基于开源软件的通用显微镜数据中荧光标记物高内涵单细胞定量分析工作流程

摘要

本文展示了一种灵活的信息学工作流程，可实现对荧光标记细胞的多重基于图像的分析。该工作流程可定量分析细胞核和细胞质标志物，并计算这些标志物在不同区室间的转位情况。文中提供了利用siRNA对细胞进行扰动的实验步骤，以及在96孔板体系中通过间接免疫荧光法可靠检测标志物的方法。

摘要

随着对贴壁培养的哺乳动物细胞行为调控机制研究的不断深入，单细胞分析技术正变得愈发重要。传统方法所提供的数据通常反映的是细胞群体中生物标志物的平均值，这类综合数据容易忽略反映生物系统异质性的亚群动态变化。因此，传统方法正逐渐被更先进的细胞检测技术所取代或补充，这些新技术能够结合高内涵显微镜进行分析。此类检测方法可产生大量荧光生物标志物的图像，借助配套的专用软件，实现对单个细胞的多参数测量。然而，许多此类设备较高的购置成本和过度专业化的特点，限制了其在广大科研人员中的普及应用。

本文描述了一种普遍适用的工作流程，用于从单个细胞的特定亚细胞区域中定量多种荧光标记的强度，适用于大多数荧光显微镜获取的图像。该工作流程的关键在于使用免费的 Cell Profiler 软件¹ ，以识别图像中的单个细胞，将其分割为定义的亚细胞区域，并输出针对这些区域的荧光标记强度值。从图像数据中提取单个细胞的强度值是本工作流程的核心目的，文中将以贴壁人源细胞中 G1 期检查点调控因子 siRNA 筛选的对照数据分析为例进行说明。然而，此处提供的工作流程也可应用于其他细胞扰动方式（例如，化合物筛选）以及基于荧光的其他细胞标记形式的数据分析，因此适用于广泛的研究实验室。

引言

本文介绍了一种利用免费软件Cell Profiler对贴壁细胞的荧光显微镜图像进行算法引导式分析的方法，以识别单个细胞及特定的亚细胞区域。该方法被称为图像分割，可通过量化每个细胞或亚细胞区域（即分割对象）中荧光标记的定位信号，实现对成像细胞的多参数分析。该工作流程为高内涵分析提供了基础，旨在为缺乏专用高内涵仪器或商业软件的研究实验室提供一种可进一步开发和修改的工具，用于开展多参数的单细胞分析。随本文提供的文件包括一组用于测试的相关原始图像数据、算法设置以及生成所述分析结果所需的辅助脚本。所提供的Cell Profiler算法设置已针对示例数据集进行了优化，讨论部分详细说明了在应用其他研究中的图像数据时可能需要进行的调整。

使用 Cell Profiler 提取定量数据后，不同实验室可能对如何利用原始数据中各个细胞的数值有不同的要求；此处展示了一种针对每项检测将门控应用于原始数据的方法。通过这些门控，数据被转化为响应的二元形式，从而能够可视化不同处理与门控所定义的响应细胞亚群之间的趋势关联。门控的设定基于对每项相关测量指标的适当阴性对照和阳性对照所获得的数据分布的观察。使用门控仅是管理基于细胞的原始测量数据的一种示例方法。此处还展示了将细胞核 DNA 强度测量值以其原始形式作为连续数值范围，与门控数据结合使用的方式。根据研究性质的不同，还应考虑其他管理图像分析数据的方法；已有文献报道了将细胞分配至亚群时替代门控的统计学方法²，以及对在大量参数基础上汇总高内涵数据策略的系统性比较研究³。

高内涵图像数据分析已广泛应用于药物反应、反向遗传学以及环境胁迫信号通路的细胞研究中^4–6。高内涵分析的优势在于，通过对荧光显微图像数据进行算法分析，可同时获取单个细胞的定量与空间参数信息⁷。通过这种方法，可对多个检测结果进行交叉比对，追踪实验条件下由检测定义的细胞亚群的差异性行为，并将形态学变量纳入分析考量。本文所讨论的策略与分析流程，与其他高内涵方法类似，均能够提供与单个细胞相对应的多重数据。高内涵方法适用于生成荧光显微图像的研究，可分析的数据范围广泛，既包括传统荧光显微镜低通量实验产生的数十幅图像，也包括自动化高内涵筛选平台产生的数千幅图像。

此处以示例数据说明该工作流程，其中分别通过核荧光标记强度或荧光报告蛋白的核/胞质转位来测量不同的检测指标。该工作流程具有灵活性，可根据不同研究者提出的具体科学问题，单独或联合使用上述检测方法。示例数据来源于一项RNA干扰（RNAi）实验（图1）。实验中使用小干扰RNA寡核苷酸（siRNA）在HCT116人结直肠癌细胞中敲低特定蛋白，从而引起两种细胞周期依赖性激酶（CDK）活性荧光报告系统的信号变化。通过抗体染色检测视网膜母细胞瘤蛋白在丝氨酸780位点（P-S780 RB1）上由CDK6介导的磷酸化水平。在同一细胞中，通过绿色荧光蛋白标记的CDK2活性报告蛋白（GFP-CDK2报告蛋白）的核/胞质分布比例来评估其活性：当CDK2无活性时，该报告蛋白定位于细胞核内；而当CDK2被激活后，报告蛋白则从细胞核转运至胞质⁸。此外，使用DNA嵌入染料双苯并咪唑（Bisbenzimide）对每个细胞的核DNA进行染色，用于识别细胞、界定图像中细胞核的边界，并通过DNA含量评估细胞所处的细胞周期阶段（图2）。

当细胞从细胞周期的G1期过渡到S期时，CDK6和CDK2的活性可被检测到⁵，且二者依次相继激活^9,10，因此在单个细胞中，预期这两种报告分子之间具有高度一致性。本示例所用的演示数据集分析了靶向CDK6、视网膜母细胞瘤蛋白（RB1）的siRNA以及一个非靶向阴性对照的效果（表1）。CDK6的敲低应导致P-S780 RB1表位减少，并引起细胞在细胞周期G1期的积聚。RB1的敲低则作为磷酸化-S780抗体特异性的试剂对照。实验采用经甲醛固定¹¹并进行荧光染色的HCT116组织培养细胞，通过荧光显微镜成像，并利用算法进行图像分析。所得的数值数据随后用于交叉比对报告分子，评估不同敲低状态的影响。

此类分析所产生的数据量可能非常庞大，给常规分析工具带来挑战。例如，单个细胞的数据量可能超过某些电子表格软件所能容纳的范围。为此提供了 Perl 脚本，可用于对数据进行简单、高度重复且需人工监督的处理，以辅助大规模数据集的分析。这些 Perl 脚本专为 Cell Profiler 生成的输出文件编写，适用于处理采用特定文件命名规则的图像文件（图3），并支持在分析中使用每个孔中可变数量的视野。通常有必要对单细胞检测数据进行设门处理，以追踪细胞亚群中的变化趋势⁵，此处展示了如何使用 Perl 脚本根据每种检测类型预先设定的门限对每个细胞进行标记。此外还提供了可选的 Perl 脚本，用于汇总各个孔（或实验条件）的数据结果，输出内容包括：处于设定门限内的细胞百分比以及原始检测评分的平均值。后一种更为均质化的数据呈现方式，适用于响应效应影响孔内全部或大多数细胞的情形。如上所述，当响应仅局限于细胞群体中的部分细胞时，相较于基于单细胞数据的设门分析，此类整体性评估所提供的信息较少。

所述实验流程的应用不仅限于siRNA干扰或文中描述的标记物检测。已有研究采用该方法，在组织培养实验中联合使用siRNA、化学抑制剂和辐射处理，以检测CDK6和CDK2活性以外的其他标志物⁵。

从概念上讲，该实验策略能够自动识别荧光显微镜图像中单个细胞内多种具有生物学意义的亚细胞区域。因此，该方法可提供定量、多重的数据，揭示出那些仅关注细胞群体而非单个细胞的技术可能遗漏的生物学信息。通过少量修改，本文所述的方法和分析流程可适用于任何基于荧光的检测输出和细胞生物学响应，适用于需要对DNA含量进行定量评估、对细胞核或细胞质荧光进行定量分析，或对这两者之间标志物的穿梭行为进行单独或多重检测的研究。随着期刊发表要求日益倾向于提交公开可获取的原始数据，获取并熟悉此类免费显微图像分析工具（如本文所述）也将直接引起希望重新分析已发表数据的实验室的浓厚兴趣。

方案

1. 反应标志物的实验扰动与细胞标记（反向转染siRNA筛选）

1. 在无菌细胞培养罩中，将70 µl含200 nM siRNA的1× siRNA缓冲液加入无菌空白96孔板的各孔中。将转染脂质稀释至40倍体积的无血清DMEM培养基中，并向含siRNA的各孔中加入105 µl。
   注意：将262.5 µl脂质稀释于10.5 ml无血清DMEM中，可制备适用于整块96孔板的主混合液，每孔提供2.6 µl脂质。本步骤使用200 nM siRNA起始浓度，将在步骤1.3中获得20 nM的工作浓度；但实验也可在低至5 nM的工作浓度下进行，相应调整起始浓度（即 50 nM）。较低的工作浓度可能减少脱靶假阳性信号，但也可能减弱靶向响应强度，从而增加靶向假阴性率。
2. 在室温下轻轻振荡混匀平板10分钟。将所得的175 µl混合液分装为每靶标三个50 µl重复样，转移至带有透明底的不透明、经组织培养处理的96孔板中。
3. 通过直接向每孔50 µl脂质-siRNA复合物上加入含10%血清的DMEM培养基中的8,000个细胞（体积为150 µl）进行反向转染。使用稳定表达GFP标记、用于报告CDK2活性的HCT116人结直肠癌细胞^5,8。无需进一步混匀。用无菌透气粘性膜密封平板以控制湿度并防止“边缘效应”，并将平板置于37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中孵育48小时。
4. 吸除培养基，使各孔中保留少量残留液体。通过向每孔加入100 µl 4%缓冲甲醛溶液固定细胞，并在室温下于通风橱中孵育10分钟。
5. 通过吸除方式移除固定液。此时可选择终止实验：用100 µl磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤平板三次，随后在4 °C避光条件下，以100 µl PBS密封保存，最多可保存一周；或继续进行细胞通透化处理。
   注意：建议在固定后尽快处理平板，通常更倾向于保存已完成全部处理的平板。可添加生物杀菌防腐剂（如硫柳汞、叠氮化钠或商用替代品）以防止微生物生长。添加磷酸酶抑制剂有助于保护磷酸化表位，在相关检测背景下，其他维持蛋白质修饰状态的方法也可能有益。
6. 移除平板中的PBS，并通过向每孔加入100 µl通透化溶液进行细胞通透化处理。室温下静置孵育10分钟，不摇动。使用多通道移液器吸除通透化溶液。重复此步骤三次。
7. 通过向每孔加入100 µl封闭液，在室温下封闭30分钟。通过吸除方式移除封闭液，然后在室温避光条件下，用50 µl以封闭液按500倍稀释的抗P-S780 RB1抗体探针孵育2小时。
8. 用100 µl洗板液洗涤平板三次，每次在板上停留5分钟。在4 °C避光条件下，用50 µl以封闭液按1,000倍稀释并添加2 µM染色质特异性DNA染料Hoechst（Bisbenzimide）的荧光标记二抗探针孵育过夜。按前述方法洗涤平板三次，并在4 °C避光条件下以100 µl PBS密封保存。在两周内完成成像。

2. 成像与图像分割

1. 使用配备 20X 物镜的共聚焦或转盘式荧光显微镜，分别采集对应于 DNA 染料、GFP 和免疫染色荧光染料的三个通道的 16 位灰度 TIFF 图像。采集大量无重叠的图像集（此处称为帧），以覆盖每孔约 1,000–2,000 个细胞。
2. 系统命名图像文件，使每个文件名按顺序唯一地包含“实验名称”、“孔位地址”、“帧编号”和“通道标识符” （图 3）。示例数据集使用“Blue”（染色质 DNA 染色）、“Green”（GFP）或“Red”（免疫染色荧光染料）作为通道标识符。孔位地址、帧编号和通道标识符在后文中统称为图像元数据。使用下划线符号以避免孔位和帧元数据之间产生混淆。
3. 按指定顺序命名文件中的这些元数据元素。这是确保后续软件步骤能够正确分组图像集以供分析的必要条件。
4. 下载并安装免费软件 Cell Profiler、Active Perl 社区版、R 统计编程环境和 RStudio。安装过程中接受所有默认选项；安装 Active Perl 的 PC 用户应在提示时启用与 PATH、文件扩展名关联和脚本映射相关的所有选项。Mac 用户可选择是否安装 Active Perl，否则需通过终端命令行运行第 3.2 步的 Perl 脚本，而非通过图标点击运行。
5. 打开 Cell Profiler 软件，点击“文件”、“导入流程”然后选择“从文件”，并选中文件 3_channels_pipeline.cppipe（图 S1A & S1B）。该文件包含必要的指令，使软件能够根据前述文件命名规则解析图像文件的元数据。Cell Profiler 现在将关联图像，从中提取细胞核 DNA 和抗体信号强度，并利用 GFP 通道计算每个被检测细胞的细胞核与细胞质信号强度比值（图 4 & 图 5）。
6. 点击 Cell Profiler 窗口左下角的“查看输出设置”按钮。在新窗口顶部，有标为“默认输入文件夹”和“默认输出文件夹”的文本框。依次点击这些文本框右侧的文件夹图标，分别选择待分析图像文件的存放位置以及提取数据的输出目标位置（图 S1C）。
7. 点击 Cell Profiler 窗口左下角的“分析图像”按钮，开始图像分析。在屏幕底部可查看剩余分析时间，以及“停止分析”和“暂停”按钮。如需暂停分析，可随时点击“暂停”按钮，这在观察正在分析的图像时尤为有用（见步骤 2.8 的说明）。
8. 可选：点击程序窗口最左侧面板中的眼睛图标，打开任意图像分析步骤的窗口（图 S1D）。观察“IdentifyPrimaryObjects”窗口以及“Secondary”和“Tertiary Objects”窗口，以检查 Cell Profiler 中当前用于图像分割的设置是否合适（参见 图 1 和讨论部分，获取修改这些设置的建议）。
9. 分析完成后，点击弹出消息框中的“确定”按钮。前往“默认输出文件夹”位置，所有结果数据文件将以逗号分隔值（.csv）格式保存（图 S2A）。

3. 数据提取

1. 找到新文件“细胞核.csv ”，该文件包含来自Cell Profiler输出的单个细胞数据，如荧光核抗体强度、核DNA强度以及GFP-CDK2报告基因比值图6A & S2A).
   注意：不同的实验室可根据各自检测方法的特点对本类数据进行相应处理。建议根据抗体数据和GFP-CDK2报告基因值，使用所提供的Perl脚本对各处理条件下的细胞进行设门分析2_gate_classifier.pl.
2. 复制提供的 Perl 脚本文件‘2_gate_classifier.pl 与‘相同的文件夹中细胞核.csv’ 数据文件（图S2A）。双击 Perl 脚本的图标，当系统提示时，输入数据文件的完整文件名，接着输入用于保存待设门细胞数据的文件名（需以“.csv”为扩展名），最后输入抗体荧光和 GFP-CDK2 报告基因数据的设门阈值。
   注意：如何主要确定门控设置并将其应用于数据分析，将在下文的代表性数据部分进行讨论。 图6 （分析所提供数据时，请分别使用“0.004”和“1.5”）。Mac 用户应通过终端命令行输入“perl 2_gate_classifier.pl”来运行 Perl 脚本。
3. 观察新创建的文件，该文件将来自原始 Cell Profiler 数据的单个细胞检测原始值与亚群标签合并，显示了每个孔中每个细胞在两个门控条件下的表现情况图6C).
4. 使用 RStudio 软件打开提供的数据文件，通过“文件”菜单选择“打开文件”，然后选择所提供的“，利用各个实验条件下单个细胞亚群标签绘制数据图分析.r’ 文件。观察绘图命令 图6B, 7 和 8 在 RStudio 的左上窗口中图S2B）。在左上角窗口中，于第5行和第6行的双引号符号之间，输入包含门控数据文件夹的计算机地址。分别包含驱动器字母以及文件本身的名称（例如，“C:/analysis folder/analysis output”和“nuclei_gated.csv”).
   注意：如果在某台计算机上首次使用 RStudio，则需要先安装 R 的图形包“ggplot2”。此步骤仅在新安装 RStudio 后执行一次，之后无需重复。要安装“ggplot2”，请单击 RStudio 右下角窗口上方的“Packages”选项卡，然后单击其下方出现的“Install Packages”按钮。此时将弹出一个新窗口，在该窗口的“Packages”输入框中键入 ggplot2（无需输入引号），最后单击“Install”按钮以关闭窗口、安装所需的 ggplot2 功能，并返回主 RStudio 窗口继续执行步骤 3.6。
5. 在 RStudio 左上方窗口中高亮第 1 至 17 行，然后点击“Run”按钮。这将把实验数据、阈值以及孔位信息输入到 R 中图 S2CR 现在将临时保存用于绘图的相关数据。
6. 在第17行下方，高亮显示剩余代码的各个代码块，并像之前一样通过点击“Run”按钮生成相应的图表。在RStudio右下角的窗口中观察图表，并通过点击“Export”按钮以多种格式保存图表图 S2D).
7. 关闭 RStudio 时，当系统提示保存，点击“不保存”。这可以避免下次使用 RStudio 时产生混淆，否则其会保留上一次会话的数据。

结果

使用反向转染siRNA筛选方案生成的示例图像集已制备完成，并通过Cell Profiler软件进行分析。所得的原始数值数据可对每个细胞进行单独表示，能够追溯至其来源图像和孔位，并测量多个荧光强度参数（图6A）。对于每个被识别的细胞，均测定其RB1（P-S780）抗体的平均核荧光强度，以及由DNA染料定义的核掩膜的总DNA荧光强度。同时记录每个细胞核与细胞质区域的平均GFP强度值，从而可计算GFP-CDK2报告分子的核内与细胞质荧光比值。在这些算法测定的荧光强度数据基础上，利用单个细胞数据为两种检测（核抗体染色和GFP-CDK2报告系统）设定分群门控。随后根据检测结果对细胞进行标注，并利用这些标签对特定细胞亚群通过第三项测量指标（核DNA含量）进行进一步表征。

每种检测所获得的原始荧光强度数据的直方图是评估不同条件下细胞亚群行为的有效方法。图6B中的直方图显示了在每种RNAi敲低条件下，来自三个重复孔的单个细胞数据的群体分布。左侧为细胞核抗体强度数据，右侧为相应的GFP-CDK2报告基因数据。P-S780 RB1抗体数据显示，就该翻译后修饰而言，细胞总体上可分为两个群体，其中S780位点RB1磷酸化缺失的细胞群体表现为核强度左移的峰，该峰在CDK6被siRNA敲低时更为显著。当RB1本身作为RNAi靶点时，同样观察到该左移峰，反映了RB1蛋白的完全去除，从而导致P-S780 RB1染色消失。相比之下，在相同实验条件下通过GFP-CDK2报告基因检测观察相同细胞时，单细胞数据呈现出不同的动态变化。此时观察到的是一个连续分布，仅有一个主峰，而干扰细胞周期（siCDK6）并导致细胞在G1期积累的siRNA则引起该分布右肩的延伸（即表明X轴所绘制的核/胞质GFP比值升高的细胞比例增加）。

在图6B的直方图中还显示了基于两组检测数据分布所选定的门控值（垂直条）。对于P-S780 RB1抗体数据，所采用的规则是：在考虑阴性对照细胞数据（非靶向siRNA）时，将门控位置定义为主峰（右侧峰）左侧肩部半高最宽处的位置。以红色突出显示的数据代表P-S780 RB1水平降低或缺失的细胞，这些细胞通过该门控被识别。对于GFP-CDK2报告分子，则在比值分布的对侧肩部设置类似的门控，由此识别出CDK2活性缺失或降低的高比值亚群细胞，以绿色显示。为了说明两项检测的多重分析方法，图6C展示了使用2_gate_classifier.pl Perl脚本同时应用两个门控值，将原始数据（图6A）转换为下方的注释文件。该新文件包含原始数据，以及为每个细胞新增的分类标签列和用于区分细胞类群的两个门控值（本例中，抗体数据的门控值为0.004，GFP-CDK2报告分子的门控值为1.5）。

基于两种检测方法对每种敲低条件下的单个细胞进行分类后，现在可以利用这些分类标签来辅助注释检测数据的图示。图7展示了示例数据集中三种RNAi条件下P-S780 RB1和GFP-CDK2检测的单细胞数据散点图。散点图中各象限标注的数字表示在相应敲低背景下，各门控亚群占总体的相对百分比，这些数据是使用上述分类标签在R中生成的。这些图显示，与转染非靶向siRNA的细胞相比（图7B），转染siCDK6的细胞在Y轴方向上的数据分布整体下移（表明RB1在丝氨酸780位点的磷酸化缺失），同时在X轴方向上向右偏移（表明CDK2活性降低，图7C）。这两种偏移均符合对该靶基因敲低的预期结果。与此相反，转染siRB1的细胞数据（图7A）显示抗体染色信号消失，与表位丢失一致，但在CDK2报告系统中的数据分布与转染非靶向siRNA的对照组相比变化不大，提示RB1敲低对GFP-CDK2报告系统无明显影响。

为了进一步探讨单细胞数据的应用，亚群分类与多重检测方法如图8所示，该图展示了来自图7C的siCDK6数据的散点图，以及基于整合DNA强度的配对直方图。这些直方图对对应于整个细胞群体的两个相对半区，分别根据抗体信号强度（散点图右侧）或GFP-CDK2报告基因比值（散点图上方）进行划分。对这些群体的核DNA强度进行定量分析，显示出两个特征性峰，分别对应于2N和4N的DNA含量，表现为左峰和右峰。如图6、图7和图8中所示门控策略的设计意图是：被识别为P-S780 RB1低表达（标记为：P-S780-）或GFP-CDK2报告基因比值高（标记为：G1）的细胞应处于细胞周期的G1期。事实上，通过任一检测方法所鉴定出的这些亚群的DNA谱直方图主要包含具有2N DNA含量的细胞。而相对门控群体（标记为：P-S780+ 或 Non-G1）的DNA谱则显示细胞分布从2N到4N不等，符合这些细胞处于G1期之后不同细胞周期阶段的特征。

尽管本文的重点是荧光染色图像中单个细胞数据的生成与分析，但同样重要的是能够利用这些数据，以孔为单位对每个实验进行汇总，从而监测重复样本之间的变异性，以及在整个板数据中各个孔的实验表现。图9展示了每种siRNA处理的数据，分别以三复孔的平均值形式汇总，表示位于设门范围内的细胞百分比：应用于A) P-S780 RB1 数据和B) GFP-CDK2 报告基因数据。图中A和B所示数值由本论文提供的两个额外Perl脚本生成，分别为“antibody_fluorescence_summary.pl”和“G1assay_summary.pl”。这些脚本使用Cell Profiler生成的原始数据（Nuclei.csv），输出每孔的数据，包括：i) 每孔检测到的总细胞数，ii) 位于设门范围内的细胞数量，iii) 设门内细胞的百分比，以及iv) 该孔测量原始数据的算术平均值。该方法可作为分析大规模实验数据集的一种可选策略，在聚焦于单个细胞数据的多重评估之前使用，如图7和图8所示。此处展示的图表针对两个实验均绘制了“iii) 设门内细胞百分比”，以适应图6B直方图中P-S780 RB1和GFP-CDK2数据所呈现的非正态分布特征。这些脚本还计算“iv) 该孔测量原始数据的算术平均值”，适用于在实验干预前后对均质细胞群体反应及正态分布数据的分析。

图1：定量分析荧光标记显微镜图像数据工作流程的步骤概览。 此工作流程分为四个步骤。(A) 首先需要对细胞进行实验性准备以进行荧光成像。此处描述的示例为一项筛选实验，其中经siRNA处理的贴壁人肿瘤细胞在96孔组织培养板上培养48小时，随后固定并染色。不同RNAi条件在板内不同孔中设置三个重复。细胞使用DNA染料染色，并用针对RB1蛋白在CDK4和CDK6特异性靶位点丝氨酸-780（P-S780 RB1）发生磷酸化的特异性抗体进行免疫染色，同时这些细胞稳定表达GFP-CDK2报告蛋白，用于报告G1期细胞周期退出。这些荧光探针共同构成了在工作流程中分别评估的两个检测指标。(B) 为每种荧光探针（通道）生成并命名平行的显微镜图像，命名方式需包含图像分析软件可据此组织数据的详细信息。(C) 将图像文件导入Cell Profiler软件，该软件通过算法识别单个细胞及其对应的细胞核与细胞质区域，并输出每个细胞中三种荧光探针的强度测量值。(D) 最后，使用Perl脚本对生成的原始定量数据进行整理。此步骤对每个细胞的荧光强度数据应用门控策略，有效地将细胞划分为不同的亚群，以便作图、追踪和交叉分析。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：通过图像分析获得的实验数据。 来自示例数据集的经固定、siRNA处理并荧光标记的细胞被成像，并对每个细胞进行相应的强度测量。图中展示了图像分析过程中记录的每个参数的代表性图像数据。(A) 细胞核DNA强度：细胞核DNA染料染色强度用于反映每个细胞核中的DNA含量。(B) 磷酸化RB1的细胞核强度：使用特异性识别P-S780位点RB1的一抗（黑色）和荧光标记的二抗（红色）进行免疫染色，从而实现对每个细胞核中RB1在S780位点磷酸化水平的强度测量。(C) GFP-CDK2报告蛋白：所用细胞稳定表达一种GFP标记的报告蛋白，该蛋白在细胞周期中以特定模式在细胞核与细胞质之间转位。对每个细胞的细胞核和细胞质GFP强度进行双重测量，可计算出每个细胞的比值，用于区分G1期与其他细胞周期阶段。本实验将使用三种siRNA靶标来说明分析过程：非靶向阴性对照siRNA；作为阳性对照的CDK6 siRNA，用于干扰RB1磷酸化及细胞周期进程；RB1 siRNA，用于验证抗体特异性。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：图像分析前图像文件的组织方式。 从组织培养板中获取的图像采用系统化的命名方式，以便图像分析软件能够将图像数据与原始实验条件相关联。该信息被嵌入每幅图像的文件名中。（A） 由于实验板上的每个孔可能对应不同的RNAi靶点或处理条件，因此孔的位置编号构成文件名的一部分。（B） 每个孔会采集多个不重叠的视野图像，因此文件名中也包含视野编号。（C） 每个视野中的荧光探针是分别成像的，因此文件名还需反映每幅图像所对应的通道。（D） 示例文件名，对应于孔（G12）、视野（2），每幅图像代表一个通道（蓝色、红色、绿色）。虚线将文件名中的各元素与孔、视野和通道的相应示意图连接起来。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：使用Cell Profiler测量细胞核DNA和抗体染色。 使用所提供的流程文件（3_channels_pipeline.cppipe）中的设置，Cell Profiler图像分析软件可测量与单个细胞相关的核DNA和抗体结合的荧光强度值。(A) 在DNA染色的“蓝色”通道图像中识别细胞核。(B) DNA染色细胞核的位置被临时保存在“细胞核掩膜”中。随后，该细胞核掩膜被叠加到(C) 蓝色和红色通道图像（分别为DNA和抗体荧光数据）上，并记录与掩膜重叠的图像区域的荧光值，对应于每个已识别的细胞。可通过观察细胞核掩膜的形态，直观评估相邻细胞核是否被成功独立识别。作为示例，在该掩膜图像中用圆圈标出的部分显示了算法设置选择不当，将相邻的细胞核错误识别为单个细胞核的情况。在讨论部分将介绍如何调整算法设置以最小化此类事件的发生。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：使用Cell Profiler测量细胞核和细胞质中GFP的强度。 GFP标记的CDK2报告分子会根据细胞所处的细胞周期阶段在细胞核与细胞质之间发生转位。在Cell Profiler计算每个细胞的DNA和抗体标记的细胞核强度的同时（图4），它还计算每个细胞中GFP信号在细胞核与细胞质之间的比值。(A) 每幅图像的DNA染料数据被用于生成细胞核掩模。(B) Cell Profiler将细胞核掩模与GFP-CDK2报告分子的GFP图像结合，以确定每个细胞的位置，并向外扩展至细胞边缘，从而估算每个细胞的整体轮廓，形成一个新的“细胞掩模”。(C) 将细胞核掩模从细胞掩模中扣除，得到一系列环形（类似甜甜圈）的细胞质轮廓，即“细胞质掩模”。(D) Cell Profiler利用细胞核掩模和细胞质掩模测量每对细胞核与细胞质的GFP信号值。这些成对的数值随后被用于计算比值，从而判断每个细胞所处的细胞周期阶段。请点击此处查看该图的放大版本。

图 6：数据提取——通过对检测值设置门控处理原始单细胞数据。 从抗体染色和 GFP-CDK2 报告基因检测的单细胞数据中提取生物学趋势时，采用门控数据进行分析。原始数据的直方图有助于确定合适的门控阈值，随后通过 Perl 脚本施加这些门控。（A） 使用提供的设置通过 Cell Profiler 分析图像文件后，最终输出为逗号分隔值（.csv）文件。这些文件包含与各个亚细胞区域相关的单细胞数据。“Nuclei.csv” 文件包含所有与细胞核掩膜（Nuclei mask）相关的选定测量值，包括细胞核抗体强度、细胞核 DNA 强度以及 GFP 比值（细胞核/细胞质）。（B） 基于每种 siRNA 敲低条件下的单细胞数据，绘制的细胞核抗体强度（左）和 GFP-CDK2 报告基因比值（右）直方图。图中直方图上的条形表示这两种检测所设定的门控位置，直方图中着色的数据代表被圈选的亚群。（C） 图 B 中所示的两个检测门控通过 Perl 脚本“2_gate_classifier.pl” 应用于原始数据。该脚本创建原始 Cell Profiler 输出文件（Nuclei.csv） 的修改副本，以辅助后续作图。两个门控值被记录在新文件中（此处以颜色高亮显示），并新增一列“Label”（标签）。该标签根据每个细胞的两项门控检测值，将每个细胞归类至四个可能的亚组之一。这些标签用于后续图表中，用于计算各亚群的贡献比例，并与 Cell Profiler 生成的其他参数进行交叉引用。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：每种siRNA处理条件下显示单个细胞原始数据及门控位置的散点图。 来自所有图像的单个细胞数据的散点图，对应于所示的siRNA处理条件：(A) siRB1；(B) 非靶向阴性对照siRNA；(C) siCDK6。Y轴表示抗P-S780 RB1染色的细胞核荧光值，X轴表示由GFP-CDK2报告基因计算得到的相应比值。红色和绿色条分别表示P-S780 RB1门控和GFP-CDK2报告基因门控的位置。这两个门将细胞分为四个亚群，各象限上方的数字表示来自每个亚群的细胞百分比。A图坐标轴周围的注释表示由Perl脚本2_gate_classifier.pl赋予每个细胞的四种可能的标签元素。这些标签与其相应的检测门相关联，并在R脚本（analysis.r）中用于生成图6、图7和图8中的图表。请点击此处查看该图的放大版本。

图8：由两种G1期通过检测定义的细胞亚群显示出与检测结果一致的2N和4N DNA图谱。 siCDK6细胞的数据散点图重复自图7C。散点图周围是与细胞群体亚群相关的核DNA总强度直方图。位于散点图上方的直方图对应于GFP-CDK2报告基因检测，位于散点图右侧的直方图仅对应于核内磷酸化RB1抗体的检测结果。彩色门控线被延伸以显示其与直方图的对应关系。用于选择这些附加图谱数据的细胞门控标签也一并标出。在丝氨酸780位点失去RB1磷酸化（P-S780-）的细胞，或具有较高核内/胞质GFP-CDK2报告基因比值（表明CDK2活性较低）的细胞，主要呈现类似2N的DNA图谱；而每种检测中相反的细胞亚群则表现出2N和4N的混合分布，这是处于G1期之后、处于混合细胞周期阶段的细胞群体的典型特征。请点击此处查看该图的放大版本。

图9：每种siRNA条件下门控实验值的汇总图。 每种siRNA敲低条件下，三个重复孔中门控（A）P-S780 RB1数据和（B）GFP-CDK2数据的汇总图。数值由Cell Profiler原始输出文件（Nuclei.csv）通过Perl脚本“antibody_fluorescence_summary.pl”（A）或“G1assay_summary.pl”（B）计算获得。图中数值为每项实验设定门控范围内细胞百分比的平均值，误差线表示三个重复孔计算所得的标准误。将每种敲低条件与非靶向siRNA进行比较，采用非配对、方差齐性t检验计算P值，并在图中数据上方标出，其中P < 0.001（**），P < 0.05（*）。请点击此处查看该图的放大版本。

图S1. 设置Cell Profiler软件进行图像分析。（A） 尚未输入任何图像分析设置前的Cell Profiler界面截图。（B） 加载了“3_channels_pipeline.cppipe”中包含的算法细节后的Cell Profiler界面截图。左上角高亮的标签页表明此界面显示的是分析流程中“LoadImages”步骤的参数。点击下方列表中的其他部分，可查看分析后续步骤的详细信息。（C） 已输入输入文件夹和输出文件夹信息的Cell Profiler界面截图。（D） 点击“Analyze images”按钮开始分析后的Cell Profiler界面截图。叠加显示了三个新窗口，展示软件从正在分析的图像中自动生成的算法掩膜。这些窗口可通过点击主Cell Profiler窗口左上角分析步骤旁的“眼睛”图标打开。这些视图有助于用户验证生成五彩纸屑状掩膜的设置是否与对应的原始灰度图像数据一致。

图S2. 使用Perl和RStudio对单个细胞数据进行门控分析并绘制所得细胞亚群。（A） 右侧面板显示了用于接收 Cell Profiler 分析输出的 .csv 文件的文件夹（绿色图标）。随稿件提供的 Perl 脚本（蓝色图标）被复制到该文件夹中。高亮显示的是“2_gate_classifier.plPerl 脚本，已通过鼠标双击以生成左侧面板中的对话框。图中显示了从“细胞核.csv’ 文件。 （B） RStudio 加载“analysis.R’ 脚本。突出显示的是从门控数据上传的命令 A 在绘图之前将数据导入软件（注意：第5行和第6行中的细节需根据分析所用计算机上设门数据的实际存储位置进行调整）。 (C) RStudio 上传数据后的截图 （D） RStudio 截图，高亮显示了用于生成右下窗口中所示图形的代码块。每幅图的代码通过空行分隔，并按图形类型分组。

siRNA 靶点	孔板孔位地址
非靶向 (NT)	E5, F5, G5
视网膜母细胞瘤基因 (RB)	E7, F7, G7
细胞周期蛋白依赖性激酶 6 (CDK6)	B2, C2, D2

表1：示例数据集中使用的孔位地址及对应的siRNA处理条件。

讨论

本文所述工作流程是一种利用siRNA对细胞进行多孔板扰动，随后进行标志物检测，并最终通过一系列软件支持的步骤，从获得的荧光显微图像中提取定量数据的方法。该方法侧重于获取单个细胞的细胞核和细胞质强度值，在多种基于细胞的应用中具有广泛的实用价值。此处使用的示例数据来自一项siRNA筛选实验，其中测试了两种针对G1期细胞周期进程的荧光检测方法，并将其结果与核DNA含量的更直接的生物物理测量结果进行关联分析。

使用荧光DNA染料对细胞核DNA进行成像，是图像分割过程中不可或缺的步骤，因为它能够识别单个细胞，所生成的“细胞核掩膜”可作为识别相应细胞质区域的起点。细胞中稳定表达的GFP标记CDK2报告分子，在细胞质中产生强度可变但始终高于背景信号的荧光，从而可清晰界定该区室。相同的分析流程也可适用于利用其他合适的荧光标记报告分子研究蛋白质转位事件及其对扰动的响应。此外，若将GFP-CDK2报告分子替换为特异性标记细胞质的荧光染料，则可另辟途径利用该算法测量图像中细胞质的尺寸以及细胞之间的相对大小。

此处所述图像分割策略中的另一个设计考虑是使用 Cell Profiler 获取用于DNA定量的积分强度值。对细胞核DNA染色数据的强度值进行积分，可兼容细胞核大小的可能差异，并且与碘化丙啶染色的FACS数据中观察到的定量特征高度一致。然而，在评估蛋白质功能时，积分强度可能并非合适的方法，因为相较于细胞区域内蛋白质（及其相关荧光）的总积分量，平均浓度（以抗原荧光的平均强度为例）在生物学上更具相关性。因此，对于P-S780 RB1和GFP数据，采用的是平均强度值。在Cell Profiler软件的“ExportToSpreadsheet”面板中，可选择在两种数据评估模式（平均或积分）之间进行切换。

文件 3_channels_pipeline.cppipe 中的分析设置已针对示例数据集中的图像进行了优化。使用本方案分析新的图像数据集时，文件名需采用上述命名约定（图3）。此外，可能需要在 Cell Profiler 设置中调整适用于新图像数据集中核DNA染色亮度的灵敏度值以及背景强度的阈值。鉴于DNA染色在构建各类图像分割掩膜中的关键作用，为该通道设置正确的灵敏度参数，是利用Cell Profiler软件成功分析新图像数据的关键。所提供的Cell Profiler设置文件（3_channels_pipeline.cppipe）中包含了最常用参数的注释，用于指导如何将分析流程适配至新数据。这些注释位于Cell Profiler主窗口屏幕顶部的文本框中，包括如何更改灵敏度设置以及调整待分析通道数量的指导说明。如方案第2.8节所述，为测试新图像数据的设置，可能需要通过点击“Identify…Objects”各步骤旁的“眼睛”图标来查看图像分割过程（图S1D）。特别是通过“IdentifyPrimaryObjects”进行图像数据可视化时，可判断DNA染色图像中的细胞核掩膜是否被正确识别。在Cell Profiler软件的“IdentifyPrimaryObjects”模块页面中，包含一个阈值校正因子。通过反复试验调整该值，可解决大多数细胞核识别错误问题。该值用于平衡每幅图像中DNA通道信号与背景强度的关系。阈值校正因子通常以1为基准：大于1表示更严格（适用于清晰图像），小于1则表示更宽松（适用于染色与背景对比度较低的图像）。

Cell Profiler 输出的单细胞原始数据可根据其他研究的需求以多种方式进行分析。此处展示的是使用 Perl 脚本对每个细胞测量的两个参数施加门控，以帮助从数据中提取生物学趋势，并允许将鉴定出的亚群与额外的测量结果进行交叉比对。尽管同样可以在 Cell Profiler 框架内实现门控功能，但此处采用的替代方法在处理大规模数据集时提供了更高的灵活性和速度。当前方案在图像采集后的最慢步骤是运行 Cell Profiler 软件。此处运行 Cell Profiler 时不设置门控，以生成未门控的原始数据集，随后可通过 Perl 脚本更快地重新分析，并在需要时使用不同的门控值进行迭代分析。并非所有研究都能预先确定合适的门控值，因为门控值可能随不同试剂或数据集而变化，甚至可能随时间变化。因此，建议生成直方图，展示来自 Cell Profiler 的阳性对照和模拟扰动细胞的原始数据分布，以确定感兴趣参数的合适门控值。

Perl 脚本被编写为接受来自 Cell Profiler 的严格定义的列结构数据，如果用户通过“ExportToSpreadsheet”设置修改了 Cell Profiler 输出的参数数量，脚本可能会停止工作。为了帮助实施设置的修改，Perl 脚本文件中包含了相关说明。要查看这些说明，请在文本编辑器中打开脚本，建议使用支持对 Perl 元素进行语法高亮的编程专用文本编辑器例如，http://www.activestate.com/komodo-edit）。这些注释指明了在数据格式发生变化时应调整脚本的位置。与提供的 Perl 脚本类似，所提供的 R 代码文件（analysis.r)，包含根据图像分析数据绘制图表的操作说明，可用文本编辑器或 RStudio 软件打开，以查看有关使用和修改的附加说明。这些说明可结合正则表达式和 Perl 的详细信息进行补充¹² 以及 ggplot2¹³ 用于R的软件包，二者分别构成数据读取、注释和绘图的基础。

利用荧光显微镜开展的新研究，以及随开源出版物一同发布的原始数据，均适用于本文所述的分析方法。高内涵数据本身的特性决定了其适合进行递归分析，不同研究者可根据各自的研究兴趣，侧重不同的分析方向。尽管对数据所能提出的问题受限于最初使用的探针，但图像数据通常能够被有意义地重新分析，其应用范围往往可超越原始研究的范畴。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AllStars 阴性对照 siRNA	Qiagen	1027280	阴性对照 siRNA。
CDK6 siRNA	Dharmacon/定制合成	NA	反义序列：5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU
RB1 siRNA	Dharmacon/定制合成	NA	反义序列：5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT
5x siRNA 缓冲液	Thermo Scientific	B-002000-UB-100	需用无核酸酶、未经 DEPC 处理的水稀释。
无核酸酶水（非 DEPC 处理）	Applied Biosystems	AM9937	用于稀释 siRNA 缓冲液。
Hiperfect	Qiagen	301705	转染脂质试剂。
DMEM	Life Technologies	41966052	含丙酮酸和高葡萄糖的组织培养基。
96 孔组织培养板	Falcon	3072	普通 96 孔组织培养板，用于平行、分隔式混合转染复合物。
Packard Viewplate	Perkin Elmer LAS	6005182	带光学底的 96 孔组织培养板，用于细胞转染、培养、固定及最终成像。配有不透明粘性板封膜，用于使用后板的储存。
透气膜	Alpha Labs	LW2783	无菌、透气、带粘性的膜。
10% 中性缓冲福尔马林	Sigma-Aldrich	HT5012-1CS	10% 福尔马林（4% 甲醛），在实验方案中直接使用。
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100PC	非离子型去垢剂
[header]
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Trizma 碱（三（羟甲基）氨基甲烷）
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	用于板洗液。
抗-P-S780 RB1 抗体	Abcam	ab32513	兔单克隆抗体
AlexaFluor647 抗兔抗体	Invitrogen	A21245	高度交叉吸附的荧光标记二抗。
Hoechst 33342（双苯并咪唑）	Sigma-Aldrich	B2261	可插入染色质的荧光 DNA 染料。
通透液	NA	NA	含 0.1% Triton X-100 的 50 mM Tris 缓冲盐水，pH 8.0。
板洗液	NA	NA	含 0.1% Tween-20 的 Tris 缓冲盐水。
封闭液	NA	NA	含 5% 脱脂奶粉、Tris 缓冲盐水和 0.1% Tween-20 的溶液，用于免疫染色前封闭培养板以及抗体稀释。
Cell Profiler 2.1	Broad Institute		http://www.cellprofiler.org/download.shtml
Active Perl 社区版	ActiveState		http://www.activestate.com/activeperl/downloads
R 编程环境	The R Foundation		http://www.r-project.org
Rstudio	Rstudio		http://www.rstudio.com/