外层膜蛋白的分离线粒体的流式细胞仪免疫检测

摘要

这里描述的是这样一种方法来检测并通过免疫标记线粒体分离从啮齿动物的组织和通过流式细胞仪分析的量化线粒体外膜蛋白质。该方法可以被扩展以评估线粒体亚群的功能方面。

摘要

方法来检测和监测线粒体外膜蛋白成分在动物组织是研究线粒体生理和病理生理至关重要。该协议描述了线粒体啮齿动物组织中分离出免疫标记是通过流式细胞仪检测的技术。线粒体是从啮齿动物的脊髓中分离并进行快速浓缩步骤，以除去髓磷脂，来自神经组织制备的线粒体级分中的主要污染物。分离的线粒体，然后标记所选择的抗体和荧光标记的二抗。分析流量通过与线粒体特异性染料，其次是检测和免疫标记蛋白定量染色流式细胞仪验证线粒体制剂的相对纯度。该技术具有快速，量化和高吞吐量，允许成千上万的每个样本的线粒体的分析。它可适用于评估新颖p在正常生理条件下，在线粒体表面roteins以及病理过程中，可能会成为错误定位到该细胞器的蛋白质。重要的是，这种方法可以被耦合到荧光指示剂染料对线粒体亚群的某些活动的报告，并为从中枢神经系统（脑和脊髓）以及肝线粒体可行的。

引言

线粒体是经过多轮的裂变和聚变，被运到高能源需求的网站，并迅速生理刺激反应¹高动态性的细胞器。因为人们越来越认识到不同组织内的线粒体，甚至不同的细胞区室，具有不同的功能配置文件，需要新的方法来识别这些不同的线粒体亚群。

显微术提供了一种方法，通过个别线粒体可以可视化和蛋白质在或在线粒体可以通过免疫²来确定是否存在。然而，用这种方法定量分析是劳动密集和更适合用永生化或原代细胞系的实验。来源于组织的个体的线粒体的研究是显著更加困难和最方法不允许以易于识别线粒体亚群与evalu并发通报BULLETIN线粒体功能^3。

为了解决这一难题，一种新颖的方法来immunolabel线粒体分离从啮齿动物组织中，并随后分析通过流式细胞术已经被开发出来。这允许快速检测并定位于线粒体外膜，其相比于分析由显微镜蛋白质的定量，少得多的劳动密集的，并允许以十万计的线粒体中的单个样品的分析。此测定法可用于监测被认为是组成性存在于线粒体的线粒体外膜蛋白质的命运和相对量，蛋白质的募集到线粒体表面，或错误定位在病理条件下，线粒体蛋白的检测。此外，以往的荧光指示剂染料的掺入允许的线粒体功能的某些方面，在不同的线粒体同时评价亚群。

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方案

在这项研究中使用的动物严格按照协议（N08001CVsr）批准的中心德RECHERCHE杜中心医院DE L'蒙特利尔大学（CRCHUM）机构委员会动物保护的它遵循概述了加拿大国家标准进行治疗理事会动物护理（CCAC）。

准备执行该协议（ 表1）所需要的所有试剂。关于设备，耗材及供应商的所有其他细节可以在材料清单上找到。

表1缓冲区组成。

1，收集大鼠脊髓

1. 深深地麻醉大鼠（只SD）与4％异氟烷。在捏个的验证anaesthetization因缺乏反射ê前爪。通过断头台安乐死的大鼠断头。安乐死该方法优于其他，这可能会歪曲脊髓。
2. 切开背部皮肤，以暴露脊柱。切骨剪略高于骨盆脊柱。可视化的脊柱开幕。
3. 将10毫升注射器，用200微升枪头（通过在火焰稍微融化附后），充满磷酸盐缓冲液（PBS），到脊柱。

结果

从大鼠脊髓源性线粒体可以免疫标记与靶向Mitofusin2（Mfn2的），牵连线粒体⁸的外膜的融合蛋白的抗体。以下隔离和标签带Mfn2的特异性抗体和荧光标记的二抗，线粒体通过流式细胞术（ 图1）进行处理。以下的数据采集，样品是使用流式细胞分析软件，由第一可视化上的点图（ 图2A）的所有收集的事件进行分析。当事件被绘制在FSC，宽度（W）相对于面积（A）（ 图2B）的双峰和单峰是有区别的。一旦汗衫被选择时，栅极线粒体人口经由FSC / SSC（ 图2C），并验证事件由染色阳性线粒体特异性染料的数量共绘制未染色样品的直方图用沾有线粒体SPE样品cific染料。以确定的线粒体事件，放置栅极处的两个峰（ 图2D）的交叉点。对于脊髓制剂，通常> 90％的事件都积极为线粒体特异染料。对于其他组织如肝，〜98％的事件将与染料标记（数据未示出）。仅选择该标签正对线粒体特异性染料的事件后，通过选择一个栅极（Mfn2的^+），其包括1％或更少.......

讨论

这是越来越明显，线粒体是关键球员在正常生理和疾病。虽然免疫可以确定哪些蛋白质在线粒体或在线粒体表面发现了在一定的条件下，对​​整个人口的平均这个方法报告。此方法不能产生约线粒体亚群或亚群的相对丰度信息。虽然先前已假设所有线粒体创建相等，则该字段被越来越多地认识到在小区内的线粒体在形态和/或函数¹⁰方面的广泛变化。

荧光显微镜方法也考虑到线粒体异质性。然而，这种类型的数据的量化是劳动密集型的。此外，该方法更适合于使用培养细胞的研究，如线粒体体内的标签/原位是困难的，由于exces西伯数量目前线粒体，使个体的细胞器的分化本来就很难。在大多数免疫细胞化学实验的协议，也无法同时标记线粒体外膜蛋白和评估线粒体功能由于所需的抗体标记的细胞透化步骤。当前的方法适用于分离的线粒体中，并且因此不需要透化步骤。此外，个别线粒体的可视化是唯一可能通过电子显微镜，它是不适合于线粒体功能的分析。话虽这么说，我们认识到，从组织线粒体的分离导致线粒体网络的破坏，这可能会影响线粒体功能的一些元素。然而，分离的线粒体的功能性方面，从组织中被类似地处理的比较仍.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
大鼠	Charles River	品系代码 400	成年 （9 周至 18 周） 雄性或雌性大鼠可用于分离方案。大鼠的体重取决于性别和年龄（雄性在 300 至 500 克之间，雌性在 200 至 350 克之间）。
Dounce 均质机	Kontes Glass Co.	885450-0022	Duall 22
微量离心机	Thermo Scientific		Sorvall Legend Micro 17 R
超透明超速离心管	Beckman Coulter	344057	透明、薄壁
Sorvall 超速离心机	Thermo Scientific		Sorvall WX UltraSeries
AH-650 转子和吊篮	Thermo Scientific
Opti-prep	Axis-Shield	1114542	碘沙醇，密度梯度培养基
无脂肪酸牛血清白蛋白	Sigma	A8806	线粒体必须不含脂肪酸
琥珀酸钠 二氢二钠 六水合物	Sigma	S9637
兔抗 Mitofusin2 抗体	Sigma	M6319
兔 IgG	Jackson Immuno Research	011-000-003
抗兔 IgG PE	eBioscience	12-4739-81
微量滴定管	Bio-Rad	223-9391	用于通过流式细胞术采集样品
MitoTrackerGreen （MTG）	Invitrogen	M7514	100 nM：Ex 490 nm/Em 516 nm
TMRM	Invitrogen	T668	100 nM：Ex 548 nm/Em 574 nm
CCCP	Sigma	C2759
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008	5 µM： Ex 540 nm/Em 600 nm
抗霉素 A	Sigma	A8874
LSR II 流式细胞仪	BD
BD FACSDiva 软件	BD
FlowJo	TreeStar Inc.		用于分析
BCA 蛋白检测试剂盒的软件	Pierce/Thermo Scientific	23225	Bradford 检测，因为它与高浓度 SDS 不兼容