本文介绍了一种基于荧光素酶表达的高通量方法，用于滴定多种RNA和DNA病毒，该方法可使用自动化或手动液体处理设备进行操作。
本文内容
摘要
摘要
用于测定感染性病毒滴度的标准蚀斑实验耗时较长，难以适用于大量样本，且无法用于不形成蚀斑的病毒。作为蚀斑实验的替代方法，我们开发了一种高通量滴定技术，可在一天内同时完成大量样本的滴定。该方法包括用萤光素酶标记的病毒感染样本，将感染后的样本接种至适当的易感细胞系，随后加入萤光素底物，通过读板仪获取发光信号，最终将发光值转换为病毒滴度。此外，可在工作流程中平行加入代谢活性染料以评估细胞毒性，从而在药物筛选背景下提供有价值的信息。该技术为测定病毒滴度提供了一种可靠、高效的高通量方法，可作为标准蚀斑实验的替代方案。
引言
传统的病毒蚀斑实验在病毒研究中仍然是主流方法，尽管其通常耗时较长，并成为实验结果获取过程中的显著瓶颈。近年来出现了一些更快速的间接病毒定量方法，包括定量聚合酶链式反应（qPCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术1-4。最近的创新技术，如Virocyt病毒计数器，可通过先进的流式分选技术结合蛋白和DNA/RNA染料实现病毒的直接计数5。尽管这些方法无疑加快了病毒研究的进程，但每种方法均有其优缺点。例如，qPCR可用于特定病毒基因组序列的定量，但无法有效区分具有感染性的病毒颗粒与缺陷型病毒颗粒6。ELISA具有很高的特异性，但需要针对目标病毒蛋白的合适抗体，且成本可能非常高。虽然流式细胞术技术具备诸多优势并已显著改进，但其通量以及对高度专业化设备的可及性仍存在障碍。重要的是，这些技术均不完全适用于高通量筛选，而在高通量筛选中，病毒定量步骤的简便性和所需时间至关重要。
本文介绍一种高通量且易于自动化的滴定技术，用于检测表达萤火虫荧光素酶（Fluc）报告基因的病毒。该方法通过并行使用已知病毒量的标准曲线，根据发光信号读数来估算待测样本中的病毒滴度。将含有未知量荧光素酶表达病毒的样本与标准病毒稀释曲线同时接种至允许性“蚀斑形成”细胞系中，经过数小时孵育后检测病毒相关的发光信号。该方法可在同一天内快速、定量地获得结果，而传统的蚀斑测定方法通常需要数天的孵育时间，以便人工计数可见的蚀斑7-9。
本方案以编码荧光素酶报告基因（Fluc）的溶瘤型水疱性口炎病毒（VSV∆51-Fluc）为例，详细阐述了我们的滴定方法步骤，内容包括：1. 样品制备；2. 使用自动分液器将允许性细胞系接种至培养板；3. 病毒标准曲线的制备；4. 使用96孔手动移液器将样品上清液转移至允许性细胞系；5. 使用细胞活力检测试剂评估样品的细胞毒性；6. 荧光素底物的配制；7. 生物发光信号的检测；以及8. 数据分析。
方案
1. 样品制备
- 获取含有表达荧光素酶的病毒（此处以 VSV∆51-Fluc 为例）的样品用于滴定，并转移至 96 孔板中。或者，可在 96 孔组织培养板中进行感染，直接使用上清液。
- 留出两列不作处理，用于标准曲线的设置。对于直接在96孔板中进行的实验，在实验结束时（40小时）测定滴度 感染后）或于 -80 °C 保存，待后续测定滴度。
2. 病毒滴度测定用容许细胞的制备
- 24 小时 滴定前，将Vero细胞悬浮于浓度为2.5 × 10⁵个/mL的培养基中5 细胞/毫升 在含有10%胎牛血清（FBS）、30 mM HEPES和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养。注意：尽管本实验方案使用Vero细胞，但任何适用于水疱性口炎病毒（VSV）感染的敏感细胞系均可使用。
- 接种 2.5 × 104 使用微量板分液器将细胞（100 μl）加入96孔白色固体平底板中。
- 准备 12 ml 每块培养板的细胞悬液量加上5毫升 用于启动。
- 用50 ml溶液冲洗管路以清洁微孔板分液器卡匣 无菌水。
- 用细胞悬液填充微量板分液器管路，并加入5 ml 细胞悬液的流动
- 选择一个程序，向白色壁面96孔板的每个孔中加入100 μl。加样后，如有需要，对其他板重复相同操作。若使用不透明底的白色壁面板，还需在96孔透明平底板中接种若干孔，用于验证细胞状态和密度。
- 实验结束后，将细胞冲洗回原始容器中。通过运行50 ml液体清洗胶 cassette 70%乙醇处理，随后加入50 ml 通过管道注入温热的无菌水。
- 确保在每次使用后对盒式组件和管路进行适当清洁。
- 在37 °C、5% CO₂湿润培养箱中孵育细胞24小时2 培养箱
3. 病毒标准曲线的制备
- 在无血清 DMEM 中制备 VSV∆51-Fluc 的标准曲线，使每毫升中空斑形成单位（pfu）的最终浓度 在转移到Vero细胞后如下：108 pfu/ml，107 pfu/ml，106 pfu/ml, 105 pfu/ml, 104 pfu/ml，103 pfu/ml, 102 pfu/ml，以及101 pfu/ml。每块Vero细胞培养板准备50 μl各浓度病毒液，并额外增加10%。
注意：荧光素酶病毒原液的滴度需通过经典方法进行测定10 为了生成标准曲线，从而实现绝对定量。否则，在缺乏精确滴度信息的情况下，可通过基于稀释步骤任意设定病毒滴度来实现相对定量。例如，标准曲线的第一个稀释点可设定为108 病毒单位及随后的1/10稀释至107 以此类推。在此情况下，应将数值表示为相对于预设样本的倍数变化，因为绝对定量将不准确。
4. 将样本上清液转移至易感细胞
- 在光学显微镜下检查接种于透明底96孔板中的Vero细胞，确认单层细胞融合度至少达到95%。
- 将25 μl样品上清液转移至接种于白色孔壁板中的Vero细胞。请勿将上清液加入用于标准曲线的两列指定孔中。注意：可使用96通道液体处理仪同时对单块板上的所有孔进行操作。
- 使用8通道或12通道多通道移液器，将第3步中配制的标准曲线各稀释浓度分别加入指定的两列Vero细胞孔中，每孔25 μl。
- 将板在室温下以430 × g离心5分钟。
- 在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育5小时。
5. 细胞活力的评估
- 注意：当从在透明 96 孔板中进行的感染实验所获得的上清液开始时，可在定量前使用细胞活力指示染料（如刃天青）评估样品的活力。
- 向含有病毒和 细胞的 96 孔板各孔中加入相当于其体积 10% 的刃天青。同时设置仅含细胞的对照组和仅含培养基的对照组，以分别确定 100% 和 0% 活力的数值。
- 孵育 2–4 小时后（孵育时间因细胞类型以及染料商品化制剂或重悬粉末的浓度而异），使用荧光酶标仪（激发波长 530–560，发射波长 590）读取并记录信号。根据以下公式报告样品的细胞活力：相对代谢活性 = （（待测样品信号值 - 阴性对照信号值）/（仅含细胞对照信号值 - 阴性对照信号值））× 100%
6. 荧光素底物的制备
- 在5小时孵育结束前30分钟 ，配制荧光素溶液，使其在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中浓度达到2 mg/ml 。每块培养板准备2.5 ml ，另加2 ml备用。避光保存。注意：荧光素也可在当天早些时候配制，并于4 °C保存至使用前。
7. 读取生物发光信号
- 孵育5小时后，向白色固相板中的Vero细胞每孔加入25 μl荧光素酶底物（luciferin）。可通过手动或使用集成在发光仪中的自动分配器加入荧光素酶底物。注意：若使用仅具备单次终点读数功能的仪器，可能需要在加入荧光素酶底物前先加入与荧光素酶兼容的裂解缓冲液，以提高检测结果的一致性。
- 按以下参数读取各孔：
- 振荡5秒。
- 等待30秒。
- 以适当的固定灵敏度/曝光值读取发光信号。若仪器支持，建议采用多点读数（例如，3 × 3矩阵）以提高检测准确性。
- 记录并保存定量的生物发光强度数据。
- 若使用了自动分配器添加荧光素酶底物，应随后用温热的无菌水冲洗并排空管路，再用无菌水预润管路。
8. 数据分析
- 为获得准确结果，通过求解非线性回归，根据标准曲线生成Hill方程，并将该方程应用于滴定样本，以计算病毒表达单位。某些病毒或特定情况下可能产生具有线性关系的标准曲线；此时应求解线性方程。
结果
描述高通量方法的工作流程概要如图1所示。图2展示了VSV∆51-Fluc典型标准曲线的结果。通过四参数非线性回归分析生成Hill曲线，可据此插值得到未知输入pfu（病毒滴度估计值）。这些估计的滴度称为病毒表达单位（VEU）。图3A显示了使用相同样本进行标准蚀斑测定所获得的VEU和滴度结果10。样本来源于一项实验，该实验中使用了多种化学物质以增强VSV∆51-Fluc在786-0细胞中的复制与扩散。从标准曲线插值得到的VEU必须乘以一个因子，该因子基于转移至Vero细胞的样本上清液的稀释倍数（本例中稀释因子为5）。滴度与VEU之间的线性相关性如图3B所示，R2为0.8083，Pearson相关系数r为0.899（p <0.0001）。图4展示了786-0细胞在感染VSV∆51-Fluc前经化学物质处理后，通过代谢测定获得的典型细胞毒性数据。最后，图5展示了使用不同病毒（单纯疱疹病毒（HSV）、痘苗病毒和腺相关病毒（AAV），均表达萤火虫荧光素酶）获得的典型标准曲线，并列出了所需的孵育时间及冻融循环次数。
图1. 使用VSV∆51-Fluc进行高通量病毒滴度测定和细胞毒性检测的工作流程。(A) 每孔接种2.5 × 104个Vero细胞（100 μl），在37 °C培养。(B) 24小时后，将标准曲线样品25 μl转移至Vero细胞中（每块板两列）。(C) 将待测样品25 μl转移至其余Vero细胞孔中。离心板并置于37 °C培养。(D) 向含有原始样品的板中加入相当于孔内液体体积10%的刃天青（resazurin）试剂。将板在37 °C孵育。(E) 3小时后，读取并记录荧光信号，评估细胞毒性。(F) 5小时后，向每孔Vero细胞中加入25 μl浓度为2 mg/ml的荧光素（luciferin）溶液。读取发光信号，并计算病毒表达单位（Viral Expression Units）。
图2. VSV∆51-Fluc的预期标准曲线。 在上清液转移后5小时，使用发光仪检测同一孔内五个不同位点的荧光素酶表达水平，并以平均相对光单位（RLU）表示生物发光信号。将平均RLU值对已知输入的pfu/mL作图，拟合非线性回归曲线并生成Hill方程。图中显示两条重复曲线的平均值及标准误差条（r2 = 0.9993）。
图3. 标准蚀斑实验滴度与高通量方法所得滴度的比较。（A）通过Vero细胞上的标准蚀斑实验测得的病毒滴度（pfu/ml）与使用高通量荧光素酶实验测定的同一样本计算出的病毒滴度（VEU/ml）进行比较。（B） VEU/ml 与标准蚀斑实验测得滴度之间的线性关系。图中显示了线性回归曲线及决定系数（R2）。
图4. 样本活力。 在将上清液转移至Vero细胞之前，通过使用 commercially available resazurin 溶液检测细胞代谢活性来确定样本活力。原始荧光值经未处理且未感染的孔归一化处理。
图 5. HSV、Vaccinia 和 AAV 病毒的预期标准曲线。 使用发光仪在孔内五个不同位置测量荧光素酶表达水平，并以平均相对光单位（RLU）表示生物发光信号。（A） HSV 标准曲线加入至 24 小时前接种的 Vero 细胞中，细胞密度为每孔（100 μl）2.5 × 104 个细胞，上清液转移后 17 小时进行荧光素酶检测（R2 = 0.9489，n = 1）。通过求解非线性回归拟合得到 Hill 方程。（B） Vaccinia 标准曲线加入至 24 小时前接种的 Vero 细胞中，细胞密度为每孔（100 μl）2.5 × 104 个细胞，在 37 °C 孵育 2.5 小时后进行荧光素酶检测（R2 = 0.9892）。通过线性回归分析拟合得到线性方程。（C） AAV 标准曲线加入至 24 小时前接种的人肺腺癌细胞（A549）中，细胞密度为每孔（100 μl）2.5 × 104 个细胞，感染后 24 小时进行荧光素酶检测。通过求解非线性回归拟合得到 Hill 方程。图中显示五次重复曲线的平均值及标准误差条（R2 = 0.9926）。
讨论
本文所述的基于荧光素酶的方法相较于其他现有方法具有多项优势，包括操作简便、快速、所需设备最少以及相对较低的成本。实现这一优势的关键在于避免了连续稀释步骤。尽管如此，基于连续稀释的该方案变体仍然是可行的，并已在近期用于高通量抗病毒筛选中评估表达荧光素酶的埃博拉病毒滴度11。虽然此类改进方法本质上更耗时且成本更高，但在需要更宽动态范围进行病毒定量时，可能提供更优的检测范围。除了特别适用于高通量筛选背景下病毒滴度的评估外，我们的一 步法荧光素酶病毒定量方法还能对复制性病毒的感染性病毒颗粒提供准确估算。此外，来自同一实验的发光读数与细胞毒性数据相结合，能够更全面地反映实验条件对靶细胞的影响，这在溶瘤病毒研究和药物筛选中尤为有用。
此处示例使用的是可复制的负链单链RNA病毒；然而，通过一些微小的实验方案调整，本方案也可适用于多种可复制和非复制性病毒。这包括痘苗病毒（Vaccinia）、单纯疱疹病毒（HSV）和腺相关病毒（AAV）（见图5）。感染细胞内病毒的样品（例如痘苗病毒）在定量前需要进行病毒释放步骤（例如，至少一次冻融循环）。当将该技术应用于其他病毒时，必须优化从病毒上清液或裂解物转移至使用发光仪读板之间的孵育时间。该参数主要取决于病毒在许可细胞系中的复制周期以及驱动荧光素酶表达的启动子强度。最佳优化方法是在优化步骤中使用完整的标准曲线。具体操作时，需用制备好的标准曲线中的不同稀释度感染相应的许可细胞系，并在转移后的不同时间点分别读取各重复孔的信号值。理想情况下，应选择一个孵育时间点，使得LOG(RLU)与LOG(滴度)之间在预期样品滴度范围内呈线性关系。对于VSV∆51-Fluc，在5小时的孵育时间内，通常线性范围为104 pfu/ml 至107 pfu/ml 。如果样品的滴度预期更低或更高，可相应地延长或缩短孵育时间。或者，也可将样品进行稀释，使其落入该线性范围内，类似于常规ELISA的操作方式。
如上所述，该方法非常适合利用药物文库进行高通量药物筛选，因为大多数步骤均可实现自动化。可使用自动微孔板分液器高效地接种细胞，使用96通道液体处理系统加入药物文库，使用微孔板分液器加入病毒，并使用自动发光仪读取微孔板数据。理论上，该方法也可适配于384孔板或其他更小规格的板型；然而，其限制因素在于可接种的细胞数量，因为细胞数量减少会导致LOG(RLU)与LOG(滴度)关系的线性范围变窄。最后，可在工作流程中轻松整合使用刃天青（resazurin）或其他代谢染料对细胞活力的评估，从而在抗病毒筛选中区分出具有细胞毒性的化合物，或鉴定出与病毒联用时产生协同杀伤效应的化合物12。尽管如此，该方法的局限性包括需要使用表达荧光素酶转基因的病毒，而这种情况并非总能实现，以及缺乏足够敏感的易感细胞系。然而，若其他报告基因（例如，GFP）的定量方法具备足够的线性范围和信噪比，则该方法很可能可被调整用于这些报告基因。总体而言，所述的高通量方法可经修改以适用于多种不同的病毒，并可根据多种应用需求进行优化。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Vanessa Garcia 获得了安大略省科学与技术伊丽莎白二世女王研究生奖学金的资助，Cory Batenchuk 获得了加拿大自然科学与工程研究理事会博士后奖学金的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Corning | SH30243.01 | |
| 胎牛血清 | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Corning | 21-040-CV | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | 配制 1 mM 溶液，pH 7.3 |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012B | |
| D-萤光素钾盐 | Biotium | 10101-2 | |
| 96 孔白色实底聚苯乙烯 TC 处理微孔板 | Corning | 3917 | 也可使用 384 孔板以实现更高通量 |
| Synergy Mx | BioTek | SMTBL | 单色器微孔板读板仪 |
| Liquidator96 | Mettler Toledo | LIQ-96-200 | 96 通道手动移液系统 |
| Liquidator96 LTS 带滤芯无菌吸头 | Mettler Toledo | LQR-200F | 任何与所选移液器兼容的无菌带滤芯吸头均可使用 |
| Microflo | BioTek | 111-206-21 | 用于将细胞接种至 96 孔板 |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Scientific | 5210450 | 微孔板荧光计 |
参考文献
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重印与许可
