球样细胞是克拉伯病（Krabbe disease）的一种特征性病理表现，克拉伯病是一种目前尚无有效长期疗法的脑白质营养不良症。我们建立了一种细胞培养模型，用于研究活化的小胶质细胞的固有生物学特性及其转化为球样细胞的致病潜能。
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本文内容
摘要
摘要
多核小胶质细胞（称为球样细胞）在球样细胞脑白质营养不良（GLD）中枢神经系统中异常大量存在，但其确切功能尚不明确。这一知识空白主要受限于缺乏合适的 体外 用于研究的模型。本文中，我们描述了一种原代小鼠胶质细胞培养体系，其中经皂苷鞘醇（psychosine）处理后，小胶质细胞出现多核化，类似于异染性脑白质营养不良（GLD）中特征性的球状细胞。利用该新型体系，我们确定了球状细胞研究的实验条件与分析方法。该模型系统的潜在应用价值已在我们先前的研究中得到验证，该研究揭示了基质金属蛋白酶（MMP）-3在GLD中的潜在作用。这一新型 体外 该系统可能是研究这些独特细胞的形成与功能，以及潜在治疗干预手段的有用模型。
引言
异染性脑白质营养不良（GLD），也称为克拉伯病，是一种由于半乳糖脑苷脂酶（galc）基因功能丧失性突变引起的致命性脱髓鞘疾病1。GLD最常见的形式是婴儿型，其特征为早年发病，并表现出进行性运动和认知功能衰退的侵袭性临床病程，常在五岁前导致过早死亡2,3。基因检测可用于确诊GLD4。GLD的神经病理学表现为广泛脱髓鞘、神经元萎缩、星形胶质细胞增生，以及存在一种被称为异染性细胞的肿大、多核小胶质细胞5-7。在过去97年中，异染性细胞的识别——其胞质中常含有管状包涵体——一直是GLD的标志性特征，但这些显著细胞的具体功能至今仍不明确。
长期以来，人们认为非髓鞘形成性胶质细胞（小胶质细胞和星形胶质细胞）在异染性脑白质营养不良（GLD）发病机制中的作用是对该疾病中严重脱髓鞘的继发性反应8。有趣的是，Knud Krabbe 于1916年首次描述该疾病时5，报告了含有脂质碎片的多核吞噬细胞的形成，这类细胞被称为“球样细胞”（globoid cells），是该疾病的一个定义性特征。
异染性脑白质营养不良（GLD）病理的标志性特征是球样细胞，尽管长期以来这些细胞在GLD中的作用一直被忽视。有趣的是，这类细胞是GLD中枢神经系统组织中最早出现的特征性改变之一。这一认知的缺乏可能源于一种假设，即多核吞噬细胞（在其....
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方案
所有涉及动物的操作均依照美国国立卫生研究院实验动物福利办公室（NIH）发布的《实验动物人道照护与使用政策》进行，并仅在康涅狄格大学健康中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准后实施。
1. 混合胶质细胞培养物的制备
- 使用前对所有器械进行灭菌。向三个无菌的60 mm培养皿中各加入3 ml冰上预冷的无菌Hank’s平衡盐溶液（HBSS），该溶液不含阳离子（Mg2+或Ca2+），并将培养皿置于冰上保持低温。
- 按照先前描述的方法分离出生后P0-P2天小鼠幼崽的皮层17,18。
注意：这些培养物不包含海马等皮层下结构。 - 小心去除脑膜，然后将分离的皮层组织转移至新鲜的HBSS中，并根据制造商提供的方案，使用神经组织解离试剂盒对组织进行酶解消化以实现细胞解离。
- 将细胞接种至无菌的T-175培养瓶中，在培养基[含10%胎牛血清（FBS）和1×青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）]中过夜培养。
- 次日更换全部培养基为新鲜培养基。继续培养细胞，定期更换培养基，持续约3周，直至形成单层细胞。
注意：该单层细胞主要由星形胶质细胞和小胶质细胞组成，比例约为10:119。
2. 混合胶质细胞....
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结果
本方案从开始到结束预计需要约36天才能完成（见图1：实验工作流程示意图）。根据我们的经验，该原代培养体系中“类球状”细胞的发育具有良好的可靠性和可重复性：在加入溶血脑苷脂处理7天后， consistently 观察到多核细胞的形成。
使用Iba-1进行小胶质细胞免疫细胞化学染色，并结合细胞核复染，可实现对体积较大、呈圆形的多核细胞的鉴定（图1b）。在某些情况下，这些类球状细胞中的核物质会呈现出明显的单个细胞核。然而，在多数情况下，细胞核体积的显著增大反映了这些细胞的多核状态（图1b）。类球状细胞的数量可能因视野不同而有所差异，但值得注意的是所形成的球状细胞的比例 体外 表示 <占小胶质细胞总体的5-10%。还需要指出的是，鞘氨醇治疗也会引发小胶质细胞的广泛性激活（即 在这些培养物中，单核小胶质细胞和多核的球样细胞（GCs）经psychosine处理后，吞噬活性出现可测量的增加。如图所示 图1c与少突胶质前体.......
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讨论
本文所述方案提供了一种新的模型系统，用于研究活化的小胶质细胞和球样细胞的发育及其功能特征。此前，Im 等使用提供的 HEK293 细胞系为本实验方案的建立提供了模板，用于研究globoid细胞的形成21需要指出的是，该模型中衍生的球状细胞与在GLD中可识别的天然球状细胞存在差异。例如，我们在小鼠培养物中常规观察到小胶质细胞呈现四核现象，而在GLD中的球状细胞则常被观察到含有超过10个细胞核。其次，该模型中形成的球状细胞 体外 系统直径也比观察到的要小 体内表型差异的产生可能有多种原因，其中包括所使用的培养体系相对简单。例如，在采用该原代胶质细胞培养方法诱导形成球状细胞的过程中，并不存在神经元或少突胶质细胞。此外，七天实验方案的时间设置可产生较高密度的球状细胞；然而，延长处理时间可能进一步提高该方案所形成的鼠源球状细胞与戈谢病（GLD）中观察到的天然球状细胞特征之间的相似性。
该模型的一个重要特征是使用了包含星形胶质细胞和小胶质细胞的原代混合胶质细胞培养物15,19这一球状细胞模型在评估.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作部分得到了国家多发性硬化症协会（RG 5001-A-3，授予 S.J.C.）、美国国立卫生研究院（NS065808，授予 E.R.B.；NS078392，授予 S.J.C.）、康涅狄格大学健康中心启动资金（授予 S.J.C.）以及 Kim 家族基金（支持 K.I.C. 的康涅狄格大学健康中心）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 不含阳离子（Mg2+ 和 Ca2+）的 Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）。 | Life technologies | 14175-095 | |
| 神经组织解离试剂盒 | Miltenyi | 130-092-628 | |
| 40 μm 细胞筛 | Fisherbrand | 22363547 | |
| 含阳离子（Mg2+ 和 Ca2+）的 Hank’s 平衡盐溶液（HBSS） | Gibco | 14025-092 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco | 11995-065 | |
| 胎牛血清（FBS） | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| 青霉素/链霉素 | Life technologies | 15070-063 | |
| 层粘连蛋白 | Sigma | L2020 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Life technologies | 25299-056 | |
| 心理酮（Psychosine） | Sigma | P9256 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma | D2650 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Electron Microscopy Science | 19208 | |
| 正常山羊血清（NGS） | Invitrogen | PCN5000 | |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 | |
| Alexa Fluor 标记的抗血清 | Life Technologies | Various | |
| 封片介质 | Southern Biotech | OB100-01 | |
| 吞噬功能检测试剂盒 | Cayman Chemicals | 500290 | |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
参考文献
- Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
- Duffner, P. K., et al.
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重印与许可
