球样细胞是克拉伯病（Krabbe disease）的一种特征性病理表现，克拉伯病是一种目前尚无有效长期疗法的脑白质营养不良症。我们建立了一种细胞培养模型，用于研究活化的小胶质细胞的固有生物学特性及其转化为球样细胞的致病潜能。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
多核小胶质细胞（称为球样细胞）在球样细胞脑白质营养不良（GLD）中枢神经系统中异常大量存在，但其确切功能尚不明确。这一知识空白主要受限于缺乏合适的 体外 用于研究的模型。本文中，我们描述了一种原代小鼠胶质细胞培养体系，其中经皂苷鞘醇（psychosine）处理后，小胶质细胞出现多核化，类似于异染性脑白质营养不良（GLD）中特征性的球状细胞。利用该新型体系，我们确定了球状细胞研究的实验条件与分析方法。该模型系统的潜在应用价值已在我们先前的研究中得到验证，该研究揭示了基质金属蛋白酶（MMP）-3在GLD中的潜在作用。这一新型 体外 该系统可能是研究这些独特细胞的形成与功能，以及潜在治疗干预手段的有用模型。
引言
异染性脑白质营养不良（GLD），也称为克拉伯病，是一种由于半乳糖脑苷脂酶（galc）基因功能丧失性突变引起的致命性脱髓鞘疾病1。GLD最常见的形式是婴儿型，其特征为早年发病，并表现出进行性运动和认知功能衰退的侵袭性临床病程，常在五岁前导致过早死亡2,3。基因检测可用于确诊GLD4。GLD的神经病理学表现为广泛脱髓鞘、神经元萎缩、星形胶质细胞增生，以及存在一种被称为异染性细胞的肿大、多核小胶质细胞5-7。在过去97年中，异染性细胞的识别——其胞质中常含有管状包涵体——一直是GLD的标志性特征，但这些显著细胞的具体功能至今仍不明确。
长期以来，人们认为非髓鞘形成性胶质细胞（小胶质细胞和星形胶质细胞）在异染性脑白质营养不良（GLD）发病机制中的作用是对该疾病中严重脱髓鞘的继发性反应8。有趣的是，Knud Krabbe 于1916年首次描述该疾病时5，报告了含有脂质碎片的多核吞噬细胞的形成，这类细胞被称为“球样细胞”（globoid cells），是该疾病的一个定义性特征。
异染性脑白质营养不良（GLD）病理的标志性特征是球样细胞，尽管长期以来这些细胞在GLD中的作用一直被忽视。有趣的是，这类细胞是GLD中枢神经系统组织中最早出现的特征性改变之一。这一认知的缺乏可能源于一种假设，即多核吞噬细胞（在其他疾病中称为巨细胞）的形成通常被视为病理过程的结果，而非初始的致病驱动因素。9因此，针对 globoid 细胞如何由吞噬细胞形成，尤其是在 GLD 中枢神经系统（CNS）中的形成机制，相关研究仍十分有限。本报告所述方法着重探讨 globoid 细胞在 CNS 中的形成过程及其重要性，以及我们先前关于 psychosine 诱导小胶质细胞多核化的研究发现 体外 这些细胞表现出更高的吞噬活性。与这些观察结果一致，提契病（twitcher）脑中的球状细胞常含有PAS阳性碎片，提示其具有较高的吞噬活性。球状细胞还被发现对铁蛋白（小胶质细胞标志物）呈免疫阳性。10，KP-1/CD68（单核细胞标志物），其中部分细胞还表达波形蛋白（vimentin，一种中间丝蛋白，星形胶质细胞和活化小胶质细胞的标志物）11，HLA-DRa（一种MHCII表面受体）和TNF-α7，以及Iba-1（一种用于鉴定小胶质细胞的钙结合蛋白）12根据这一组标志物，globoid细胞起源于具有独特表型的微胶质细胞。
尽管具有独特性，少突胶质细胞（GCs）在异染性脑白质营养不良（GLD）发病机制中的具体功能和作用长期以来一直被忽视。以往认为，球状细胞是慢性脱髓鞘的继发性结果。然而，过去对球状细胞与GLD脑白质病变时间关系的研究发现，在晚期胚胎至出生后早期阶段即可观察到球状细胞的存在，这一时期早于少突胶质细胞凋亡和明显脱髓鞘的发生13。因此，GLD神经病理学发展的时序表明，球状细胞的形成早于该疾病中的脱髓鞘过程14。这促使我们提出假设：GLD中球状细胞的早期形成可能代表一种决定性的致病事件，而非对少突胶质细胞损伤的继发性或反应性应答15。此外，在GLD中小胶质细胞活性的失调被认为限制了造血干细胞疗法长期疗效的因素之一16。因此，研究小胶质细胞及球状细胞在神经鞘脂（psychosine）刺激下的细胞功能及其调控机制，有望为GLD的发病机制提供新的认识。
直到最近，由于缺乏合适的研究模型来观察球状细胞的形成，导致科学界对这些细胞在异染性脑白质营养不良（GLD）病理过程中的确切功能和作用的理解受到限制。在近期的研究中，人们发现球状样细胞可在神经节苷脂醇（psychosine）——一种在GLD中积聚的致病性脂质毒素——的直接作用下形成。我们发现，在原代胶质细胞培养中，小胶质细胞会因psychosine的作用而被激活并转化为球状细胞，而巨噬细胞则不会发生此类转化15这种向globoid细胞的转化被发现由细胞外蛋白酶基质金属蛋白酶（MMP）-3介导。15最近，我们进一步拓展了这些发现，确定了在该模型中由心理活性物质激活的小胶质细胞和球样细胞的发展。 体外 模型系统中，半乳糖基鞘氨醇对少突胶质细胞和少突胶质前体细胞具有强烈毒性。因此，在异染性脑白质营养不良（GLD）的背景下，脱髓鞘发生前即出现的半乳糖基鞘氨醇早期积聚以及球样细胞的形成，提示小胶质细胞在该疾病中可能具有早期且潜在致病性的关键作用。
我们提出，对球状细胞形成的深入研究将揭示关于戈谢病（GLD）发病机制的新信息，从而增进对该疾病的理解。此外，这一新型的GLD细胞模型可能为探索针对该疾病病理变化的创新治疗策略提供新的实验平台。因此，本报告中我们提供了一套详细的方案 体外 非髓鞘形成胶质细胞原代培养中由神经鞘氨醇诱导的球样细胞的发育
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有涉及动物的操作均依照美国国立卫生研究院实验动物福利办公室（NIH）发布的《实验动物人道照护与使用政策》进行，并仅在康涅狄格大学健康中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准后实施。
1. 混合胶质细胞培养物的制备
- 使用前对所有器械进行灭菌。向三个无菌的60 mm培养皿中各加入3 ml冰上预冷的无菌Hank’s平衡盐溶液（HBSS），该溶液不含阳离子（Mg2+或Ca2+），并将培养皿置于冰上保持低温。
- 按照先前描述的方法分离出生后P0-P2天小鼠幼崽的皮层17,18。
注意：这些培养物不包含海马等皮层下结构。 - 小心去除脑膜，然后将分离的皮层组织转移至新鲜的HBSS中，并根据制造商提供的方案，使用神经组织解离试剂盒对组织进行酶解消化以实现细胞解离。
- 将细胞接种至无菌的T-175培养瓶中，在培养基[含10%胎牛血清（FBS）和1×青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）]中过夜培养。
- 次日更换全部培养基为新鲜培养基。继续培养细胞，定期更换培养基，持续约3周，直至形成单层细胞。
注意：该单层细胞主要由星形胶质细胞和小胶质细胞组成，比例约为10:119。
2. 混合胶质细胞培养中球样细胞的诱导
- 准备ECM包被的盖玻片。
- 用无菌的1 N盐酸（HCl）在无菌培养皿中浸泡圆形盖玻片30分钟。用无菌水洗涤盖玻片3次，然后在95%乙醇中浸泡至少20分钟，随后晾干。
- 将稀释后的细胞外基质（ECM）蛋白包被材料滴加到一张Parafilm膜上例如 将150–250 µl/滴、浓度为10 μg/ml的层粘连蛋白（laminin）溶解于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。分配液滴时，确保盖玻片放置后互不接触。使用镊子轻柔地将每片干燥的盖玻片置于液滴上。
- 将盖玻片留在培养罩内液滴上，关闭挡板，孵育约4-6小时。
- 将ECM包被的盖玻片（ECM包被面朝上）放入24孔板的各个孔中。每孔用无菌PBS洗涤3次，并于4 °C保存备用。
- 准备胶质细胞以接种到盖玻片上
- 吸弃胶质细胞培养物中的培养基，用 10 ml 无菌 PBS 轻柔洗涤胶质细胞单层，重复 3 次。随后向 T-175 培养瓶中加入 8–10 ml 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在 37 °C 下孵育 5–10 分钟。
- 当大部分单层细胞脱落时，向培养瓶中加入 20 ml 完全培养基以终止消化。收集含有脱落细胞的培养基至 50 ml 锥形离心管中，于室温下以 300 x g 离心 10 分钟。
- 吸弃上清液，避免扰动沉淀，然后用 P1000 移液器轻轻吹打，将细胞重悬于 2 ml 新鲜完全培养基中。
- 使用血细胞计数板确定细胞数量，然后将细胞重悬于完全培养基中，调整至所需密度（例如 105 细胞/ml）。将细胞接种至包被有细胞外基质（ECM）的盖玻片上（例如 将500 μl加入24孔板的每个孔中。每个孔中加入额外的新鲜完全培养基，在37 °C下培养3-5天，或培养至细胞达到预期的显微汇合度。
- 鞘氨醇-1-磷酸处理。
- 将心理素（psychosine）用二甲基亚砜（DMSO）重悬，配制成108.3 mM的储存液。将该储存液用100%乙醇（EtOH）稀释，制备工作液，随后加入24孔板的每孔中，使终浓度为10 μM。
- 添加心理素时，轻轻摇晃培养板，使心理素与培养基充分混匀。每隔一天补充相当于10 µM的心理素，持续一周。
- 经心理酮处理7天后，收集培养基，每孔加入500 µl冷的4%多聚甲醛（PFA），室温孵育20分钟以固定细胞。随后用PBS洗涤每孔3次，将培养板置于4 °C保存，待进行免疫细胞化学处理（见下文）。
注意：如有需要，此时可收集细胞培养基用于酶学检测或ELISA实验。
3. 免疫细胞化学（ICC）可视化观察球状细胞
- 用封闭缓冲液 [PBS + 0.3% Tween-20 + 5% 正常山羊血清（NGS）] 替换 PBS，室温孵育细胞 1 小时。
- 将固定后的细胞与 Iba-1 一抗 [用 PBS + 0.3% Tween-20 + 2% NGS 按 1:1,000 稀释] 在室温下孵育至少 1 小时，然后用 PBS 洗涤，每次 5 分钟，共洗 3 次。
- 加入合适的荧光标记二抗以识别一抗标记，并用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1:1,000）进行复染以标记细胞核。室温下在二抗溶液中孵育 1 小时，然后用 PBS 洗涤，每次 5 分钟，共洗 3 次。
- 用封片剂将每片盖玻片封固于显微镜载玻片上。在荧光显微镜下观察切片，进行定性和定量分析。
4. 原代培养中球状细胞的分析与表征
- 使用以下三个形态学标准在培养物中鉴定球状细胞：
- 使用荧光显微镜通过针对小胶质细胞标志物 Iba-1+ 的免疫阳性标记来鉴定球状细胞。
- 将球状细胞识别为多核的（即 包含两个或更多DAPI阳性细胞核）。
- 通过与静息态小胶质细胞高度分枝的形态相区分的圆形形态来识别globoid细胞。
注意：也可从这些培养物中收集细胞，用于流式细胞术分析和定量细胞表面标志物。
- 测量小胶质细胞和球样细胞的吞噬激活
- 为评估经心理素处理的小胶质细胞的吞噬活性，按照制造商说明书将FITC标记的乳胶微球加入孔板中。在用PFA固定前48小时加入荧光偶联乳胶微球。对经微球处理的细胞（如第2.4节所述）进行固定，并按第3节所述进行免疫细胞化学处理。
- 选择荧光素标记的二抗时，应确保其荧光发射光谱不与荧光微球的荧光发射光谱重叠。
- 通过鉴定与荧光标记微珠共定位的细胞，分析 Iba-1+ 小胶质细胞的吞噬特征。
注意：溶血鞘磷脂（psychosine）将激活小胶质细胞。在此培养条件下，吞噬的微珠将在单核和多核的 Iba-1+ 细胞内被识别。
5. 由纯化的小胶质细胞培养物诱导形成格子细胞
注意：另一种解析星形胶质细胞与小胶质细胞之间细胞间信号传导的方法也是本研究的优势之一 在 体外球状细胞模型。通过小胶质细胞在培养中较低的贴壁特性，可实现原代小胶质细胞的纯化，用于重铺板或共培养，具体步骤如下（见第5.2节）。
- 从融合的混合胶质细胞培养物中收集培养基至50 ml锥形管中，并在37 °C孵育器中保存。
- 原代混合胶质细胞培养物中小胶质细胞的分离
- 从融合的混合胶质细胞培养物 T175 培养瓶中移除培养基后，加入预热的振荡培养基［含完全培养基 + 25 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）+ 25 mM 碳酸氢钠（Sigma）］。将培养瓶置于37 °C、100 rpm的水平摇床中振荡3–4小时。收集振荡后的培养液至50 ml锥形管中。
注意：该培养基将包含从培养瓶中脱落的黏附性较差的微胶质细胞。 - 在室温下以 300 x g 离心 10 分钟。吸除上清液，然后将细胞重悬于 2 ml 星形胶质细胞条件培养基中（步骤 5.1 中收集）。
- 使用血细胞计数板确定所获得的细胞数量，然后将小胶质细胞接种至包被基质的盖玻片上（参见第2.1节），用于免疫细胞化学检测；或将细胞接种至超低黏附培养板中，以备后续收集球状细胞，用于与其他类型细胞（如少突胶质细胞）进行共培养（如下一节所述）。
注意：接种后的 microglia 可以按照上述方法用 psychosine（10 µM）处理（见第 2.3 节）。
- 从融合的混合胶质细胞培养物 T175 培养瓶中移除培养基后，加入预热的振荡培养基［含完全培养基 + 25 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）+ 25 mM 碳酸氢钠（Sigma）］。将培养瓶置于37 °C、100 rpm的水平摇床中振荡3–4小时。收集振荡后的培养液至50 ml锥形管中。
- 与原代少突胶质细胞共培养用于细胞毒性分析
注意：可从低黏附培养板中收集经心理素（psychosine）处理的小胶质细胞，并将其共培养至少突胶质细胞或少突胶质前体细胞的原代培养体系中，以检测这些类球状细胞可能具有的细胞毒性功能 体外.- 采用既定方法建立原代少突胶质细胞培养18,20. 为收集经psychosine处理的小胶质细胞，轻柔吹打以使贴壁不牢的细胞从孔板底部脱落。收集细胞后，以300 × g离心10分钟，然后小心地重悬于少突胶质细胞分化培养基中［由Neurobasal培养基、L-谷氨酰胺（1×）、B-27补充剂（1×）和三碘甲状腺原氨酸（T3，10 ng/ml）组成］。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数，然后以 1 x 10⁵ 个细胞/孔的密度将小胶质细胞接种至少突胶质细胞培养孔中5 细胞/ml，获得大约1:2的小胶质细胞/少突胶质细胞比例。共培养孵育最长3天。
- 进行免疫细胞化学固定（见第2.4节）。根据需要收集细胞培养上清液用于ELISA或化学分析。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本方案从开始到结束预计需要约36天才能完成（见图1：实验工作流程示意图）。根据我们的经验，该原代培养体系中“类球状”细胞的发育具有良好的可靠性和可重复性：在加入溶血脑苷脂处理7天后， consistently 观察到多核细胞的形成。
使用Iba-1进行小胶质细胞免疫细胞化学染色，并结合细胞核复染，可实现对体积较大、呈圆形的多核细胞的鉴定（图1b）。在某些情况下，这些类球状细胞中的核物质会呈现出明显的单个细胞核。然而，在多数情况下，细胞核体积的显著增大反映了这些细胞的多核状态（图1b）。类球状细胞的数量可能因视野不同而有所差异，但值得注意的是所形成的球状细胞的比例 体外 表示 <占小胶质细胞总体的5-10%。还需要指出的是，鞘氨醇治疗也会引发小胶质细胞的广泛性激活（即 在这些培养物中，单核小胶质细胞和多核的球样细胞（GCs）经psychosine处理后，吞噬活性出现可测量的增加。如图所示 图1c与少突胶质前体...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述方案提供了一种新的模型系统，用于研究活化的小胶质细胞和球样细胞的发育及其功能特征。此前，Im 等使用提供的 HEK293 细胞系为本实验方案的建立提供了模板，用于研究globoid细胞的形成21需要指出的是，该模型中衍生的球状细胞与在GLD中可识别的天然球状细胞存在差异。例如，我们在小鼠培养物中常规观察到小胶质细胞呈现四核现象，而在GLD中的球状细胞则常被观察到含有超过10个细胞核。其次，该模型中形成的球状细胞 体外 系统直径也比观察到的要小 体内表型差异的产生可能有多种原因，其中包括所使用的培养体系相对简单。例如，在采用该原代胶质细胞培养方法诱导形成球状细胞的过程中，并不存在神经元或少突胶质细胞。此外，七天实验方案的时间设置可产生较高密度的球状细胞；然而，延长处理时间可能进一步提高该方案所形成的鼠源球状细胞与戈谢病（GLD）中观察到的天然球状细胞特征之间的相似性。
该模型的一个重要特征是使用了包含星形胶质细胞和小胶质细胞的原代混合胶质细胞培养物15,19这一球状细胞模型在评估...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作部分得到了国家多发性硬化症协会（RG 5001-A-3，授予 S.J.C.）、美国国立卫生研究院（NS065808，授予 E.R.B.；NS078392，授予 S.J.C.）、康涅狄格大学健康中心启动资金（授予 S.J.C.）以及 Kim 家族基金（支持 K.I.C. 的康涅狄格大学健康中心）的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 不含阳离子（Mg2+ 和 Ca2+）的 Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）。 | Life technologies | 14175-095 | |
| 神经组织解离试剂盒 | Miltenyi | 130-092-628 | |
| 40 μm 细胞筛 | Fisherbrand | 22363547 | |
| 含阳离子（Mg2+ 和 Ca2+）的 Hank’s 平衡盐溶液（HBSS） | Gibco | 14025-092 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco | 11995-065 | |
| 胎牛血清（FBS） | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| 青霉素/链霉素 | Life technologies | 15070-063 | |
| 层粘连蛋白 | Sigma | L2020 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Life technologies | 25299-056 | |
| 心理酮（Psychosine） | Sigma | P9256 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma | D2650 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Electron Microscopy Science | 19208 | |
| 正常山羊血清（NGS） | Invitrogen | PCN5000 | |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 | |
| Alexa Fluor 标记的抗血清 | Life Technologies | Various | |
| 封片介质 | Southern Biotech | OB100-01 | |
| 吞噬功能检测试剂盒 | Cayman Chemicals | 500290 | |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
参考文献
- Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
- Duffner, P. K., et al. The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12. Genet Med. 11, Holiday Valley, New York. 450-454 (2008).
- Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. The Hunter's Hope Krabbe family database. Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).
- Duffner, P. K., et al. Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model. Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).
- Krabbe, K. A new familial, infantile form of brain sclerosis. Brain. 39, 74-114 (1916).
- Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging. Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).
- Itoh, M., et al. Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy. Brain Dev. 24, 284-290 (2002).
- Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy. PLoS One. 8, (2013).
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation. Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).
- Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia. Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).
- Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ. J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).
- Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy. J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).
- Pollanen, M. S., Brody, B. A. Fetal globoid cell leukodystrophy. Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).
- Martin, J. J., et al. Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases. Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).
- Ijichi, K., et al. MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology. Glia. , (2013).
- Pellegatta, S., et al. The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation. Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).
- Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells. Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. , (2013).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, 1187-1198 (2008).
- Moore, C. S., et al. Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination. J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).
- Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O'Dowd, B. F., Lynch, K. R. Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation. J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
