用于结构生物学研究的重组蛋白表达：在HEK 293F悬浮细胞中的一种新颖且易于实现的方法

摘要

利用哺乳动物系统表达重组蛋白正成为生产用于结构生物学研究的蛋白复合物的一种颇具吸引力的方法。本文介绍了一种简单且高效的表达系统，该系统利用悬浮培养的哺乳动物细胞来纯化用于结构研究的蛋白复合物。

摘要

大量表达和纯化重组蛋白复合物是结构生物学研究的基本要求。二十多年来，原核表达系统（如大肠杆菌 E. coli）因其成本较低且效率较高，一直在科学文献中占据主导地位，相比之下，真核细胞系则成本高昂且效率较低。尽管在细菌中表达重组蛋白具有产量高和成本低的明显优势，但缺乏特定的辅因子、分子伴侣以及翻译后修饰可能导致某些真核多亚基复合物、膜表面受体和分泌蛋白的功能丧失、错误折叠以及蛋白-蛋白相互作用的破坏。使用哺乳动物细胞表达系统可以克服这些缺陷，因为其提供了真核生物的表达环境。然而，由于蛋白产量低且成本高，这类方法在结构生物学中的应用直到最近仍受到限制。本文描述了一种简单且易于实现的方法，通过在悬浮培养的HEK（人胚胎肾）293F细胞中进行瞬时转染，实现毫克级蛋白的表达与纯化。

引言

分子细胞生物学的快速发展以及医学领域对更优药物的持续需求，促使结构生物学家需要研究日益复杂的蛋白质结构。这些蛋白质往往需要特定的翻译后修饰、分子伴侣和辅因子，以支持其复杂的折叠过程和酶活性。尽管蛋白质数据库（Protein Data Bank）中绝大多数结构是利用细菌表达系统获得的，但原核生物无法完成许多此类修饰，并且缺乏大量关键的真核生物辅因子。这对于研究由小信号分子激活的大型多亚基复合物，以及需要复杂折叠机制的核蛋白、细胞表面蛋白和分泌蛋白而言，可能构成重大障碍。已有多种经过基因工程改造的 E. coli 菌株用于克服其中部分限制¹。然而近年来，哺乳动物表达系统的使用逐渐增加，因其能够可靠地表达在其他系统中难以表达的真核蛋白²。如今，可通过多种技术获得稳定或瞬时的哺乳动物表达细胞系，这些技术包括病毒转导、化学介导的转染、电穿孔等物理基因转移方法以及直接注射³。尽管所有这些方法各有优缺点，但其中仅有少数方法适用于结构研究，因为其他方法往往成本过高和/或耗时过长。

在此，我们介绍一种极为简单、快速、经济且高效的表达蛋白质复合物的方法，适用于以悬浮培养的哺乳动物细胞进行结构生物学研究。该方法采用人类胚胎肾（HEK）细胞系进行瞬时共转染。例如， Freestyle HEK 293F 细胞。这些细胞源自 HEK 293 细胞系，可适应悬浮培养，在无血清培养基（如 FreeStyle 293 Expression Medium）中生长并达到高密度。随后使用支链型聚乙烯亚胺（PEI）对细胞进行瞬时转染，PEI 是一种成本较低的聚合物试剂，已有报道表明其适用于多种哺乳动物细胞。⁴ 通过形成DNA/PEI复合物，经内吞作用进入宿主细胞⁵该方法适用于小规模（30 ml）和大规模（高达300 ml）实验，可获得高水平的纯化蛋白复合物。该方法特别适用于研究那些需要复杂折叠机制、辅因子或特定翻译后修饰的蛋白质，而这些修饰无法由细菌、酵母和昆虫细胞完成。

本方案中，我们介绍了Sin3A转录抑制复合物中三种蛋白质核心支架的表达与纯化。该核心支架由组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）、缺陷沉默抑制因子3（SDS3）和独立于转换的3蛋白（Sin3A）组成。纯化后的复合物用于高通量结晶实验。

方案

注意：该方案适用于任何表达规模，因此试剂的体积和用量应按比例相应调整。本方案必须使用合适的哺乳动物表达载体。此处我们使用了一种改良的 pcDNA 3.1 表达载体，该载体可根据克隆中所用限制性内切酶的选择，方便地加入或省略亲和标签（图 1）。以下方案描述了一次大规模转染操作。

1. 在1 L滚瓶中进行大规模培养/转染

按照标准方案培养和维持HEK293F悬浮适应细胞。通常在250 ml锥形细胞培养瓶中培养体积为30至100 ml的起始培养物。

1. 将细胞以 0.5 × 10⁶ 个细胞/ml 的密度接种至每个 1 L 滚瓶中，终体积为 300 ml。
   注意：滚瓶可容纳的悬浮培养液体积最小为 150 ml，最大为 300 ml。若需进行更大规模的转染，请使用多个滚瓶。
2. 在 37 °C、120 rpm、5% CO₂ 条件下的轨道摇床培养箱中孵育 24 小时，直至细胞密度达到 1.0 × 10⁶ 个细胞/ml（细胞大约每 24 小时分裂一次）。
3. 将总共 300 µg 经滤膜除菌的 DNA（参见补充 方法） 加入 30 ml PBS 中，剧烈涡旋振荡 3 秒。
   注意：每百万个转染细胞使用 1 µg DNA。若需共转染两个或多个质粒，则应减少每种质粒的用量，以保持 DNA 与细胞数量的比例恒定。 
4. 向 PBS/DNA 溶液中加入 1.2 ml 浓度为 0.5 mg/ml 的经滤膜除菌的 PEI，剧烈涡旋振荡 3 秒。
5. 在室温下孵育混合物 20 分钟。
6. 将 DNA/PEI 混合物加入细胞中——此时细胞密度应为 1 × 10⁶ 个细胞/ml（见步骤 1.3）。
7. 共转染后，将细胞继续在轨道摇床培养箱中于 37 °C、120 rpm、5% CO₂ 条件下孵育 48 小时。
8. 通过在 3,000 × g 离心 5 分钟收集细胞内蛋白，并将沉淀物储存在 -80 °C。
   注意：也可使用标准（非 CO₂）摇床培养箱，前提是培养液上方的气体环境被替换为 5% CO₂ 且瓶盖密封。每次传代时（通常每 2 天一次）均需更换气体环境。

2. 从全细胞提取物中纯化蛋白质复合物

本方案针对使用 Flag 标签蛋白纯化核复合物进行了优化。

1. 将细胞沉淀物解冻至每升培养物约 40 ml 预冷的裂解缓冲液（100 mM 醋酸钾，50 mM Tris pH 7.5，5% 甘油，0.3% Triton X-100，蛋白酶抑制剂）中。
2. 通过反复吹打重悬沉淀（为避免起泡，请勿涡旋振荡）。
3. 使用玻璃匀浆器充分重悬细胞。超声处理 3 个循环（开启 15 秒，关闭 15 秒）。在 4ºC 下以 30,000 × g 离心 25 分钟，保留上清液。
4. 每升培养物使用 1.25 ml 抗 Flag 偶联琼脂糖树脂，用树脂平衡缓冲液（100 mM 醋酸钾，50 mM Tris pH 7.5）洗涤三次，进行平衡。
5. 将步骤 2.3 得到的全细胞提取物与亲和树脂在一支或多支 50 ml 离心管中孵育，并在 4 °C 下轻轻旋转孵育 30–120 分钟。
6. 在 4 °C 下以 3,000 × g 离心 1 分钟，弃去上清液。
7. 用 45 ml 预冷的缓冲液 1（100 mM 醋酸钾，50 mM Tris pH 7.5，5% 甘油，0.3% Triton X-100）洗涤树脂。在 3,000 × g 离心 1 分钟后弃去上清液。
8. 依次使用高盐缓冲液（300 mM 醋酸钾，50 mM Tris pH 7.5，5% 甘油）、低盐缓冲液（50 mM 醋酸钾，50 mM Tris pH 7.5，5% 甘油）和 TEV 切割缓冲液（50 mM 醋酸钾，50 mM Tris pH 7.5，0.5 mM TCEP）重复步骤 2.7 进行洗涤。
   注意：确保每次洗涤时间短暂，即仅足以完全重悬树脂，不可过长。
9. 取 10 µl 树脂样品，加入等体积的 2× 蛋白上样缓冲液稀释用于分析（结合蛋白对照）。请勿使用还原剂，以免导致抗体从树脂上释放。
10. 将树脂重悬于 8–10 ml 预冷的 TEV 切割缓冲液中，并转移至 一个 15 ml 离心管中。
11. 每升原始培养物加入约 40 µg TEV 蛋白酶（储存液浓度为 1 mg/ml），通过反复吹打充分混匀。
12. 用 100% N₂ 气体置换管内空气，以防止蛋白质氧化。
13. 在 4ºC 下轻轻旋转过夜。
14. 以 3,000 × g 离心 10 分钟。将上清液转移至适当截留分子量的超滤离心管中，浓缩至 500 µl。
15. 取 10 µl 浓缩后的蛋白样品，加入等体积的 2× 蛋白上样缓冲液稀释用于分析（TEV 洗脱液对照）。
16. 取 10 µl 树脂样品，加入等体积的 2× 蛋白上样缓冲液稀释用于分析。请勿使用还原剂，以免导致大量抗体从树脂上释放（TEV 切割后树脂对照）。
17. 用凝胶过滤缓冲液（50 mM 醋酸钾，50 mM Tris pH 7.5，0.5 mM TCEP）平衡尺寸排阻层析柱。
18. 用 0.22 µm 滤膜过滤蛋白样品。
19. 将样品上样至层析柱，并收集各组分。
20. 将步骤 2.9、2.15 和 2.16 的样品以及步骤 2.19 的凝胶过滤组分进行 SDS-PAGE 电泳并用考马斯亮蓝染色分析。
    注意：建议在进行凝胶过滤前，先对步骤 2.9、2.15 和 2.16 的样品进行 SDS-PAGE 电泳，以确认目标蛋白的表达。

结果

本文展示了2 L（8 x 250 ml培养物）的瞬时共转染及HDAC1、SDS3、Sin3A三元复合物的纯化。HDAC1和SDS3通过Sin3A的组蛋白去乙酰化酶相互作用结构域（HID）与Sin3A结合。每升培养物典型纯化产量可达1 mg复合物。

图1. 改造后的pcDNA 3.1表达载体示意图。 使用EcoRV和EcoRI酶切质粒，以在Sin3A的氨基末端引入亲和标签和TEV蛋白酶切割位点。为克隆无标签的HDAC1和SDS3版本，使用KpnI和EcoRI对载体进行酶切。

图2. SDS-PAGE显示纯化的第一步。“结合蛋白”泳道显示与亲和树脂结合的复合物。经TEV酶切后，Sin3A-HID上携带的标签被切除，复合物从树脂上洗脱，如凝胶的第二和第三泳道所示。

图 3. 利用尺寸排阻色谱纯化的蛋白质复合物的色谱图。 请注意，纯化的复合物在空体积中洗脱，因为它在溶液中形成二聚体。

图4. SDS-PAGE显示图3中凝胶过滤的各组分。

图 5. 准备转染的台盼蓝染色 HEK 293F 细胞，浓度为 2.3×10⁶ 个细胞/ml。 细胞应仅以单细胞或分裂细胞形式存在，若出现大团簇，可通过剧烈涡旋震荡约 25 秒将其分散。

问题	可能原因	解决措施
蛋白产量低。	转染的细胞数量较少。	在将转染反应混合物加入培养物之前，确保细胞密度约为 1.0 x 106。
	细胞传代次数可能过多。	在大约传代 90 次后，使用新鲜的细胞储备。
	DNA 可能已降解或含有较多杂质。	确保所用质粒 DNA 的 260/280 比值在 1.8 至 2.0 之间。建议将 DNA 在琼脂糖凝胶上电泳以评估其质量。
	表达的蛋白不稳定或溶解度不足。	在扩大转染规模之前，先小规模测试不同的构建体。确保标签不会干扰目标蛋白的结构。
细胞看起来浑浊，并具有异常颜色和/或气味。	细胞被细菌或酵母污染。	必须始终采用良好的无菌操作技术。若发生污染，对超净台进行熏蒸以及对细胞培养室进行紫外线消毒有助于控制问题。
细胞活力低。	培养基 pH 值不正确。	确保培养物始终在 5–8% CO2 条件下培养。
	细胞培养密度超过 3.0 x 106 个细胞/mL。	转染前细胞密度不应超过 2.5 x 106 个细胞/mL，绝对不可超过 3.0 x 106 个细胞/mL。
亲和纯化未成功	蛋白未表达。	参见上文。
	纯化条件可能不正确。	调整缓冲液条件（例如，高盐、低盐、pH 值）。

表1. 故障排除。

系统	优点	缺点
E. coli	表达速度快 蛋白产量高 成本低廉 适用于同位素标记蛋白的经济化生产	缺乏某些重要的分子伴侣，可能影响蛋白正确折叠 缺乏多种翻译后修饰能力 可能缺少对蛋白功能和/或复合物组装至关重要的辅因子
P. pastoris	能够完成大多数翻译后修饰 成本低廉	缺乏部分翻译后修饰能力 可能缺少对蛋白功能和/或复合物组装至关重要的辅因子
昆虫细胞中杆状病毒表达系统	能够完成全部翻译后修饰 杆状病毒相比其他病毒株系细胞毒性较低	病毒转导前的制备过程耗时 病毒稳定性差，无法长期保存 昆虫细胞可能缺少对蛋白功能和/或复合物组装至关重要的辅因子
哺乳动物系统生物反应器	能够完成全部翻译后修饰 可提供蛋白功能和复合物组装所需的全部辅因子 可实现高密度细胞培养 能够表达所有需要复杂折叠机制的哺乳动物蛋白 蛋白产量极高	需要专业人员操作生物反应器 需要昂贵的设备 优化表达条件可能耗时较长
HEK 293F 悬浮细胞	能够完成全部翻译后修饰 可提供蛋白功能和复合物组装所需的全部辅因子 能够表达所有需要复杂折叠机制的哺乳动物蛋白 转染流程快速且易于操作 相比生物反应器和/或其他商业化转染试剂，成本相对较低	尽管成本较低，但仍高于细菌表达系统

表2. 主要表达系统的优势与劣势。

讨论

我们开发了一种简单且成本低廉的方法（PEI 的成本远低于市售的脂质体转染试剂），用于从哺乳动物细胞中表达并纯化大量重组蛋白及多亚基复合物。若使用高纯度质粒 DNA（A260/A280 比值介于 1.8 至 2.0 之间）并按照方案部分所述与 PEI 联合使用，可达到最佳的转染和表达效率。细胞必须在无血清且无抗生素的培养基中培养，因此在传代和转染过程中必须严格采用无菌操作，以避免造成昂贵且耗时的污染感染。转染前细胞活力应达到 90% 或更高，且细胞密度不应超过 2.5 × 10⁶ 个细胞/mL，否则将降低蛋白产量。成功的转染要求培养物中仅含有单个或正在分裂的细胞。细胞聚集体可通过剧烈涡旋 20 至 30 秒来打散（图 5）。共转染中各质粒的使用比例可根据所研究复合物的化学计量比由使用者自行调整。可针对目标蛋白优化表达效率，从而确定合适的表达时间。纯化过程中应始终保持蛋白样品处于低温状态，以降低发生非预期蛋白水解降解的风险。标签的选择以及纯化缓冲液的组成至关重要，因为它们可能干扰某些蛋白的结构元件或活性位点，常导致溶解度降低和/或酶活性丧失。小规模转染特别适用于测试不同构建体，以优化大型蛋白复合物的纯化条件。

目前，已有多种替代方法可用于表达重组真核蛋白（表2）。例如，利用杆状病毒在昆虫细胞中进行表达，因其具有较高的转导效率，且相比其他病毒种类细胞毒性较低，因而被广泛使用⁶。然而，制备病毒的过程耗时较长，且病毒稳定性差，难以长期保存。另一方面，酵母表达系统可在发酵培养中将细胞培养至极高密度，从而获得较高的蛋白产量⁷。但酵母系统仍缺乏真核蛋白正确折叠及其与相互作用蛋白结合所必需的全部翻译后修饰类型。例如，HDAC3在E. coli中虽可表达，但无法正确折叠。然而，当其在293F细胞中表达时，我们成功纯化出具有活性的酶，并获得了其与共抑制因子（SMRT）以及一个四磷酸肌醇（IP4）分子形成的复合物，而IP4在原核细胞中并不存在⁸。该方法还使我们得以纯化并解析了HDAC1与NuRD复合物中的MTA1相互作用的晶体结构，该复合物同样由IP4激活⁹。理想情况下，我们始终希望在天然的生理环境中表达真核蛋白。已有研究报道使用生物反应器中的HEK 293-EBNA1细胞进行哺乳动物表达系统表达^10-12，可获得极高的蛋白产量，但该系统操作较为复杂。

我们的方法是一种简单且易于实施的替代方案，可用于细菌、酵母和生物反应器系统中的蛋白表达。该表达方法快速，且无需使用昂贵的设备，特别是当采用5% CO₂环境的滚瓶或摇瓶，并使用标准摇床培养箱时。我们已利用这些实验方案共转染多个质粒，并纯化了包含多达五种蛋白的复合物，产量超过>1 mg/L 培养液。有趣的是，该系统有助于识别稳定且性质良好的复合物。例如，HDAC1与Sin3A形成的二元复合物表达时蛋白产量较低，但加入SDS3后，产量提高了5倍，从而为结构生物学家在选择适合结晶的构建体和稳定复合物方面提供了指导。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FreeStyle HEK 293F 细胞	LifeTechnologies	R790-07
FreeStyle 293 表达培养基	LifeTechnologies	12338-018
Anti-FLAG M2 亲和凝胶	SIGMA	A220
250 ml 带通气盖的锥形瓶	Corning	431144
带通气盖的滚瓶	Corning	01836-02
聚乙烯亚胺（PEI），25 kDa，支化型	Sigma-Aldrich	408727	用 H2O 配制成 0.5 mg/ml 储存液，用稀盐酸调节 pH 至 7.0，并于 -20 至 4ºC 保存
哺乳动物表达载体
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（DPBS）	Sigma-Aldrich	D8537
0.22 µm 离心过滤单元	Amicon	UFC30GV00
15 ml 超速离心过滤器（10 kDa 截留分子量）	Amicon	UFC901008
Superdex  10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17-5175-01