转基因动物的制备 水螅 通过胚胎显微注射

摘要

通过将质粒DNA显微注射到胚胎中，随后发生基因组随机整合并经无性繁殖建立均一品系，可获得稳定转基因的Hydra。转基因Hydra可用于追踪细胞运动、基因过表达、启动子功能研究，或利用RNAi技术敲低基因表达。

摘要

作为刺胞动物门（Cnidaria）的成员，也是所有两侧对称动物的姐妹群，Hydra 可用于揭示多细胞动物共有的基本生物学过程。Hydra 被用作研究再生、模式形成和干细胞的模式生物。然而，由于缺乏可靠的基因扰动方法来研究分子功能，相关研究进展一直受到限制。转基因技术的发展重新激发了对 Hydra 生物学的研究¹。转基因 Hydra 可用于活细胞示踪、分选以获得用于生化分析的纯细胞群体、通过基因敲低和过表达来操控基因功能，以及启动子功能的分析。质粒 DNA 被注射到早期胚胎中后，会在发育早期随机整合到基因组中。这导致孵化出的个体在其三个谱系（外胚层上皮、内胚层上皮或间质细胞）中一个或多个谱系的组织区域表达转基因。获得具有转基因组织的孵化个体的成功率在 10% 至 20% 之间。通过无性繁殖转基因孵化个体，可在特定谱系中建立稳定且均一的转基因品系。生成转基因 Hydra 的过程出人意料地简单且高效，本文介绍了一种可低成本轻松实施的实验方案。

引言

Hydra 已被用于研究再生、模式形成和干细胞约 250 年²。Hydra 具有简单的身体结构，包含三个细胞谱系：外胚层上皮、内胚层上皮和间质细胞。管状身体由外胚层和内胚层上皮谱系构成，每个谱系均为单层细胞。体柱中的所有上皮细胞均具有有丝分裂能力。当上皮细胞移位至末端区域³，即口端的头部（口和触手）或反口端的足部（基盘）时，它们会停滞在细胞周期的 G2 期，并改变细胞命运⁴。间质谱系的细胞位于上皮细胞之间的间隙中。该谱系由位于体柱外胚层上皮层中的多能干细胞维持⁵。间质干细胞可分化为三种体细胞类型（神经细胞、腺细胞和刺细胞）以及生殖细胞^6,7。

作为刺胞动物门的一员，且是所有两侧对称动物的姐妹群，Hydra 可以为揭示多细胞动物共有的基本生物学过程提供重要线索。直到最近，由于缺乏可靠的基因功能扰动方法，相关研究进展受到阻碍。然而，随着转基因技术的发展¹，我们现在能够充分利用 Hydra 来更深入地理解多细胞动物共有的基本机制，例如干细胞功能、再生以及模式形成。转基因 Hydra 品系的建立是通过将质粒 DNA 显微注射到胚胎中实现的，这种方法会导致外源 DNA 随机整合，并在相当比例的孵化幼体中产生嵌合表达。通过无性繁殖，可以获得在特定谱系中均一表达的稳定品系。与大多数只能通过有性繁殖传代的动物模型相比，转基因 Hydra 能够进行克隆扩增，这是其显著优势。此外，由于 Hydra 个体通体透明且自身不表达内源性荧光蛋白，转基因细胞可在活体中被方便地追踪⁸。

自首批转基因Hydra品系建立以来的七年中¹，这些品系已被用于多种研究应用。在不同细胞类型中表达荧光蛋白，使得研究人员能够在野生型条件下以及化学干预后，追踪细胞运动、观察细胞形态变化并追踪细胞命运^1,5,9-12。此外，在不同谱系中表达多种荧光蛋白，可实现通过FACS分离特定的细胞群体。该技术已被用于干细胞特异性mRNA和谱系特异性小RNA的测序^13,14。尽管两个Hydra肌动蛋白基因之一的启动子应用最为广泛，但已有少数细胞类型特异性启动子被鉴定并用于驱动转基因Hydra中GFP的表达^9,11,15,16。未来，细胞类型特异性启动子将使任意特定细胞类型的观察与分离成为可能。此外，转基因方法已成功用于界定Wnt3启动子的顺式作用调控元件¹⁷。

在Hydra中建立转基因方法为通过异位表达、过表达和基因敲低来检测基因功能提供了强有力的手段。已构建出表达荧光标记蛋白的转基因动物，以研究蛋白的功能及其细胞内定位^18-20。此外，在GFP转基因的3’非翻译区（3’UTR）中表达RNA发夹结构可实现对靶基因的敲低^21,22。在这些方法中，需要利用GFP来识别和追踪在建立转基因品系过程中的转基因组织。然而，在某些情况下，GFP分子可能会干扰被标记蛋白的功能。最近一项研究表明，Hydra基因可排列成操纵子结构，即 形成多顺反子转录本，随后通过反式剪接添加前导序列并分别翻译成独立的蛋白质²³。通过将编码蛋白或RNA发夹的基因置于操纵子的上游位置，而将荧光蛋白基因置于下游位置，即可在无需标记编码蛋白或RNA发夹基因的情况下追踪转基因组织。该方法已被用于将RNA发夹与DsRed2以操纵子结构共表达，从而实现基因敲低¹⁴。

方案

1. 质粒DNA、注射针和注射皿的准备

1. 使用高速大提或中提试剂盒制备质粒DNA，并通过乙醇沉淀将DNA浓缩至2.5 mg/ml。DNA沉淀应溶解于无核酸酶的去离子水中。将DNA分装为10–20 µl每份，于-20°C保存。（参见 补充表1 有关可用载体的列表）
2. 使用琼脂糖在100 × 15 mm培养皿中制备注射皿，以构建用于固定胚胎的槽道。
   1. 将一块75 × 50的玻璃载玻片以倾斜角度放入一个100 × 15 mm的培养皿中。倒入约50 ml熔化的2%琼脂糖 水螅 培养基²⁴ 倒入培养皿中。或者，先将琼脂糖倒入培养皿，然后在其表面漂浮一个“显微注射鱼模具”。
   2. 琼脂糖凝固后，移除玻璃片或模具。如果使用了玻璃片，用剃刀片切去多余的琼脂糖以形成壁状结构。倒入 水螅 将培养基加入培养皿中，立即使用或于4°C保存至需要时。注意：注射用培养皿若在使用间期于4°C保存，可重复使用。
3. 使用显微拉针仪将含细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管按以下条件拉制针尖：加热温度525，拉力75，速度100，时间50。将制备好的针尖插入培养皿中一条细长的黏土条内进行保存，使针尖与培养皿底部保持平行。
4. 配制注射溶液时，将 3 µl 的 2.5 mg/ml 质粒 DNA 溶液与 2 µl 的 10% 酚红溶液混合。短暂涡旋振荡后，离心 10 分钟 在微量离心机中以最大速度离心，以去除可能堵塞针头的任何颗粒。
5. 在解剖显微镜下，用镊子从针尖处剪去几毫米，形成一个小开口。注意：开口的合适尺寸具有一定灵活性，因为在步骤3.3中可通过调节压力来适应此差异。
6. 将培养皿放置好，使针头保持垂直向下。用移液器将约 0.5 µl 注射液注入针头后端，使液体通过毛细作用吸入针尖。

2. 注射用胚胎的制备

1. 每天定期检查 Hydra AEP 品系培养物中是否产生卵子的水螅体。收集这些水螅体，并将其单独放置于另一培养皿中。在白天每隔数小时观察一次这些水螅体，以监测卵子形成进程。当卵子突破外胚层并位于一圈收缩的外胚层细胞环上时，即可进行显微注射²⁵。在注射前，将这些水螅体与数只带有精巢的 Hydra 共同培养至少 1 小时，以完成受精。雄性 Hydra 无需特殊处理即可释放精子。
2. 若在 AEP 品系群体中发现带有完全成形卵子（直径约为 400 μm²⁵）或处于 1 至 8 细胞阶段的胚胎的雌性个体，也应收集用于注射。对于已经开始卵裂的胚胎，应立即进行注射。注意：完全成形的卵子与单细胞合子在形态上无法区分，因此在注射前应将其与雄性个体共同孵育以确保受精。
3. 注射前，使用带有 #15 刀片的解剖刀切除胚胎上下方大部分亲本组织，仅保留胚胎及其附带的一小段体柱，以便必要时可用镊子操作胚胎。注意：从胚胎上分离的组织具有再生能力，应予以保存，以确保 Hydra 群体中持续存在雌性个体。
4. 使用巴斯德移液管将胚胎转移至注射用培养皿中，并将其沿琼脂糖槽壁平行排列。

3. 质粒DNA的显微注射

1. 将显微注射仪安装在置于铁板上的磁性支架上。将注射持针器（即显微注射仪中夹持针头的部分）安装到操纵杆式显微操作器上。使用磁性支架将操纵杆式显微操作器固定在铁板上。将整个装置放置在解剖显微镜的右侧，并调整持针器位置，使其位于观察视野中。
2. 将装有胚胎的注射培养皿置于解剖显微镜下，方向应使琼脂糖槽的垂直壁位于左侧。将针头插入持针器，并将针尖下移至培养皿的 Hydra 培养基中。
3. 缓慢顺时针旋转注射器旋钮，直至矿物油充满针头顶部，并观察到注射液以稳定流速从针尖持续流出进入 Hydra 培养基中。若液流过强，可逆时针旋转旋钮以降低压力。重复练习此步骤，以常规获得适宜的压力，该压力取决于针头开口的大小（即 步骤 1.5 中针头剪切方式）。注意：若液流过强，胚胎将无法存活。
4. 在解剖显微镜下观察，移动注射培养皿，使第一个胚胎位于视野中央。移动针头使其接触该胚胎。使用显微操作器将针头刺入胚胎。注意：琼脂糖槽的垂直壁可防止胚胎被针头推离原位。
5. 让注射液流入胚胎 1 至 2 秒后迅速抽出针头。若胚胎含有多个细胞，需对每个细胞单独注射。使用镊子重新调整胚胎方向，使下一个细胞对准针尖。
6. 完成第一个胚胎注射后，移动培养皿使下一个胚胎进入注射位置，并重复上述操作；持续进行直至所有胚胎均完成注射。

4. 胚胎的培养与孵化

1. 将所有显微注射后的胚胎转移至一个含有数只具精巢的Hydra的培养皿中（以确保所有胚胎均被受精）。将胚胎置于18 °C培养箱中继续胚胎发育。
2. 当胚胎发育至角质层阶段时，将每个注射后的胚胎分别转移至24孔板的独立孔中，每孔预先加入Hydra培养液。
3. 将注射后的胚胎在18 °C黑暗条件下培养2周。
4. 经过2周的培养后，在解剖显微镜下检查每个注射胚胎。若发现角质层阶段的胚胎已从亲本组织小块上脱落，且亲本组织已再生为水螅体，需立即移除该再生水螅体，以防与新孵化的个体混淆。
5. 将盛有注射胚胎的培养皿转移至室温下的水族灯下光照环境。每天观察各孔，收集新孵化的个体。新孵化的个体呈白色，因为Hydra水螅体典型的粉红色来源于其摄食的Artemia。
6. 在荧光显微镜下观察孵化个体，检测转基因表达情况。

结果

建立转基因 水螅 线条

每隔2-3天用卤虫（Artemia nauplii）投喂转基因孵化幼体。孵化后的幼体有时在最初一两天内不会进食。部分新孵化的幼体始终不进食，因而无法存活。若幼体的外胚层（图1A）或内胚层上皮组织中存在转基因成分，可让该个体出芽，并收集转基因组织比例最高的芽体（图1B, C）。对新产生的芽体持续进行此操作，直至建立一个在外胚层（图1D）或内胚层上皮谱系中均一表达转基因的稳定品系。同时，可建立另一个不携带转基因但其他遗传背景完全相同的品系（图1B），作为后续实验的阴性对照。如果转基因组织未能进入芽体，有时可通过切割动物体并使其再生，从而使转基因组织进入新的出芽区域。然而，若转基因组织过于靠近末端，则可能在动物正常生长过程中因被推挤而丢失，此种情况通常无法补救。根据我们的经验，若转基因本身为中性（即对生物学功能无影响），约有30%携带上皮组织转基因的水螅（H...

讨论

Hydra 通常进行无性繁殖，但需要环境刺激才能开始产生配子。对于大多数Hydra物种而言，这些刺激因素尚未明确界定，并且可能因品系而异。制备转基因Hydra面临的一个重要障碍是难以定期获得胚胎，因为在实验室条件下诱导Hydra进入有性生殖阶段较为困难。然而，AEP品系²⁵在实验室中能够 readily产生配子，迄今为止所有转基因品系的建立均仅使用了该品系。诱导配子生成的最常用方法是通过饮食调控。如前所述，应将动物每日喂食持续三周，随后饥饿5天，之后改为每周喂食两次，在此期间将产生配子¹。我们的经验还表明，将AEP Hydra培养在水族箱中的垂直平板上²⁶（可能模拟了更自然的环境），即使保持常规喂食频率，也能促进卵子的生成。此外，通过AEP自交获得的品系有时比亲本品系更规律地产生配子。因此，建立AEP的F1代品系是获得更稳定胚胎来源的另一种可行方法。

注射后存活并发育至角质阶段的胚胎比例取决于胚胎的健康状况、注入溶液的量以及注...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AEP Hydra 品系			电子邮件：Celina Juliano，邮箱 celina.juliano@yale.edu 或 Hiroshi Shimizu，邮箱 bubuchin2006@yahoo.co.jp
高速大提试剂盒	Qiagen	12662
100 × 15 mm 培养皿	BD Falcon	351029
75 × 50 mm 玻璃显微镜载玻片	Sigma	CLS294775X50
鱼类显微注射模具	IBI Scientific	FM-600
含丝硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter Instrument	BF100-50-10	外径：1.0 mm，内径：0.50 mm，长度：10 cm
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪	Sutter Instrument	P-97
酚红	Sigma	P3532
珠宝商镊子，Dumont #5	Sigma	F6521
手术刀片 #15	Fisher	50-822-421
矿物油	Sigma	M8410-500ML
显微注射仪	Narishige	IM-9B
磁力支架	Narishige	GJ-1
铁板	Narishige	IP
操纵杆式显微操作器	Narishige	MN-151