采用细胞刷取样法从宫颈管收集淋巴细胞和单核细胞是一种微创技术，可获取用于女性生殖道免疫研究的样本。在本方案中，我们描述了细胞刷样本的采集以及用于流式细胞术检测的免疫细胞分离方法。
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本文内容
摘要
摘要
尽管黏膜病原体（包括 HIV）具有重要的公共卫生意义，但人们对黏膜免疫系统，尤其是女性生殖道（FGT）的免疫机制仍知之甚少。由于异性性传播目前已成为 HIV 传播的主要途径，加之性传播感染（STIs）持续扩散，深入了解宿主与病原体在生殖道黏膜界面的相互作用显得尤为关键。目前关于女性生殖道免疫的知识仍存在显著空白，部分原因在于成功采集和处理黏膜样本存在技术困难。为了推动具备足够样本量的研究，样本采集技术必须尽可能无创且高效。为此，已优化了一种用于采集宫颈细胞刷样本并进一步分离宫颈单个核细胞（CMC）的操作方案。通过基于离体（ex vivo）流式细胞术的免疫表型分析，可准确、可靠地定量分析 CMC 中淋巴细胞/单核细胞的群体频率及表型特征。该技术可与宫颈阴道灌洗液（CVL）的采集相结合，CVL 中含有可溶性免疫介质，包括细胞因子、趋化因子和抗蛋白酶，这些成分均可用于评估阴道内抗炎或促炎的免疫微环境。
引言
全球大多数新发 HIV 感染通过异性传播途径发生，其中女性占 2011 年新发感染病例的 47%（UNAIDS1）。了解女性生殖道（FGT）——HIV 及其他性传播病原体的主要入侵门户之一——对于开发有效的感染预防策略至关重要。生殖道黏膜的免疫应答明显具有独特性，与外周血中检测到的免疫应答存在差异2。然而，目前对 FGT 局部免疫动态的认识仍极为有限。迄今为止，关于黏膜免疫环境的研究主要集中于肠道相关淋巴组织（GALT），在该部位已明确感染后黏膜组织中的早期事件对后续疾病进展具有显著影响3,4。采集生殖道黏膜样本面临巨大挑战，这至少部分导致了人们对 FGT 免疫学机制的理解不足。要解析宿主与病原体在 FGT 这一独特环境中的免疫动态关系，必须建立高效的方法以采集并分析来自该部位的样本。
女性生殖道（FGT）分为两个部分：上生殖道包括输卵管、子宫内膜和子宫内宫颈，下生殖道则包含子宫外宫颈和阴道（Kaushic 等5综述）。目前尚不明确这些不同部位在HIV感染中各自所占的相对贡献，但认为这两个部位均可能参与HIV的入侵6。T细胞占上、下生殖道白细胞的40-50%，而巨噬细胞约占10%（Rodriguez-Garcia 等2综述）。T细胞可在阴道、宫颈和子宫内膜中被检测到。巨噬细胞在子宫内膜和子宫肌层结缔组织中的分布....
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方案
伦理声明：本研究已获得曼尼托巴大学和肯尼亚塔国家医院/内罗毕大学研究伦理委员会的批准，并已从所有研究参与者处获得书面知情同意。
1. 培养基和CMC收集管的制备
- 制备磷酸盐缓冲液（PBS）溶液（137.93 mM NaCl、2.67 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4、1.47 mM KH2PO4）。经高压灭菌以确保无菌。该溶液可在 4 ºC 下保存数月。
- 将 5 ml PBS 预先分装至 50 ml 离心管中（每个待采集样本对应一管），并在 4 ºC 下保存至样本采集时使用。
- 为每个样本标记 2–4 个冻存管或 1.5 ml 微量离心管，用于收集并储存灌洗液。
- 配制细胞培养基：RPMI 1640 加 1% 青霉素/链霉素/两性霉素 B（终浓度分别为 100 单位/ml、100 μg/ml 和 250 ng/ml，不添加 FCS/FBS）。
2. 胞刷样本的采集
使用细胞刷采集样本是一种无创操作，必须由经过培训的医生或妇科医生进行。
- 使用细胞刷和木制或塑料刮片采集宫颈单个核细胞（CMC）。在扩阴器检查下，将刮片插....
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结果
多参数流式细胞术是一种强大的工具，可用于解析先前未表征组织中细胞亚群的表型和功能。通过适当的设门策略分析CMC样本，可以获得有关淋巴细胞和单核细胞群体的信息。
代表性的心肌细胞（CMC）门控策略与匹配的外周血单个核细胞（PBMC）图谱的比较如图2所示。通过前向散射面积（FSC-A）与前向散射高度（FSC-H）图可排除细胞双联体，这些双联体在CMC样本中较PBMC更为常见，即使经过滤处理后仍大量存在（图2A）。质量控制包括根据时间进行门控以排除流速异常问题，流速变化或因样本聚集引起的伪影可由此轻松识别（图2B）。淋巴细胞/单核细胞群体的鉴定在PBMC和CMC样本中相对相似（图2B）。通过活性染料排除死细胞，可防止非特异性摄取荧光抗体偶联物的凋亡细胞被纳入分析。CMC样本的细胞活性低于PBMC样本，且样本间活性差异可能较大（图2B）。
本分析将重点关注T淋巴细胞群.......
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讨论
鉴于目前对女性生殖道（FGT）免疫功能的认识仍存在较大空白，对宫颈单个核细胞（CMC）进行表型分析，可深入了解宫颈部位多种淋巴细胞群体的特征。结合宫颈灌洗液中的蛋白质组学分析和病毒载量检测，能够在不同人群中深入解析针对性传播感染（STI）及其他病原体的免疫应答机制。
技术注意事项 - 宫颈黏液细胞（CMCs）： 宫颈黏液细胞样本的分离与成功染色可能具有挑战性。对宫颈黏液细胞采集方案的优化表明，优先采集宫颈阴道灌洗液（CVL），随后使用宫颈刮匙，最后使用宫颈刷进行采集，效果更佳。由于存在多种可能导致样本被排除的因素（如下所述），与外周血研究相比，应增加计划的样本量。
在启动研究之前，必须使用CMC样本对所需的流式检测方案进行测试。监测CMC样本中的细胞自发荧光非常重要，尤其是在单核细胞门控区域。某些通道中CMC的自发荧光可能较PBMC更高，这可能影响门控策略以及信号与噪声的比值。此外，若电压参数先前是在PBMC样本上确定的，则应在CMC样本上重新验证其最佳电压设置。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢内罗毕大学研究项目临床主任 Joshua Kimani 在与本方案相关的黏膜免疫学研究中提供的协助。作者谨此致谢加拿大健康研究院（CHVI）基金项目 MOP 86721 提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 用于50 ml Falcon管的100 μm细胞筛 | BD | 352360 | CMC处理 |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC处理 |
| 胎牛血清 | Life technology | 16000044 | CMC处理 |
| 两性霉素B（Fungizone） | Life technology | 15290-018 | CMC处理 |
| 青霉素/链霉素 | Sigma | P4333-20ml | CMC处理 |
| 50 ml Falcon管 | Fisher | 14-959-49A | CMC处理 |
| 血库一次性转移吸管 | Fisher | 13-711-6M | CMC处理 |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC取样 |
| 一次性宫颈刮片器 | Quick medical | 2183 | CMC取样 |
| 15 ml Falcon管 | Fisher | 14-959-70c | CVL处理 |
| 1.5 ml Eppendorf管 | Fisher | 05-402-18 | CVL储存 |
| LIVE/DEAD可固定细胞染色试剂盒 | Invitrogen | Various | 流式细胞术试剂 |
| 固定缓冲液（4% PFA） | BD | 554655 | 流式细胞术试剂 |
| 小鼠IgG | Sigma | I8765 | 流式细胞术试剂 |
参考文献
- UNAIDS. Global Report 2013. http://www.unaids.org/en/media/unaids/contentassets/documents/epidemiology/2013/gr2013/UNAIDS_Global_Report_2013_en.pdf. , (2013).
- Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R.
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重印与许可
