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方法文章

人子宫颈管样本的采集、分离及流式细胞术分析

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DOI：

10.3791/51906

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2014年7月6日

 ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology, University of Manitoba, 2Department of Community Health Sciences, University of Manitoba

本文内容

摘要

采用细胞刷取样法从宫颈管收集淋巴细胞和单核细胞是一种微创技术，可获取用于女性生殖道免疫研究的样本。在本方案中，我们描述了细胞刷样本的采集以及用于流式细胞术检测的免疫细胞分离方法。

摘要

尽管黏膜病原体（包括 HIV）具有重要的公共卫生意义，但人们对黏膜免疫系统，尤其是女性生殖道（FGT）的免疫机制仍知之甚少。由于异性性传播目前已成为 HIV 传播的主要途径，加之性传播感染（STIs）持续扩散，深入了解宿主与病原体在生殖道黏膜界面的相互作用显得尤为关键。目前关于女性生殖道免疫的知识仍存在显著空白，部分原因在于成功采集和处理黏膜样本存在技术困难。为了推动具备足够样本量的研究，样本采集技术必须尽可能无创且高效。为此，已优化了一种用于采集宫颈细胞刷样本并进一步分离宫颈单个核细胞（CMC）的操作方案。通过基于离体（ex vivo）流式细胞术的免疫表型分析，可准确、可靠地定量分析 CMC 中淋巴细胞/单核细胞的群体频率及表型特征。该技术可与宫颈阴道灌洗液（CVL）的采集相结合，CVL 中含有可溶性免疫介质，包括细胞因子、趋化因子和抗蛋白酶，这些成分均可用于评估阴道内抗炎或促炎的免疫微环境。

引言

全球大多数新发 HIV 感染通过异性传播途径发生，其中女性占 2011 年新发感染病例的 47%（UNAIDS1）。了解女性生殖道（FGT）——HIV 及其他性传播病原体的主要入侵门户之一——对于开发有效的感染预防策略至关重要。生殖道黏膜的免疫应答明显具有独特性，与外周血中检测到的免疫应答存在差异2。然而，目前对 FGT 局部免疫动态的认识仍极为有限。迄今为止，关于黏膜免疫环境的研究主要集中于肠道相关淋巴组织（GALT），在该部位已明确感染后黏膜组织中的早期事件对后续疾病进展具有显著影响3,4。采集生殖道黏膜样本面临巨大挑战，这至少部分导致了人们对 FGT 免疫学机制的理解不足。要解析宿主与病原体在 FGT 这一独特环境中的免疫动态关系，必须建立高效的方法以采集并分析来自该部位的样本。

女性生殖道（FGT）分为两个部分：上生殖道包括输卵管、子宫内膜和子宫内宫颈，下生殖道则包含子宫外宫颈和阴道（Kaushic 等5综述）。目前尚不明确这些不同部位在HIV感染中各自所占的相对贡献，但认为这两个部位均可能参与HIV的入侵6。T细胞占上、下生殖道白细胞的40-50%，而巨噬细胞约占10%（Rodriguez-Garcia 等2综述）。T细胞可在阴道、宫颈和子宫内膜中被检测到。巨噬细胞在子宫内膜和子宫肌层结缔组织中的分布比宫颈更为集中，尽管在两种组织中均可检测到。最后，浆细胞样树突状细胞（pDCs）和朗格汉斯细胞也可在FGT组织中被检测到。免疫细胞群体的表型、比例及其对HIV感染的易感性可能根据激素周期、激素类避孕药的使用、细菌性阴道病或性活动而发生重要变化5,7-9。

已开发出多种方法用于研究女性生殖道（FGT）的免疫细胞群体及其微环境。在现有文献中，最常用的方法包括宫颈活检、宫颈细胞刷取以及宫颈阴道灌洗液（CVL）10-12。其中，采用磷酸盐缓冲液（PBS）进行灌洗收集CVL是最简单的方法，可用于研究免疫调节蛋白，但其细胞得率极低，因此不适合用于分析FGT中的免疫细胞群体13。然而，CVL样本在评估FGT免疫环境方面具有重要价值，可通过ELISA、细胞因子磁珠阵列14或质谱分析15,16等方法检测多种细胞因子、趋化因子或抗菌因子的表达水平。通过宫颈细胞刷或宫颈活检获取宫颈单个核细胞（CMC），则可实现对免疫细胞频率、表型及功能的详细表征。

宫颈活检取样是一种侵入性方法，会增加不适感和出血风险，术后愈合时间根据女性的免疫状态不同，需2至11天12。相比之下，尽管宫颈细胞刷取法收集的细胞数量较少，但其侵入性更小，且更便于从女性生殖道（FGT）获取免疫细胞。两种方法均可获得相当数量的CD45+白细胞，但需要连续使用两次宫颈细胞刷才能达到一次活检所获取的细胞量13。尽管如此，细胞刷取样仍能提供足够数量的细胞（约每支细胞刷5,000个CD45+细胞），可用于后续通过流式细胞术进行体外（ex vivo）表型分析14。此外，这些样本还可用于功能特性鉴定，已有研究通过对细胞刷获取的宫颈黏膜细胞（CMC）进行刺激处理，并应用胞内流式细胞术或定量PCR（qPCR），以鉴定HIV特异性免疫应答17或Th细胞极化状态18。T细胞群体的扩增也可能有助于利用CMCs开展功能研究19。

需要注意的是，活检和细胞刷取样采集的是女性生殖道（FGT）的不同部位。活检样本来源于宫颈阴道部上皮和间质的上部区域12,13，而宫颈细胞刷则采集宫颈口部位，收集来自子宫颈管柱状上皮以及可能来自转化区的细胞。因此，细胞刷样本来源于单层柱状上皮构成的区域，而活检样本则包含由复层鳞状上皮衬覆的区域5。由于上述解剖学差异，通过宫颈活检与细胞刷所获取的白细胞群体特征也有所不同。活检获取的样本中CD3+ T细胞比例较高，而细胞刷样本中CD14+单核细胞/巨噬细胞的比例更高13。

多年来，女性生殖道（FGT）免疫学的研究一直备受关注20-22，我们在宫颈细胞刷获取的宫颈黏膜细胞（CMC）研究方面已积累了丰富的经验。我们的研究主要集中在来自肯尼亚内罗毕的HIV感染者、未感染者以及HIV暴露但血清阴性（HESN）的女性性工作者。HIV优先在活化的T细胞中复制23，而女性生殖道中可被HIV靶向的活化细胞数量较少，可能有助于防止HIV感染。支持这一假说的多项研究表明，在高度暴露于HIV但仍保持未感染状态的HESN性工作者中，其免疫活化水平较低24,25，这种静息表型在女性生殖道中同样被观察到14。本文中，我们描述了通过体外（ex vivo）流式细胞术对宫颈细胞刷获取的CMC样本中T细胞活化状态进行处理和评估的方法。

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方案

伦理声明：本研究已获得曼尼托巴大学和肯尼亚塔国家医院/内罗毕大学研究伦理委员会的批准，并已从所有研究参与者处获得书面知情同意。

1. 培养基和CMC收集管的制备

  1. 制备磷酸盐缓冲液（PBS）溶液（137.93 mM NaCl、2.67 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4、1.47 mM KH2PO4）。经高压灭菌以确保无菌。该溶液可在 4 ºC 下保存数月。
  2. 将 5 ml PBS 预先分装至 50 ml 离心管中（每个待采集样本对应一管），并在 4 ºC 下保存至样本采集时使用。
  3. 为每个样本标记 2–4 个冻存管或 1.5 ml 微量离心管，用于收集并储存灌洗液。
  4. 配制细胞培养基：RPMI 1640 加 1% 青霉素/链霉素/两性霉素 B（终浓度分别为 100 单位/ml、100 μg/ml 和 250 ng/ml，不添加 FCS/FBS）。

2. 胞刷样本的采集

使用细胞刷采集样本是一种无创操作，必须由经过培训的医生或妇科医生进行。

  1. 使用细胞刷和木制或塑料刮片采集宫颈单个核细胞（CMC）。在扩阴器检查下，将刮片插入并围绕宫颈外口旋转，从受试者采集CMC（图1）。将细胞刷插入宫颈管内口，旋转360°，随后立即将细胞刷和刮片放入含有5 ml PBS的50 ml Falcon管中。
  2. 样本采集后应置于冰上或4 ºC保存直至处理。为保持细胞活性，应在采集后2小时内完成样本处理 。
  3. 如条件允许，可同时采集配对的外周血样本至绿色头盖的肝素真空采血管中，用于外周血单个核细胞（PBMC）的分离，作为CMC分析的对照或比较组。

3. CMCs 的分离

在生物安全二级实验室的无菌生物安全柜中，佩戴双层手套进行样本处理。

  1. 收集过程中，宫颈黏液细胞（CMC）样本可能被血液污染。为防止外周血单个核细胞（PBMC）混入最终样本造成干扰，应将可见血液污染的样本排除在研究之外。由于CMC样本中分离的淋巴细胞数量较少，即使轻微的血液污染也可能完全掩盖CMC中的淋巴细胞成分。
  2. 将含有细胞刷和刮匙的离心管在涡旋振荡器上振荡45秒 ，以使细胞从刷头上脱落。此过程中样本可能产生泡沫，属正常现象。
  3. 使用细胞刷从刮匙上刮下残留物质，随后将刮匙弃入含漂白液的容器中。为收集仍附着在刷头/刮匙上的细胞，使用一副新的手套，用拇指和食指挤压刮匙部分，沿刷头滑动，使细胞和磷酸盐缓冲液（PBS）一同收集至同一50 ml离心管中。将细胞刷弃入漂白液中，同时丢弃手套。
    重要提示：每个样本必须使用一副新手套。
  4. 将一个100 μm 尼龙细胞滤网安装于一个新的50 ml 离心管上。使用移液管吸取样本管中的PBS-细胞悬液，经滤网过滤至新管中。
  5. 向原始样本管中加入5 ml RPMI 1640培养基。使用移液管将培养基沿管壁冲洗样本管内壁，并将冲洗液通过滤网转移至新的收集管中。同时用RPMI冲洗尼龙滤网底部。
  6. 将样本在514 × g条件下离心10分钟。此步骤中必须关闭离心机刹车，以防止CMC沉淀物被扰动。
  7. 小心吸除上清液，注意不要扰动沉淀。沉淀大小差异较大；某些样本中因含有大量上皮细胞而沉淀明显，而在其他样本中沉淀可能极小、几乎不可见且高度透明。
  8. 通过轻柔振荡离心管使沉淀重悬。加入5 ml PBS洗涤样本。
  9. 再次以514 × g离心10分钟，离心过程中仍需关闭刹车。
  10. 小心弃去上清液，并按上述方法重新悬浮沉淀。细胞此时可用于冷冻保存（采用PBMC冷冻保存方案）、刺激实验或流式细胞术表型分析。

4. CMC 表面染色与流式细胞术

  1. 将步骤 3.10 中的沉淀物重悬于 100 μl 封闭液中，并转移至 96 孔板或流式管中。封闭液（用于封闭 Fcγ 受体）的配制方法如下：1.8 μl 小鼠 IgG（终浓度为 0.2 μg/μl）、5 μl FBS 和 93.2 μl FACS 洗涤液（PBS + 2% FBS）。若沉淀量较小，可在 96 孔板中进行染色；若沉淀量通常较大，则需在流式管中进行染色。应根据实际情况对抗体进行滴定。
  2. 将样品在冰上/4 °C 条件下封闭 10 min 。
  3. 用 100 μl FACS 洗涤液（PBS + 2% FBS）在 96 孔板中洗涤细胞，或在流式管中使用 500 μl 。在 4 °C 条件下以 600 × g 离心 10 min，刹车设置为低档（或若无低档选项则关闭刹车）。
  4. 弃去上清液，通过振荡重悬细胞沉淀。加入活性染料（Live Dead 可固定活力染料）。按照制造商说明书配制活力染料。该染料可能需要根据各实验室或流式细胞仪的具体配置进行滴定。在 4 °C 避光孵育 30 min 。
  5. 用 100 μl / 500 μl PBS（分别对应 96 孔板 / 流式管）洗涤细胞。在 4 °C 条件下以 600 × g 离心 10 min ，使用低档或无刹车。弃去上清液后重悬细胞。
  6. 将细胞与表面标志物抗体混合液在总体积为 100 μl 的条件下孵育。重要提示：在对样品进行染色前，应优化并滴定每一流式细胞术检测面板。在 4 °C 避光孵育 30 min 。
  7. 若在 96 孔板中染色，则重复步骤 4.5；随后将细胞转移至流式管中，并用含 1% 多聚甲醛（PFA）的 FACS 洗涤液（或按 1:4 稀释的 CytoFix）定容至终体积 750 µl。立即在流式细胞仪上进行数据采集。

5. 宫颈阴道灌洗液（CVL）的采集与制备

  1. 在使用细胞刷采样前，用注射器将2 ml无菌PBS冲洗宫颈管，并从后穹窿处吸出灌洗液。
  2. 将吸出的灌洗液样本收集至15 ml Falcon管中，置于冰上或4 ºC保存，直至处理。
  3. 以400 × g离心7 min 以去除细胞碎片。
  4. 收集上清液，将样本分装为1 ml 或500 μl 的等分试样，储存于-70 °C。分装样本可用于ELISA或微球阵列法检测阴道宫颈分泌物（CVL）蛋白，但应避免反复冻融。
  5. 如需要，可将细胞碎片沉淀重悬于RNA Later中，并按照试剂盒说明书操作，用于RNA表达水平检测。

6. 数据采集

  1. 准备一组与抗体组合相匹配的补偿管，运行这些补偿管以调整光谱重叠。使用任何配置了该抗体组合所用荧光染料标记抗体的多色流式细胞仪来检测样本。
  2. 首先获取一份外周血单个核细胞（PBMC）样本，用于调整前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）电压，以便识别淋巴细胞群。尽量使两者的值在直线刻度上均保持在100左右。运行PBMC对照样本将显著有助于定位CMC样本中的淋巴细胞群。
  3. 由于在低FSC值时沿SSC轴出现弥散现象，CMC样本的FSC阈值可能需要比PBMC样本更高。
  4. 在上机前对每管样本进行涡旋振荡。采集整管样本以最大化收集到的淋巴细胞门控事件数量。密切监控仪器运行状态，避免发生堵塞。
  5. 将数据导出至流式细胞分析软件（如FlowJo）中进行分析。

7. 门控策略

  1. 选择前向散射高（FSC-H）与前向散射面积（FSC-A）以确定单细胞群体。
  2. 选择时间与荧光标记物（例如 FITC）的关系图以监控采集质量。流速变化可能在数据中引入伪影，应排除显示流速不一致的任何区域。
  3. 在侧向散射面积（SSC-A）与前向散射面积（FSC-A）图上识别淋巴细胞群体。可使用外周血单个核细胞（PBMC）对照以辅助识别。注意，CMC 中的淋巴细胞群体可能不如 PBMC 对照清晰。
  4. 对 SSC-A 与活细胞染料进行设门，以将死细胞从活细胞中排除。死细胞可能非特异性结合抗体，从而引入伪影。
  5. 对 SSC-A 与 CD3 进行设门以识别 T 细胞群体。在此门内进一步区分 CD4+ 和 CD8+ 亚群。

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结果

多参数流式细胞术是一种强大的工具，可用于解析先前未表征组织中细胞亚群的表型和功能。通过适当的设门策略分析CMC样本，可以获得有关淋巴细胞和单核细胞群体的信息。

代表性的心肌细胞（CMC）门控策略与匹配的外周血单个核细胞（PBMC）图谱的比较如图2所示。通过前向散射面积（FSC-A）与前向散射高度（FSC-H）图可排除细胞双联体，这些双联体在CMC样本中较PBMC更为常见，即使经过滤处理后仍大量存在（图2A）。质量控制包括根据时间进行门控以排除流速异常问题，流速变化或因样本聚集引起的伪影可由此轻松识别（图2B）。淋巴细胞/单核细胞群体的鉴定在PBMC和CMC样本中相对相似（图2B）。通过活性染料排除死细胞，可防止非特异性摄取荧光抗体偶联物的凋亡细胞被纳入分析。CMC样本的细胞活性低于PBMC样本，且样本间活性差异可能较大（图2B）。

本分析将重点关注T淋巴细胞群...

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讨论

鉴于目前对女性生殖道（FGT）免疫功能的认识仍存在较大空白，对宫颈单个核细胞（CMC）进行表型分析，可深入了解宫颈部位多种淋巴细胞群体的特征。结合宫颈灌洗液中的蛋白质组学分析和病毒载量检测，能够在不同人群中深入解析针对性传播感染（STI）及其他病原体的免疫应答机制。

技术注意事项 - 宫颈黏液细胞（CMCs）： 宫颈黏液细胞样本的分离与成功染色可能具有挑战性。对宫颈黏液细胞采集方案的优化表明，优先采集宫颈阴道灌洗液（CVL），随后使用宫颈刮匙，最后使用宫颈刷进行采集，效果更佳。由于存在多种可能导致样本被排除的因素（如下所述），与外周血研究相比，应增加计划的样本量。

在启动研究之前，必须使用CMC样本对所需的流式检测方案进行测试。监测CMC样本中的细胞自发荧光非常重要，尤其是在单核细胞门控区域。某些通道中CMC的自发荧光可能较PBMC更高，这可能影响门控策略以及信号与噪声的比值。此外，若电压参数先前是在PBMC样本上确定的，则应在CMC样本上重新验证其最佳电压设置。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢内罗毕大学研究项目临床主任 Joshua Kimani 在与本方案相关的黏膜免疫学研究中提供的协助。作者谨此致谢加拿大健康研究院（CHVI）基金项目 MOP 86721 提供的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
用于50 ml Falcon管的100 μm细胞筛BD352360CMC处理
RPMI 1640HycloneSH30027.01CMC处理
胎牛血清Life technology16000044CMC处理
两性霉素B（Fungizone）Life technology15290-018CMC处理
青霉素/链霉素SigmaP4333-20mlCMC处理
50 ml Falcon管Fisher14-959-49ACMC处理
血库一次性转移吸管Fisher13-711-6MCMC处理
Cytobrush plusCooper surgicalC0121CMC取样
一次性宫颈刮片器Quick medical2183CMC取样
15 ml Falcon管Fisher14-959-70cCVL处理
1.5 ml Eppendorf管Fisher05-402-18CVL储存
LIVE/DEAD可固定细胞染色试剂盒InvitrogenVarious流式细胞术试剂
固定缓冲液（4% PFA）BD554655流式细胞术试剂
小鼠IgGSigmaI8765流式细胞术试剂

参考文献

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