本方案旨在优化组织微阵列的构建与质量，以用于生物标志物研究。内容涵盖规划与设计、数字病理学、虚拟切片标注以及自动化组织阵列化等方面。
本文内容
摘要
摘要
生物标志物研究依赖于组织微阵列（TMA）。TMA是通过将“供体”组织块中的小组织芯反复转移至“受体”组织块中制备而成，随后用于多种生物标志物应用。传统TMA的构建过程劳动强度大、精度低且耗时。本文介绍了一种基于下一代组织微阵列（ngTMA）的技术方案。ngTMA结合了TMA的规划与设计、数字病理学以及自动化组织微阵列技术。本方案以134例转移性结直肠癌患者为例进行说明。在实验设计中考虑了组织类型、特定组织学区域和待包含的细胞类型、组织点数量、样本量、统计分析方法以及TMA副本数量等组织学、统计学和后勤因素。每位患者的组织学切片均被扫描并上传至基于网络的数字平台。在该平台上，使用直径为0.6–2.0 mm的标注工具对切片进行多次查看和标注（标记），并采用多种颜色区分不同的组织区域。将供体组织块和12个“受体”组织块装入仪器中。系统调取数字切片并与供体组织块图像匹配。随后自动重复排列已标注的区域，最终生成ngTMA。在本示例中，计划构建6个ngTMA，包含六种不同类型的组织/组织学区域。每个ngTMA需要制备两个副本。每位患者需扫描3至4张切片，共需进行3轮扫描，均在夜间完成。所有切片均完成标注，使用不同颜色代表不同的组织/区域，包括肿瘤中心、侵袭前沿、肿瘤/间质、淋巴结转移灶、肝转移灶以及正常组织。每例病例平均进行17次标注，标注耗时约2–3分钟/例。共制备12个ngTMA，包含4,556个组织点。阵列过程耗时15–20小时。由于其高精度、灵活性和快速性，ngTMA是进一步提升临床与转化研究中所用TMA质量的有力工具。
引言
在过去的二十年中，组织微阵列（TMA）对生物标志物研究产生了显著影响。TMA本质上是一种组织“档案”，通过反复将来自石蜡包埋的“供体”组织块的小型组织芯（直径通常为0.6至2.0 mm）转移至单个TMA“受体”组织块中而制成（图1）1。采用较小的组织芯尺寸，可在一张TMA上排列来自少数或众多不同患者的约500个不同的组织样本点2。
使用组织微阵列（TMA）进行预后或预测性生物标志物研究具有诸多优势。以通过免疫组织化学方法评估450例患者的某种蛋白质生物标志物表达为例：无需对来自相同数量蜡块的450张患者切片分别进行450次免疫组织化学染色，而是可以将每个样本的小组织芯整合到一个单一的TMA蜡块中。即使从每位患者取多个组织芯，所产生的蜡块数量也最少。这种方法显著降低了成本和其他资源消耗，同时减少了组织浪费。此外，它还能够在相同的实验条件下，对大量组织进行具有足够统计效能的研究评估。
组织微阵列具有多种不同应用。例如，可通过使用不同染料染色，或进行免疫组织化学、显色以及荧光检测后，利用组织微阵列研究形态学、蛋白质表达、RNA表达及DNA异常 原位 杂交3-7近期研究还利用组织微阵列（TMA）来检测瘤内 以及在实验室间染色方案的变异，确定抗体对特定基因突变的特异性和敏感性，并在国际协作中评估蛋白表达的观察者间可重复性8-11.
使用患者来源组织构建传统组织微阵列（TMA）是一个耗时的多步骤过程（图2）。该过程首先在病理学研究所或其他机构的档案库中查找可能合适的病例，并从中调取诊断切片。病理学家对每个病例的切片进行评估，并为研究目的选择最具代表性的切片。接下来，在显微镜下直接用笔标记出感兴趣的区域。这一步骤通常具有挑战性且不够精确，仅能大致“估计”组织打孔应取自的位置。随后，从档案库中调取与这些已标记切片相对应的石蜡包埋块。对组织块与切片进行快速比对。使用半自动或自制的组织阵列仪，在估计的感兴趣区域内对供体组织块进行打孔，并将获取的组织芯转移至受体TMA石蜡块中。采用此种阵列技术构建TMA的过程劳动强度大、耗时长、精度低且缺乏灵活性。据估计，制备包含475个点、每点3个复孔的TMA约需84小时的工作时间。
最近，伯尔尼大学病理学研究所提出了一种构建组织微阵列（TMA）的新方法，该方法依赖于三个组成部分：规划与设计（或咨询）、数字病理学结合组织学专业知识以及自动化TMA排列技术12。这一整体概念被称为下一代组织微阵列（ngTMA）。下文以134例转移性结直肠癌患者为例，描述了ngTMA的详细操作方案。本案例中，将原发性肿瘤、淋巴结转移灶和肝转移灶均排列至ngTMA中，用于后续生物标志物分析。此外，还希望保留每位患者的小组织芯，以备将来进行核酸提取。
方案
注意：本研究已获得瑞士伯尔尼因塞尔医院当地伦理委员会（07-10-13）的批准。组织样本来自伯尔尼大学病理学研究所伯尔尼肿瘤库。
1. 规划与设计（咨询）
- 思考需要回答的研究问题，确定项目中要包含的组织类型，并明确哪些组织学结构对于回答该问题至关重要。
- 确定项目中最适合的核心直径以及每位患者所需的芯数，并根据拟检测的生物标志物数量决定下一代组织微阵列（ngTMA）的制备份数。
- 考虑组织微阵列（TMA）构建后的统计学因素，如样本量和分析方法；确定纳入研究的患者数量，并为阵列设置对照组织。
- 调取每位患者的组织学（或诊断用）苏木精-伊红（H&E）染色切片，快速浏览切片，筛选出包含项目所需相关信息和组织学特征的切片。
注意：若需对特殊染色或免疫组织化学切片进行扫描和标注，而非使用H&E切片，则应从石蜡包埋块中制备新的切片
2. 载玻片扫描
- 打开电脑和切片扫描仪，启动扫描软件。在预览界面中选择“自动模式”进行明场扫描。
- 点击“扫描选项”以调整切片质量参数。此时选择切片是直接扫描至可通过网络访问的数字平台，还是扫描至本地驱动器（或外部驱动器），并设置扫描类型和对焦点数量。
- 点击“服务器参数”以将切片扫描至“病例中心”。在此步骤中，添加更多载片盒，标记所有切片，并设置病例中心中用于存储切片的文件夹。每个载片盒最多可容纳25张切片。
- 检查待扫描的实际组织切片的质量和清洁度。如有必要，使用70%乙醇清洁切片。
- 每盒最多装载25张切片，标签朝内放置（图3A）
- 将载片盒放入扫描仪中。若使用多个载片盒，可将其叠放。
- 点击绿色箭头（图3B）开始扫描切片。所有切片扫描完成后，取出载片盒，并关闭程序、电脑和切片扫描仪。
3. 数字切片标注
- 输入数字切片管理中心的浏览器地址 ，并下载免费的数字切片浏览软件。
- 打开数字切片浏览软件，选择包含数字切片的文件夹（图4A）。
- 添加注释、重新排序、管理数字切片文件夹，或为同事分配用户权限，或向文件夹中添加附件。
- 在数字切片浏览软件中点击所需的数字切片。
- 使用放大工具评估切片，并找出需要整合到ngTMA中的感兴趣区域。
- 使用“TMA注释工具”，选择所需核心的大小和注释颜色，通过点击将注释放置在数字切片上（图4B）。
- 将注释移动至目标组织学结构位置，以便纳入ngTMA（图4C）。
- 重复使用注释工具，选择核心大小和所需注释颜色，继续进行注释操作。对文件夹中的所有切片重复切片浏览和注释过程。
- 或者，可将用于PCR的组织核心放入0.2 ml离心管中，而非整合至TMA。使用不同颜色对这些区域进行注释，以标识用于后续分子分析的位点。
- 创建所有病例及其对应注释和颜色的列表。
4. 组织微阵列构建
- 取出所有已标注数字切片对应的石蜡组织块，并按组织微阵列所需的顺序排列组织块。
- 确保组织块的厚度至少为 4 mm。若不足，则需重新包埋组织。
- 打开计算机和自动组织微阵列仪，启动组织微阵列仪软件，并为项目命名。
- 执行“更换工具”操作，选择项目所需的工具直径（i.e.，0.6、1.0、1.5 或 2.0 mm）。
- 将最多 12 个“受体”TMA 组织块装入仪器中，并为每个组织块分配一个 ID。
- 为每个受体组织块创建 TMA 布局。设计时需确定行数、列数、空白行以及核心之间的间距。可为每个受体组织块创建新布局，或重复使用相同布局。
- 将光标置于受体组织块布局上，准备获取第一个组织芯。
- 接下来，将最多 60 个供体组织块装入组织微阵列仪（图 5A）。在 A 至 F 每行中放置十个组织块，并为每个组织块分配供体 ID。在计算机屏幕上查看由组织微阵列仪自动获取的各供体组织块图像。
- 从第一个组织块开始，点击“切片”（Slide）。使用数字切片浏览工具查看存储在数字切片管理中心 （或外部硬盘）中的已标注数字切片。并排查看供体组织块图像与数字切片图像。
- 在组织块图像上选择参考点，以将供体组织块图像与数字切片图像叠加对齐。
- 点击“下一步”后，在放大的组织块图像上观察标注区域（图 5B）。点击标注区域上方以确认，然后点击“开始”。
注意：此操作将提示组织微阵列仪在受体组织块的选定起始位置钻出一个直径为 0.6 mm 的孔。随后，在第二步中，仪器使用穿孔工具在供体组织块上精确对应已标注并确认的区域进行穿孔。组织芯随后从供体组织块转移至受体组织块。 - 大约完成 500 个组织芯后，使用二甲苯棉签清洁钻头和穿孔工具。
- 若需要获取组织芯（而非在 ngTMA 中仅打孔），请点击该组织块的“PCR”工具，确认最多 4 个标注区域，然后点击“开始”。此操作将穿取组织芯并将其转移至 0.2 ml 离心管中。
- 对第二个供体组织块重复步骤 4.9 至 4.11，依此类推。
- 使用完所有供体组织块后，将第二轮供体组织块（61–120）装入组织微阵列仪，并继续执行步骤 4.8 至 4.11。
- 在项目进行过程中，当钻孔和穿孔操作持续进行时，及时更新供体和受体组织块的图像（图 5C）。
- 项目完成后执行“导出”操作。在导出文件夹中查找包含供体与受体组织块 ID、所有穿孔在 TMA 中的定位信息以及 TMA 布局/设计的 .xslx 文件。将所有供体组织块图像（含叠加的标注信息）另存为 jpg 格式并保存至导出文件夹（图 5D）。最终的 TMA 组织块即制备完成。
结果
规划与设计
本研究纳入了134例转移性结直肠癌患者，用于分析特定系列生物标志物。不仅为这些患者规划了下一代组织微阵列（ngTMA），还将进行DNA提取，随后对某些特定基因进行突变分析。
在ngTMA的规划与设计阶段，已确定以下方面：对每位患者将研究6个不同的组织学区域，分别为肿瘤中心、肿瘤侵袭前沿、肿瘤出芽最密集区域（肿瘤/间质相互作用区）、正常组织、淋巴结转移灶和肝转移灶。每个肿瘤组织区域纳入3个肿瘤点，每个正常组织区域纳入2个点（每位患者共17个点）。由于计划在此类患者样本上检测超过50种生物标志物，因此需要制备两份最终的ngTMA。考虑到淋巴结及远处转移灶可能体积较小，所有组织均选用0.6 mm的小直径组织芯进行TMA构建。
此外，计划对每个区域分别进行排列，以制备包含不同组织学区域的6个纳米级组织微阵列（ngTMA）：分别包含a）肿瘤中心、b）侵袭前沿、c）肿瘤出芽区域、d）正常组织、e）淋巴结转移灶以及f）肝转移灶组织的ngTMA。
在使用0.6 mm工具进行组织微阵列（TMA）设计时，将选择0.4 mm的穿孔间距以确保操作舒适。由于对长行和长列中的组织点进行评估通常较为繁琐，因此采用两种不同的设计方案。对于每个组织区域包含3个穿孔的肿瘤组织块，设计一个包含六个部分的布局，共计402个组织穿孔。对于正常组织穿孔，每个病例包含2个穿孔。最终选择一个总共可容纳432个穿孔的布局方案。
此外，针对每个样本，最多可额外 punched out 4 个直径为 0.6 mm 的组织芯，并将其放入 0.2 ml 离心管中。这些组织芯也将进行注释。
综上所述，将制备6个包含不同组织的ngTMA（5个肿瘤组织芯片 × 每例3个穿孔 × 134例患者；1个正常组织芯片 × 每例2个穿孔 × 134例患者），此外每例患者还将制备4个用于试管的组织芯。总计将完成2814个注释。
接下来，从切片档案中调取所选患者的相应H&E染色切片。由病理学家对每个病例进行简要复查，并为每种组织类型选择最具代表性的切片。
扫描
每例组织学切片均制作数字切片以供后续标注。本研究中，每例需扫描3至4张组织切片。 即，原发性结直肠癌，可包含或不包含邻近正常组织、淋巴结转移灶和肝转移灶，以及可能额外包含一张正常黏膜切片。
最多可将10个不同的载玻片盒完全装入切片扫描仪中，因此单次运行可扫描250张载玻片。扫描所需时间及数字切片文件大小取决于组织的尺寸和所需的图像质量因子。质量因子范围为0到100。本实验选择60的质量因子，因为该设置可在不明显损失图像质量的前提下生成较小的扫描文件。小块活检样本的扫描时间可少于30秒，而整张组织切片（如本示例所用）的扫描时间可能在2至10分钟之间。数字切片文件大小范围也可从2 MB到2 GB不等。使用质量因子60时，生成的扫描文件大小介于600 MB至1 GB之间。
本项目共需要 402 至 536 张切片，总计进行 3 次扫描运行。每次运行均在夜间进行。大约需要 500 GB 的存储空间。切片将直接扫描至一个名为 Case Center（ngtma.unibe.pathcasecenter）的数字平台。通过输入指定的用户名和密码，任何有网络连接的地方均可访问 Case Center。
注释
进行标注时，应考虑两个方面：1）不同的组织区域应使用不同的标注颜色；2）标注的数量应反映最终ngTMA所需副本的数量。
本案例中，每个肿瘤区域的单拷贝选取3个点位。对于双拷贝，每个区域必须使用6个点位进行标注。建议使用绿色标注正常组织，蓝色标注肿瘤中心，黄色标注肿瘤浸润前沿，红色标注肿瘤出芽区域（肿瘤/间质）相互作用区，黑色标注淋巴结转移灶，青绿色标注远处转移灶，白色则用于标注导管区域。每例样本的标注耗时约2-3分钟。
ngTMA 构建
本研究需要构建6个ngTMA模块，每个模块制作2份，共得到12个最终模块。点阵仪最多可支持12个受体模块。每个肿瘤模块将包含402个组织点，每个正常组织模块将包含268个组织点，整个项目总计包含4,556个组织点。
为每个受体蜡块创建组织芯片（TMA）布局，并保存项目（图6A、6B）。可同时将60个组织蜡块装入组织芯片仪中，并对每个供体蜡块拍摄图像。从第一个供体蜡块开始，从Case Center中调取相应的带注释数字切片。进行切片匹配，此过程耗时约1-3分钟。确认注释后，提示芯片仪开始打孔（图7）。每个组织芯的打孔和转移时间约为12秒。该过程中组织芯的丢失极少。完成本项目的芯片制备总时间约为24小时，包括切片/蜡块匹配及仪器重新装样时间。一些ngTMA的示例如图8A所示。后续分子分析所需的组织芯也可在此时打取（图8B）。
图1. A) 一个“供体”组织块。从供体组织块中打孔取出组织芯，并转移至 B) 受体组织块，即组织微阵列（TMA）中。
图 2. 传统的组织微阵列工作流程。 A) 从档案库中取出组织学切片，并 B) 交由病理学家进行审阅。 C-D) 在切片上进行标注，标示出拟转移区域的“估计”位置。 E) 取出相应的组织块。 F) 将组织块与切片进行比对以确认匹配，这一过程 G) 有时可能具有挑战性。 H-J) 随后进行组织微阵列制备。 K) 反复转移组织芯样，L) 最终构建出一张完整的组织微阵列（TMA）。
图3. A) 每个载玻片盒最多可放置25张载玻片用于扫描。B) 可调整质量因子和尺寸大小，并可实时监控扫描进度。
图 4. A) 扫描后的切片可上传至基于网络的平台 Case Center。B) 可查看数字切片。TMA 注释工具允许用户选择注释所需的核心尺寸和颜色。C) 注释可直接添加到数字切片上。请点击此处查看此图的放大版本。
图 5. A) 最多可将60个组织块装入组织微阵列仪中，即每行10个供体组织块，同时包含12个受体组织块。 B) 拍摄每个供体组织块的图像，并获取相应的数字切片。通过匹配组织块与切片，并利用标注信息确定打孔位置。 C) 在仪器进行打孔操作期间，可实时监控阵列构建的进度。 D) 完成打孔后，系统会导出阵列布局中每个点位的位置信息，同时生成带有相应标注的各供体组织块图像。
图6. 这些TMA布局用于排列A) 肿瘤组织块和B) 正常组织。
图 7. 组织芯片仪软件界面截图。 左侧可放置12个受体蜡块。底部采集每个供体蜡块的图像。中心区域显示组织芯片排列布局、打孔进度，以及带注释的各供体蜡块放大图像。
图 8. A) 一些新制备的ngTMA组织块示例。B) 可额外打孔获取组织样本用于后续分子分析。这些组织芯被打出后置于0.2 ml离心管中。
图9. ngTMA生物标志物应用示例。 A) 结直肠癌中Ki67的免疫组织化学染色。双重HER2免疫组织化学/原位杂交检测显示B) 蛋白质表达水平低（棕色）且Her2基因无扩增（黑色），相对于着丝粒（红色）；C) 蛋白高表达（棕色）且Her2基因扩增（黑色），相对于着丝粒（红色）。D) Her2的显色原位杂交显示乳腺癌ngTMA中单个mRNA转录本。E) 结直肠癌中CD8的免疫组织化学染色。F) 双重免疫组织化学染色标记泛细胞角蛋白AE1/AE3（棕色；肿瘤细胞）和CD68（红色；巨噬细胞），突出显示结直肠癌的肿瘤微环境。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本文概述了一种ngTMA的实验方案。ngTMA是一种新建立的组织微阵列技术概念，涉及规划与设计、数字病理学和切片标注，以及自动化的组织微阵列制备12。
与传统的组织微阵列技术相比，纳米级组织微阵列（ngTMA）具有诸多优势。第一步的规划与设计阶段尤为关键。重点在于回答特定的研究问题，需综合考虑组织学因素（例如，需要包含哪些区域？需要选取多少个点？）、统计学规划（例如，样本量是多少？后续如何分析样本？）以及后勤因素（例如，检测多少个生物标志物，因此需要制作多少份ngTMA副本？）。ngTMA可根据具体需求定制，无论是用于生物标志物的高通量筛选，还是仅针对少数精心 挑选的病例进行特定组织学特征的研究。
传统组织微阵列技术的一个（如果不是最主要的话）重要缺点，是组织学切片上标记的准确性较低，这使得对特定组织学结构、细胞或区域的研究几乎无法实现。ngTMA 能够实现高精度，因为注释可直接标注在数字切片上，研究人员因此可以精确选择需要打孔的区域，包括特定的单个细胞。在本示例中，同一组织块内的多个区域被分别打孔并用于阵列构建，例如肿瘤中心、侵袭前沿，以及因存在小的肿瘤细胞簇甚至单个细胞而被标记出的肿瘤/间质相互作用区域。这种精度只有通过 ngTMA 才能实现。第三，由于切片被扫描至基于网络的数字平台，切片的观察与标注可通过计算机完成，而无需使用显微镜。组织微阵列软件提供了用户 友好的界面，并具有高度灵活性，因此可实现多种布局和 ngTMA 设计。由于 TMA 构建通过自动钻孔完成，几乎无需手动操作，构建所需时间也显著缩短。本示例中 TMA 构建所需时间约为 24 小时。若采用传统 TMA 方法，按每小时 15 次打孔估算，该项目将耗时约 304 小时。
ngTMA可用于研究蛋白质表达、mRNA或DNA，以及这些分子的组合分析。图9展示了这些应用中的一些潜在生物标志物研究实例。通过标准免疫组织化学方法，可利用Ki-67检测癌症的增殖指数。也可采用联合方法，同时分析HER2等基因的蛋白质表达与DNA扩增。可将多种组织集中于一张ngTMA上，以降低实验成本、减少组织用量及其他资源消耗。此外，还可对HER2及其他基因进行显色mRNA原位杂交（chromogenic mRNA in situ hybridization），在大量病例中使用极少数组织切片即可识别单个mRNA转录本。诸如CD8等免疫标志物的免疫组织化学染色，可在肿瘤微环境背景下进行可视化分析。双重免疫组织化学染色还可用于突出特定兴趣区域，例如在癌症侵袭前沿处免疫细胞（红色标记）与肿瘤细胞（棕色标记）之间的相互作用。此类兴趣区域在传统组织微阵列技术中难以被有效捕获。
然而，本方案仍存在一些局限性。最重要的挑战是供体蜡块与数字切片之间的重叠问题。多个因素可能影响这一步骤。首先，应使用供体蜡块的最新切片进行切片扫描。在许多情况下，H&E染色切片并非供体蜡块的最后切片，而可能是免疫组织化学染色或其他染色切片。在此情况下，只要对最后的染色切片进行扫描和标注，也可使用染色切片，或者需要重新制作一张H&E切片。其次，在制作组织切片时也需格外注意，因为组织在水浴中可能发生膨胀，从而导致切片与蜡块匹配困难。第二，目前每个项目最多只能同时处理12个受体TMA蜡块。超过12个TMA的大型项目必须分配至第二个项目名称下进行。第三，供体蜡块必须使用标准模具和包埋盒制作，因为仪器无法适应不同尺寸。最后，供体蜡块的高度必须超过最低要求（4 mm），以实现最佳钻孔效果。在某些情况下，这需要对组织重新包埋。
近年来，数百篇出版物强调了组织微阵列（TMA）在生物标志物研究中的重要价值。TMA已被用于研究肺癌13、结直肠癌7、乳腺癌14、前列腺癌15、胰腺癌16、膀胱癌17和胃癌18等多种癌症。越来越多的研究者将TMA与图像分析技术结合使用，该方向已取得显著进展19-21。然而，除少数研究团队发表了创新性的TMA设计理念22-24外，学术界对TMA技术本身的优化关注甚少。自动化组织微阵列仪（如Estigen/Beecher公司的ATA-27）虽可提供布局设计以及快速、自动的组织打孔功能，但这仅代表ngTMA概念的一个方面。
ngTMA 技术相较于传统的组织微阵列方法具有显著改进。该技术结合了组织学和组织微阵列设计的专业知识，融合了数字病理学的灵活性、数字注释的精确性，以及自动化组织微阵列构建的高效性与可靠性。未来，将 ngTMA 与图像分析相结合，用于蛋白质和分子生物标志物的评估，将成为进一步提升临床与转化研究质量的有力工具。
致谢
作者谨此感谢转化研究单元的技术人员； Mary Economou、José Galván、Caroline Hammer、Dominique Müller、Liliane Schöni 以及伯尔尼大学病理学研究所信息学团队
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Pannoramic 250 Flash II | 3DHistech | 切片扫描仪 | |
| TMA Grandmaster | 3DHistech | 组织微阵列仪 | |
| Pannoramic Viewer | 3DHistech | 免费 | 切片浏览软件 |
| Case Center | 3DHistech | 数字切片平台 |
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