢Rui Chen博士提出的有益评论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
培养皿VWRNC-10747或同类产品
酵母提取物（Bacto yeast extract）Difco0217-17
蛋白胨（Bacto peptone）Difco0118-17
琼脂（Bacto agar）Difco0140-01
葡萄糖（Dextrose）SigmaD9434
棉子糖（Raffinose）SigmaR0514
半乳糖（Galactose）SigmaG0750
Sc-Ura 缺陷型培养基（Sc-Ura drop out media）MP Bio114410622
小型培养管VWR/Fisher
大型锥形瓶VWR/Fisher
JA-10 转子离心机
离心管（500 ml）
50 ml Falcon 管VWR/Fisher21008-951
PBS 片剂SigmaP4417
FastPrep 管（2 ml 螺口管）
FastPrep 仪器MP Biomedicals116004500
氧化锆珠（Zircon Beads）BioSpec11079105
Triton X-100SigmaP4417
DTTSigmaD9779
MgCl2SigmaM8266 
NaClSigmaS3014 
咪唑（Imidazole，pH = 7.4）SigmaI5513 
PMSFSigma93482
蛋白酶抑制剂混合物（无 EDTA）（Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free)）Roche11873580001
磷酸酶抑制剂混合物 1（Phosphatase inhibitor cocktail 1）sigmaP2850
牛血清白蛋白（BSA）SigmaA2153 
Tween-20SigmaP1379 
ATPSigmaA1852 
摇床培养箱（30 °C）
镍亲和树脂（Nickel Affinity Resin）Life TechnologiesR901-01
G25 柱GE life sciences27-5325-01 
旋转混合仪（Nutator）VWR/Fisher
SDS-PAGE 凝胶（NuPage）Life Technologies
考马斯亮蓝染色液（Coomassie Blue Stain）Life Technologies
单克隆 V5 抗体（Monoclonal V5 Antibody）Life TechnologiesR960-25
Alexa647 标记的单克隆 V5 抗体（Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody）Life Technologies451098
蛋白微阵列试剂盒（Protein Microarrays Kit）Life TechnologiesPAH0525013
Genepix 扫描仪Molecular Devices
Lifter SlipsThomas Scientifichttp://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/
裂解缓冲液：0.1% Triton X-100，0.5 mM DTT，
2 mM MgCl2，500 mM NaCl，50 mM 咪唑（pH 7.4），无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物 –，磷酸酶抑制剂混合物 1，1 mM PMSF  （使用前立即加入）		将试剂加入 1× PBS（0.01 M 磷酸盐缓冲液，0.0027 M 氯化钾，0.137 M 氯化钠；pH 7.4）中，配制所需体积的裂解液
封闭缓冲液：1% 牛血清白蛋白（BSA），0.1% Tween-20将试剂加入 1× PBS 中，配制所需体积的封闭缓冲液
探针缓冲液：2 mM MgCl2，0.5 mM DTT，0.05% Triton X-100，50 mM NaCl，500 μM ATP（用于激酶），1% BSA将试剂加入 1× PBS 中，配制所需体积的探针缓冲液
洗涤缓冲液：0.1% Triton X-100，500 mM NaCl，0.5 mM DTT，50 mM 咪唑（pH 7.4），2 mM MgCl2将试剂加入 1× PBS 中，配制所需体积的探针缓冲液
洗脱缓冲液：0.1% Triton X-100，0.5 mM DTT，2 mM MgCl2，500 mM NaCl，50 – 500 mM 咪唑（pH 7.4），无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物 –，磷酸酶抑制剂混合物 1，1 mM PMSF（使用前立即加入）开始实验前，需注意咪唑浓度梯度（50 – 500 mM），并为每个浓度分别配制洗脱缓冲液（建议以 50 mM 为间隔递增）。将试剂加入 1× PBS 中，配制所需体积的探针缓冲液
3× YEP + 6% 半乳糖：将 30 g 酵母提取物和 60 g 蛋白胨溶于 700 ml H₂O 中，高压灭菌。加入 300 ml 过滤除菌的 20% 半乳糖溶液（质量/体积比） 半乳糖不可高压灭菌

参考文献

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