肉毒神经毒素是A类生物威胁剂中最剧烈的毒素之一，但目前尚无可用的暴露后治疗方法。高内涵成像方法是一种用于发现新型抑制剂的强大技术，因为它能够利用具有生物学相关性的运动神经元（该毒素的主要作用靶点）进行多参数筛选。
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摘要
摘要
突触小体相关蛋白-25（SNAP-25）是可溶性 NSF 附着蛋白受体（SNARE）复合物的组成部分，对突触神经递质的释放至关重要。A 型肉毒神经毒素（BoNT/A）是一种锌依赖性金属蛋白酶，通过切割 SNARE 复合物中的 SNAP-25 组分来阻断神经递质的胞吐作用。目前，在毒素被运动神经元内化后，尚无获批用于治疗 BoNT/A 中毒的药物。由于缺乏可用于筛选小分子文库的高效高通量检测方法，针对 BoNT/A 中毒的有效治疗措施的开发受到一定限制。本文描述了一种高内涵成像（HCI）检测方法，可用于鉴定 BoNT/A 抑制剂。初步优化工作集中在提高多个独立实验中不同微孔板之间结果的可重复性。自动化免疫染色、图像采集和图像分析被证明可提高检测的一致性，减少变异，并能够在小鼠运动神经元系统中对实验化合物进行多参数评估。
引言
细菌 Clostridium botulinum 可产生肉毒杆菌神经毒素（Botulinum neurotoxin），这是目前已知对人类毒性最强的生物毒素之一1。该毒素存在7种不同的血清型（BoNT/A-G）。BoNT/A-G 均可通过裂解 SNARE 复合物导致神经肌肉接头处发生麻痹2,3。SNARE 蛋白的裂解会阻止神经递质囊泡与细胞膜的融合，从而抑制神经递质的胞吐作用4。具体的 SNARE 蛋白靶点取决于参与中毒过程的特定 BoNT 血清型。BoNT/A 和 BoNT/E 可切割 SNAP-25，而 BoNT/C 可同时切割 SNAP-25 和 syntaxin5。其余血清型则切割 synaptobrevin（也称为囊泡相关膜蛋白（VAMP））。本研究选择 BoNT/A 作为检测方法开发的对象，因其在自然发生的肉毒中毒病例中占比较高，且其作用持续时间最长6。针对 BoNT/A 开发小分子治疗药物是我们药物发现项目的重要目标，此前已采用传统的基于靶点的方法筛选出可抑制其活性位点蛋白水解活性的抑制剂7,8-10。然而，开发出具有广谱活性、可作用于多种血清型并具备暴露后疗效的活性位点抑制剂仍面临巨大挑战。
因此，我们采用了一种创新的表型药物发现方法，该方法以肉毒杆菌神经毒素（BoNT）对 SNAP-25 的....
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方案
将20,000个已分化的鼠胚胎干细胞（MES）接种至96孔聚-D-赖氨酸包被的培养板中，每孔一滴，置于运动神经元终末分化培养基中培养5-7天。
1. 化合物给药及A型肉毒神经毒素中毒
所有以下操作均须在BSL2级防护设施中进行，以符合美国疾病控制与预防中心（CDC）/美国国立卫生研究院（NIH）的指导方针。
- 在聚丙烯96孔板中，用100% DMSO配制每种文库化合物的10 mM储备液。使用该10 mM储备液制备中间稀释板，其浓度为所需筛选浓度的10倍。通过将10 mM储备液加入96孔板中，并用培养基稀释至100 µM，制备100 µM中间稀释板。将10 µl化合物溶液加入含90 µl培养基的细胞中11。使化合物在细胞中的终浓度为10 µM，并确保DMSO的终浓度不超过0.5%。
- 所有涉及活细胞和活性毒素的实验均须在生物安全二级条件下进行。使用12通道手动移液器将96孔板中的旧培养基更换为80 µl新鲜终末分化培养基。吸液和加液操作应逐行进行，以避免细胞在无培养基条件下暴露于环境空气中。
- 在施加毒素前，通过12通道移液器从源板加入10 µl 10倍浓度的化合物进行细胞预处理，随后通过吸打混匀两次。对每个96孔板，使用培养基稀释10倍DMSO处理两列（每列6个孔），作为高信号和低信号对照。未接受BoNT处理的列显示全长SNAP-25的最高水....
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结果
高值对照和低值对照的数据形成了两个明显不同的群体，其两个中位数之差超过3个标准差（图7A）。筛选过程的目标是，在假设样本群体呈正态分布的前提下，找出样本群体中数值更接近阳性对照群体的化合物（图7B(i)）。那些偏离均值超过3个标准差的数据点被认为在统计学上显著区别于背景噪声，并被归类为有活性的“阳性结果”（图7B(ii)，红色框）。被归类为“阳性结果”的化合物将在后续研究中接受进一步的确认性测试。图7B(ii)展示了在代表性筛选板子集的样本群体中检测到的阳性结果。所有4个数值低于（样本中位数 - 3×样本标准差）的数据点均来自同一种抑制剂，该抑制剂在4块不同的筛选板上不同位置被点样。该抑制剂表现出对BoNT/A诱导的SNAP-25降解具有显著的保护作用，如图5所示。
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讨论
肉毒杆菌神经毒素具有极高的毒性，且相对容易被武器化，因此被美国疾病控制与预防中心列为A类（最高优先级）生物威胁制剂。遗憾的是，在毒素已被运动神经元内化之后，目前尚无经美国食品药品监督管理局批准的治疗手段可用于对抗肉毒毒素中毒。任何能够促进神经元从肉毒毒素中毒中恢复的可靶向作用机制，都可能推动开发出潜在疗法，从而保护军队和公众免受这一生物威胁。本文中，我们提供了一种详细的高内涵筛选（HCI）检测方案，用于筛选诸如BoNT/A等致命毒素的抑制剂。该检测方法的一个特殊之处在于对毒素的谨慎操作以及严格执行生物安全规程，以确保实验室安全。在使用活性毒素时必须格外小心。通过甲醇固定使BoNT/A失活，并使用10%次氯酸钠溶液对微孔板进行去污处理，辅以5%表面擦拭消毒，是关键步骤，可使微孔板在完成处理后从生物安全柜中移出，以便在生物安全二级实验室环境中进行后续分析。
由于化合物文库的规模不断扩大，而运动神经元的扩增速度较慢（细胞数量有限），因此用于筛选神经毒素拮抗剂的高内涵筛选（HCI）检测通常需要持续数周。这要求必须消除或尽量减少不同培养板之间以及时间上的变异性。在本方案中，我们提供了免疫染色.......
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披露
Krishna P Kota 是位于马萨诸塞州沃尔瑟姆的 Perkin Elmer Inc. 的员工，该公司生产本手稿中使用的仪器和软件。本出版物的内容不一定反映美国卫生与公共服务部、美国国防部、美国陆军部或与作者相关的机构和公司的观点或政策。
致谢
资金由联合科学技术办公室–化学与生物防御（JSTO-CBD）国防威胁降低局（DTRA）在资助项目编号 CCAR# CB3675 下以及美国国立卫生研究院（1 R21 AI101387-01 和 5 U01AI082051-05）提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 肉毒杆菌神经毒素A | Metabiologics | NA | 无目录编号 |
| 微量滴定板 | Greiner | 655946 | 聚-D-赖氨酸96孔板 |
| BACs抗体 | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| 甲醇 | Thermo Scientific | A412-20 | |
| 甲醛 | Thermo Scientific | 28908 | |
| 马血清 | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini自动化工作站 | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| 吐温X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII微管蛋白抗体 | R&D Systems | BAM1195 | |
| 吐温20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342染料 | Invitrogen | 3570 | |
| 抗小鼠IgG | Invitrogen | A21236 | |
| 抗兔IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus图像分析软件 | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox漂白剂 | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
参考文献
- Lamanna, C. The most poisonous poison. Science. 130, 763-772 (1959).
- Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. J. Infect. Dis. , (2013).
- Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S.
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重印与许可
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