本文介绍了一种通过免疫标记从啮齿类动物组织中分离的线粒体，并结合流式细胞术分析来检测和定量线粒体外膜蛋白的方法。该方法可进一步扩展用于评估线粒体亚群的功能特性。
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摘要
摘要
检测和监测动物组织中线粒体外膜蛋白组分的方法对于研究线粒体的生理学和病理生理学至关重要。本实验方案描述了一种技术，即从啮齿类动物组织中分离线粒体后，通过免疫标记并利用流式细胞术进行分析。线粒体从啮齿类动物脊髓组织中分离，并经过快速富集步骤以去除髓鞘——这是从神经组织制备线粒体组分时的主要污染物。分离后的线粒体随后用目标一抗及荧光标记的二抗进行标记。通过流式细胞术分析，首先使用线粒体特异性染料染色以验证线粒体制剂的相对纯度，继而检测和定量免疫标记的蛋白。该技术快速、可定量且通量高，可对每份样品中的数十万个线粒体进行分析。该方法适用于在正常生理条件下评估线粒体表面的新蛋白，也可用于研究在病理状态下可能错误定位至该细胞器的蛋白。重要的是，该方法可与荧光指示染料联用，以报告线粒体亚群的某些功能活性，且适用于中枢神经系统（脑和脊髓）以及肝脏来源的线粒体。
引言
线粒体是高度动态的细胞器，会经历多轮分裂和融合，可被运输至能量需求较高的部位，并能快速响应生理刺激1。由于人们日益认识到不同组织甚至不同细胞区域内的线粒体具有不同的功能特征，因此需要开发新方法来鉴定这些不同的线粒体亚群。
显微镜技术提供了一种可视化单个线粒体的方法，并可通过免疫荧光确定蛋白质是否存在于线粒体上或线粒体内部2。然而，该方法的定量分析工作量较大，更适用于使用永生化细胞系或原代细胞系的实验。从组织中分离的单个线粒体的研究则显著困难得多，且大多数方法无法在评估线粒体功能的同时方便地鉴定线粒体亚群3。
为克服这一难题，已开发出一种新方法，可用于对从啮齿类动物组织中分离的线粒体进行免疫标记，并通过流式细胞术进行后续分析。该方法能够快速检测和定量定位于线粒体外膜的蛋白质，与显微镜分析相比，该方法劳动强度显著降低，并可在单个样本中分析成千上万的线粒体。该检测方法可用于监测线粒体外膜蛋白的命运及其相对含量，这些蛋白被认为在生理状态下持续存在于线粒体中，也可用于检测蛋白向线粒体表面的募集，或在病理条件下检测错误定位至线粒体的蛋白。此外，结合使用常规荧光指示染料，可同时评估不同线粒体亚群中某些线粒体功能特征。
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方案
本研究中使用的动物均严格按照蒙特利尔大学医院研究中心（CRCHUM）动物保护机构委员会批准的方案（N08001CVsr）进行处理，该委员会遵循加拿大动物护理委员会（CCAC）规定的国家标准。
准备执行本方案所需的所有试剂（表1）。有关仪器、耗材和供应商的其他所有信息均可在材料列表中找到。
表 1. 缓冲液组成。
1. 大鼠脊髓的采集
- 使用 4% 异氟烷对大鼠（Sprague Dawley）进行深度麻醉。通过夹捏前肢无反射反应来确认麻醉效果。采用断头器断头处死大鼠。该处死方法优于其他可能造成脊髓变形的方法。
- 切开背部皮肤以暴露脊柱。使用骨剪在骨盆上方剪断脊柱，观察椎管的开口。
- 将一支 10 ml 注射器（前端连接经火焰轻微熔化后固定的 200 µl 移液器吸头）装满磷酸盐缓冲液（PBS），插入椎管内。
- 对活塞施加中等压力，冲洗出脊髓组织。
- 若脊髓表面有血液残留，需先用 PBS 冲洗，再进行下一步操作。
注意：该方法也已验证适用于脑和肝脏组织。若需同时采集这些组织，应从处死的大鼠中取半侧脑组织，以及与脊髓重量相等的一块肝脏组织。其余所有步骤均保持相同。
2. 脊髓线粒体的分离（改编自 Vande Velde et al. 4）
- 取出完整的脊髓组织，置于5 ml玻璃匀浆器中，加入5倍体积（约3.25 ml）匀浆缓冲液（HB）。为获得最佳线粒体分离效果，所有操作步骤均需在冰上或低温环境中进行。手动匀浆直至无明显组织块残留，约需8次 strokes。将匀浆液分装至两个（2 ml）或三个（1.7 ml）微量离心管中。在台式微量离心机中，4 °C条件下以1,300 × g离心10分钟。
- 收集上清液并转移至一个5 ml超速离心管中。向含有沉淀的微量离心管中加入750 µl（约0.5倍体积）HB，轻轻重悬沉淀。重复离心和重悬步骤两次。将所有上清液（S1a和S1b）合并至上述同一5 ml超速离心管中。此步骤用于去除小碎片杂质。
- 使用配备摆动转子的超速离心机，将合并后的S1在4 °C条件下以17,000 × g离心15分钟。
- 若需获取胞质组分（例如用于Western blot分析），请保留上清液（S2）以进一步处理。将沉淀（P2，即粗线粒体组分）重悬于4 ml HB + 50 mM KCl中。在摆动转子中，4 °C条件下以17,000 × g离心15分钟。弃去上清液，将沉淀（P3）轻轻重悬于800 µl HB中。
注意：使用含50 mM KCl的HB洗涤线粒体，以去除非特异性结合的污染物。 - 在新的5 ml超速离心管中，准确加入800 µl重悬的沉淀（P3）。
- 向该管中加入200 µl碘克沙醇（密度梯度介质），使最终碘克沙醇浓度为12%。使用P1000移液器轻柔但充分地吹打混匀。建议先加入碘克沙醇，再加入重悬的沉淀（P3），以利于充分混合。在配备摆动转子的超速离心机中，4 °C条件下以17,000 × g离心15分钟。
- 注意：肝脏不含髓鞘，因此若仅处理肝脏组织，则此步骤非必需。然而，若同时处理中枢神经系统（CNS）线粒体，建议对所有组织采用相同处理方式。
- 吸除管顶部的髓鞘层，并小心移除并弃去上清液。沉淀可能较松散。将沉淀重悬于4 ml HB中。再次在4 °C条件下以17,000 × g离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于4 ml HB中。重复一次离心并弃去上清液。
- 将最终沉淀（P7）重悬于100–200 µl HB中，并转移至1.7 ml微量离心管。此样品即为分离得到的线粒体。
- 进行蛋白定量。将样品及标准曲线稀释于2%十二烷基硫酸钠（SDS）中，以确保在蛋白定量过程中线粒体充分溶解。
3. 线粒体分离后的免疫标记及其流式细胞术分析
- 针对每种待测试的染色体系，将25 µg分离的线粒体移入1.7 ml微量离心管中。每次实验均需设置未染色样本；对于每种抗体，务必设置相应的同型对照样本。
- 在台式微量离心机中，于4 °C条件下以17,000 × g离心2分钟。
- 弃去上清液，将分离的线粒体重悬于50 µl线粒体缓冲液（M缓冲液）中，该缓冲液需添加10%无脂肪酸BSA，4 °C孵育15分钟（封闭步骤）。
注意：染色过程中，所有孵育步骤均应在4 °C冰箱中进行。 - 向管中加入一抗（兔抗Mfn2，20 µg/ml），于4 °C孵育30分钟。
注意：应通过滴定实验确定每种抗体的最佳浓度。由于同一家生产商的同种抗体在不同批次间可能存在浓度和/或纯度差异，可能导致实验结果不一致，因此每批新到的抗体均需重新进行滴定。 - 洗去未结合的一抗：在4 °C条件下以17,000 × g离心2分钟，弃去上清液，轻轻将沉淀重悬于200 µl M缓冲液中。再次在4 °C条件下以17,000 × g离心2分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于50 µl M缓冲液中。
- 向管中加入二抗（驴抗兔IgG-藻红蛋白（PE），0.5 µg/ml），样品于4 °C避光孵育30分钟。
- 洗去未结合的二抗：在4 °C条件下以17,000 × g离心2分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于200 µl M缓冲液中。再次在4 °C条件下以17,000 × g离心2分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于500 µl M缓冲液中。
- 为确认检测到的信号确实来源于线粒体，需使用线粒体特异性荧光染料对分离的线粒体在室温下避光染色15分钟。若需同时检测其他功能参数（如线粒体膜电位或超氧化物生成），请进入第4步；否则直接进入第5步进行上机检测。
注意：必须确认二抗的发射光谱与功能染料的光谱兼容。例如，若使用光谱特性类似于FITC的商用染料验证线粒体纯度，并使用四甲基罗丹明甲酯（TMRM）检测膜电位，则可选用别藻蓝蛋白（APC：Ex 650 nm/Em 660 nm）作为二抗。在适用情况下，应添加补偿对照，i.e., 使用单一荧光染料标记的样本作为对照。 - 将样品转移至适合流式细胞仪上样的试管中。（为便于处理小体积样本，可将微量滴定板管置于3 ml流式细胞仪管内。）样品置于冰上，并立即送至流式细胞仪进行检测。
4. 通过流式细胞术检测线粒体膜电位和线粒体超氧化物生成
- 在步骤 3.8 中，使用 100 nM TMRM（激发波长 548 nm/发射波长 574 nm）5 对分离的线粒体染色 15 分钟，室温避光操作，以验证其具有完整的跨膜电位。若需比较不同样本或群体间的跨膜电位，使用较低浓度或非淬灭浓度的 TMRM（1 至 30 nM）可能更为合适6。
- 作为 TMRM 染色的对照，可在线粒体分离后加入 100 µM 碳酰氰基-m-氯苯腙（CCCP）——一种可使线粒体去极化的线粒体解偶联剂——同时使用 100 nM TMRM 染色。若使用较低浓度的染料，使线粒体去极化所需的 CCCP 浓度可能更低。
- 在步骤 3.8 中，使用适当的线粒体超氧化物指示剂染色 15 分钟，室温避光操作，以验证分离的线粒体能够产线粒体超氧化物7。
- 作为线粒体超氧化物产生的对照，可在线粒体分离后加入 10 µM 抗霉素 A——一种呼吸链复合体 III 的抑制剂，可增强线粒体超氧化物的产生——同时进行染料染色。
5. 通过流式细胞术获取和分析免疫标记的分离线粒体
- 仪器设置：将电压从线性模式切换至对数模式，以方便对分离的线粒体进行分析，并设置电压参数（FSC：450；SSC：250）。确保在数据采集过程中以FSC-A（面积）、FSC-W（宽度）和FSC-H（高度）模式收集事件，以便在采集后的数据分析中排除双联体（i.e., 同时通过检测器的两个事件）。设置采集事件数为100,000。如适用，获取补偿对照样本。
- 数据采集：在数据采集前，避免涡旋震荡样本，改用轻弹管壁的方式混匀。初始采集时，在设门过程中以低压模式收集事件。对总群体进行设门。相应调整直方图的电压，通常未染色样本的峰值应位于第二个十进制区间（102）。一旦设门完成并开始处理样本，可将压力切换至高压模式。
- 数据分析：通过绘制FSC-W与FSC的散点图来识别双联体。区分单一体和双联体，并对单一体设门。通过选择经线粒体特异性染料阳性染色的事件，圈定线粒体群体。
- 利用同型对照确定背景染色水平。使用同型对照样本，确定线粒体群体中Mfn2抗体阳性标记的百分比。
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结果
源自大鼠脊髓的线粒体可用靶向线粒体外膜融合相关蛋白 Mitofusin2（Mfn2）的抗体进行免疫标记8分离并使用Mfn2特异性抗体及荧光标记的二抗标记线粒体后，通过流式细胞术对线粒体进行分析图1)。数据采集完成后，使用流式细胞术分析软件对样本进行分析，首先在点图上可视化所有采集到的事件（图 2A). 当将细胞事件绘制在前向散射光宽度（W）与面积（A）的散点图中时，可区分双联体与单联体图2B）。一旦选中单细胞，通过FSC/SSC圈定线粒体群体（图2C），并通过将未染色样本与线粒体特异性染料染色样本的直方图叠加，验证线粒体特异性染料染色阳性的事件数量。为确定线粒体相关事件，将门控设于两个峰的交界处（图 2D）。对于脊髓标本制备，通常 >90%的事件对线粒体特异性染料呈阳性。对于其他组织如肝脏，约98%的事件会标记该染料（数据未显示）。在仅选择对线粒体特异性染料呈阳性标记的事件后，通过设置门控（Mfn2）并使用同型对照确定背景标记水平。...
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讨论
越来越多的证据表明，线粒体在正常生理功能和疾病中均发挥着关键作用。虽然免疫印迹可以确定在特定条件下哪些蛋白质存在于线粒体内或线粒体表面，但该方法仅反映整个线粒体群体的平均状态，无法提供有关线粒体亚群或亚组相对丰度的信息。尽管过去通常认为所有线粒体都是均一的，但目前研究领域日益认识到，细胞内的线粒体在形态和/或功能上存在广泛的异质性10。
荧光显微镜技术确实能够考虑线粒体的异质性。然而，此类数据的定量分析较为耗时费力。此外，该方法更适用于培养细胞的研究，因为线粒体的标记在培养细胞中更容易实现。 体内/原位 由于存在数量过多的线粒体，使得单个细胞器的区分本身非常困难。在大多数免疫细胞化学实验方案中，由于抗体标记需要进行细胞通透化步骤，因此无法同时标记线粒体外膜蛋白并评估线粒体功能。当前方法使用分离的线粒体，因而不需要通透化步骤。此外，单个线粒体的可视化通常只能通过电子显微镜实现，而该技术不适用于线粒体功能的分析。需要指出的是，我们认识到从组织中分离线粒体会导致线粒体网络的破坏，这可能会影响某些线粒体功能。然而，对于经过相似处理方式获得的组织来源的...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Laurie Destroismaisons和Sarah Peyrard提供的出色技术支持，感谢Alexandre Prat博士提供流式细胞仪的使用权限。我们还要感谢Timothy Miller博士在去除制备样品中髓鞘方面所做出的贡献。本研究得到了加拿大卫生研究院（CIHR）神经肌肉研究合作项目、加拿大创新基金会、加拿大肌萎缩侧索硬化症协会、Frick肌萎缩侧索硬化症研究基金会、CHUM基金会以及魁北克健康研究基金会（C.V.V.）的资助。C.V.V.和N.A.均为魁北克健康研究基金会和加拿大卫生研究院新研究者奖获得者。S.P.由加拿大肌萎缩侧索硬化症协会设立的Tim Noël研究生奖学金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 大鼠 | Charles River | 品系编号 400 | 可用于分离实验的成年（9周至18周）雄性或雌性大鼠。大鼠体重因性别和年龄而异（雄性通常为300至500 g，雌性为200至350 g）。 |
| 杜恩斯匀浆器 | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| 微量离心机 | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| 超透明超速离心管 | Beckman Coulter | 344057 | 透明、薄壁 |
| Sorvall 超速离心机 | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 转子及吊桶 | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | 碘克沙醇，密度梯度介质 |
| 无脂肪酸牛血清白蛋白 | Sigma | A8806 | 线粒体实验必须使用无脂肪酸型 |
| 琥珀酸钠二碱六水合物 | Sigma | S9637 | |
| 兔抗线粒体融合蛋白2抗体 | Sigma | M6319 | |
| 兔IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| PE标记的抗兔IgG抗体 | eBioscience | 12-4739-81 | |
| 微量滴定管 | Bio-Rad | 223-9391 | 用于流式细胞术样本采集 |
| MitoTracker Green (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM：激发波长 490 nm / 发射波长 516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM：激发波长 548 nm / 发射波长 574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM：激发波长 540 nm / 发射波长 600 nm |
| 抗霉素A | Sigma | A8874 | |
| LSR II 流式细胞仪 | BD | ||
| BD FACSDiva 软件 | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | 用于数据分析的软件 | |
| BCA 蛋白检测试剂盒 | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | 不推荐使用Bradford法，因其与高浓度SDS不兼容 |
参考文献
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