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方法文章

一种用于鉴定肉毒神经毒素抑制剂的高内涵成像检测方法

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DOI：

10.3791/51915

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2014年11月14日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Perkin Elmer Inc., 2Henry M. Jackson Foundation, 3The Geneva Foundation, 4ORISE, 5Frederick National Laboratory for Cancer Research, 6Division of Molecular and Translational Sciences, US Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 7DoD Biotechnology High Performance Computing Software Applications Institute (BHSAI), Telemedicine and Advanced Technology Research Center (TATRC), US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC)

本文内容

摘要

肉毒神经毒素是A类生物威胁剂中最剧烈的毒素之一，但目前尚无可用的暴露后治疗方法。高内涵成像方法是一种用于发现新型抑制剂的强大技术，因为它能够利用具有生物学相关性的运动神经元（该毒素的主要作用靶点）进行多参数筛选。

摘要

突触小体相关蛋白-25（SNAP-25）是可溶性 NSF 附着蛋白受体（SNARE）复合物的组成部分，对突触神经递质的释放至关重要。A 型肉毒神经毒素（BoNT/A）是一种锌依赖性金属蛋白酶，通过切割 SNARE 复合物中的 SNAP-25 组分来阻断神经递质的胞吐作用。目前，在毒素被运动神经元内化后，尚无获批用于治疗 BoNT/A 中毒的药物。由于缺乏可用于筛选小分子文库的高效高通量检测方法，针对 BoNT/A 中毒的有效治疗措施的开发受到一定限制。本文描述了一种高内涵成像（HCI）检测方法，可用于鉴定 BoNT/A 抑制剂。初步优化工作集中在提高多个独立实验中不同微孔板之间结果的可重复性。自动化免疫染色、图像采集和图像分析被证明可提高检测的一致性，减少变异，并能够在小鼠运动神经元系统中对实验化合物进行多参数评估。

引言

细菌 Clostridium botulinum 可产生肉毒杆菌神经毒素（Botulinum neurotoxin），这是目前已知对人类毒性最强的生物毒素之一1。该毒素存在7种不同的血清型（BoNT/A-G）。BoNT/A-G 均可通过裂解 SNARE 复合物导致神经肌肉接头处发生麻痹2,3。SNARE 蛋白的裂解会阻止神经递质囊泡与细胞膜的融合，从而抑制神经递质的胞吐作用4。具体的 SNARE 蛋白靶点取决于参与中毒过程的特定 BoNT 血清型。BoNT/A 和 BoNT/E 可切割 SNAP-25，而 BoNT/C 可同时切割 SNAP-25 和 syntaxin5。其余血清型则切割 synaptobrevin（也称为囊泡相关膜蛋白（VAMP））。本研究选择 BoNT/A 作为检测方法开发的对象，因其在自然发生的肉毒中毒病例中占比较高，且其作用持续时间最长6。针对 BoNT/A 开发小分子治疗药物是我们药物发现项目的重要目标，此前已采用传统的基于靶点的方法筛选出可抑制其活性位点蛋白水解活性的抑制剂7,8-10。然而，开发出具有广谱活性、可作用于多种血清型并具备暴露后疗效的活性位点抑制剂仍面临巨大挑战。

因此，我们采用了一种创新的表型药物发现方法，该方法以肉毒杆菌神经毒素（BoNT）对 SNAP-25 的切割作为功能性终点，用于鉴定能够阻断 BoNT 介导的运动神经元中毒的小分子。SNAP-25 是神经递质释放所必需的蛋白，其降解可预测体内（in vivo）的麻痹和致死效应。例如，基于细胞的筛选可能发现调控毒素失活或抑制靶向细胞内毒素通路的新细胞因子调节剂。在表型检测方法的开发中，一个关键因素是选择具有生理相关性的生物模型。我们及其他研究者已报道了由小鼠胚胎干细胞（ES 细胞）衍生的运动神经元，其重现了原代运动神经元的免疫学特征，包括表达 SNAP-2511-13。重要的是，这些细胞系统对 BoNT/A 中毒高度敏感，并在毒素浓度递增时表现出剂量依赖性的 SNAP-25 切割11,12。此外，分化的运动神经元可大量获得，足以满足基于微孔板的高通量分析需求，从而支持一系列细胞检测方法的设计。

表型检测是一种免疫荧光方法，利用两种不同的抗体来定量分析在肉毒杆菌神经毒素A型（BoNT/A）感染小鼠运动神经元培养物过程中，内源性表达的全长SNAP-25的切割情况。一种针对BoNT/A切割位点的羧基末端抗体（BACS抗体），仅能识别全长SNAP-25，可用于评估BoNT/A介导的小鼠运动神经元中SNAP-25的蛋白水解表达10。高内涵成像（HCI）检测的示意图见图1。

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方案

将20,000个已分化的鼠胚胎干细胞（MES）接种至96孔聚-D-赖氨酸包被的培养板中，每孔一滴，置于运动神经元终末分化培养基中培养5-7天。

1. 化合物给药及A型肉毒神经毒素中毒

所有以下操作均须在BSL2级防护设施中进行，以符合美国疾病控制与预防中心（CDC）/美国国立卫生研究院（NIH）的指导方针。

  1. 在聚丙烯96孔板中，用100% DMSO配制每种文库化合物的10 mM储备液。使用该10 mM储备液制备中间稀释板，其浓度为所需筛选浓度的10倍。通过将10 mM储备液加入96孔板中，并用培养基稀释至100 µM，制备100 µM中间稀释板。将10 µl化合物溶液加入含90 µl培养基的细胞中11。使化合物在细胞中的终浓度为10 µM，并确保DMSO的终浓度不超过0.5%。
  2. 所有涉及活细胞和活性毒素的实验均须在生物安全二级条件下进行。使用12通道手动移液器将96孔板中的旧培养基更换为80 µl新鲜终末分化培养基。吸液和加液操作应逐行进行，以避免细胞在无培养基条件下暴露于环境空气中。
  3. 在施加毒素前，通过12通道移液器从源板加入10 µl 10倍浓度的化合物进行细胞预处理，随后通过吸打混匀两次。对每个96孔板，使用培养基稀释10倍DMSO处理两列（每列6个孔），作为高信号和低信号对照。未接受BoNT处理的列显示全长SNAP-25的最高水平（高信号对照）。另一列仅用BoNT处理（不加任何化合物）作为低信号对照。使用低信号对照观察BoNT对SNAP-25的切割效率及其与BACS抗体的检测效果（图2）。
  4. 将细胞在细胞培养箱中于37 °C和6% CO2条件下与化合物共同孵育30分钟。
  5. 从市售的1 mg/ml肉毒神经毒素A原液中，用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释并终末分化培养基配制终浓度为10倍工作浓度的肉毒神经毒素A。
  6. 使用多通道移液器向指定处理孔和低信号对照孔中加入10 µl 10倍浓度的BoNT/A原液以启动中毒过程（图2）。高信号对照孔仅加入培养基。
  7. 所有在实验过程中接触BoNT/A的塑料器皿及其他一次性耗材，均须浸入水中含0.825%次氯酸盐溶液中至少20分钟进行去污。所有操作应在生物安全柜中进行，并在实验前后使用5%洗涤剂消毒液（如MicroChem溶液）对工作区域进行去污处理。
  8. 明确标记使用毒素的孔板，并将经1 nM/L BoNT/A处理的孔板置于细胞培养箱中，在37 °C和6% CO2条件下孵育4小时。在实验室中张贴适当警示标识，提醒同事正在使用毒素。
  9. 通过甲醇固定终止BoNT/A的蛋白水解切割。使用多通道移液器从各孔中移除含毒素和化合物的培养基，并弃入10%次氯酸钠溶液中。直接向每孔加入100 µl冰甲醇。
  10. 室温（RT）孵育15分钟，以完成固定过程。
  11. 固定完成后，可按照生物安全一级操作规程安全处理已弃置的试剂（视为已中和），并按规定丢弃。
  12. 弃去甲醇，每孔加入100 µl PBS洗涤细胞并使其重新水化，用于后续免疫染色。再进行两次PBS洗涤。
  13. 最后一次洗涤后，在孔中保留PBS，用微孔板粘性封膜密封，并于4 °C保存至分析。可在4 °C保存数天。

2. 免疫染色

免疫染色实验是一种耗时且多步骤的操作，包括重复的试剂加样/吸液循环以及大量的板洗步骤，可能导致板内和板间变异性的显著增加。采用半自动化方法可节省实验人员的时间，提高检测通量，并最大限度地减少免疫染色的变异性。

  1. 使用配备可转移最大体积为 250 µl 的 96 孔头并集成机械臂夹持器以在模块化工作台面上移动实验耗材的自动化工作站（参见材料与设备）进行本方案。
    1. 模块化工作台面可容纳多种类型的实验耗材，最多可同时支持 11 个物品。自动化微孔板处理器配备双盒式微孔板堆叠器，每个循环可容纳和操作最多 50 块板。
    2. 自动化工作站位于专为实验室自动化设备设计的 II 级生物安全柜内，以确保无菌性和操作安全。进行自动化免疫染色时，工作台面按 图 3 所示布局排列，以便在无需人工干预的情况下按需获取试剂。
  2. 将含有固定细胞的板预装入板架中，并根据液体处理操作需要转移至工作台面。使用配备 250 µl 吸头的 96 通道移液头，从各孔中吸出 PBS 至剩余 10 µl。使用通透缓冲液（0.1% Triton-X 100）处理细胞膜以促进抗体与胞内靶标的结合。向每孔中加入 100 µl 通透缓冲液，随后将板放回微孔板堆叠器的第二个储存架中，在室温（RT）下孵育 15 分钟。
  3. 移除通透缓冲液，并按照步骤 1.13 中所述方法用 PBS 洗板两次。
  4. 最后一次洗涤后，移除 PBS 缓冲液，并向所有微孔板中加入含 1% 马血清和 0.1% Tween 20 的封闭缓冲液 100 µl，随后将板放回板架中，在室温下孵育 1 小时。
  5. 使用两种一抗进行免疫染色：兔多克隆抗小鼠 BACS 抗体用于检测全长 SNAP-25，小鼠单克隆抗-III 微管蛋白抗体用于检测神经元（参见材料与设备）。在孵育 60 分钟后，移除封闭缓冲液，并向所有板的各孔中加入含 4 µg/ml BACS 抗体和 0.5 µg/ml III-微管蛋白抗体的封闭缓冲液 50 µl。
  6. 在室温下孵育 1 小时，移除一抗，并用含 0.05% Tween 的 PBS（PBST）洗板 3 次，每次 100 µl。
  7. 使用 Alexa Fluor 647 标记的抗小鼠 IgG 检测 -III 微管蛋白，使用 Alexa Fluor 568 标记的抗兔 IgG 检测 BACS 抗体。将两种二抗用封闭缓冲液稀释至 2 µg/ml，混合后向每孔加入 50 µl。
    注意：所选用于免疫染色的二抗标记了不同的荧光染料，以便利用高内涵成像仪检测器的不同通道在不同波长下检测其发射的荧光信号。
  8. 在室温下孵育 1 小时。吸出二抗溶液，并用 100 µl PBST 洗板 3 次。
  9. 最后一次洗涤后，向每孔中加入含 Hoechst 染料（32 µM）的 PBS 100 µl，用于染色 DNA 以识别细胞核。
  10. 使用避光封板膜密封板，防止荧光染料发生光漂白。板可在 4 °C 下保存数周而无明显信号损失。

3. 成像

注意：使用高内涵成像系统进行图像采集（参见材料与设备）。

  1. 高内涵成像仪参数设置：
    1. 选择培养板类型、布局、视野数量和物镜：Greiner u clear，96孔板格式，16个视野，20倍水镜。
    2. 选择通道：细胞核激发光 EX：405 nm 设为通道4；细胞质激发光 EX：644 nm 设为通道2；抗原特异性抗体通道激发光 EX：561 nm 设为通道3；设置各激光激发功率，实验设置为两次曝光，曝光1使用644 nm单次激发，曝光2使用405 nm 和 561 nm 两次激发。选择 binning 模式为 Bin2。
    3. 使用高表达对照孔优化曝光，以SNAP-25通道信号强度最大，低表达对照孔信号强度最小。
    4. 调节曝光时间，使各通道信号强度约为饱和水平的一半（2,000–2,500 相对单位）。
    5. 利用delta校正脚本，在细胞掩膜通道中确定最佳Z平面。免疫染色与成像结果参见图5。将数据导出至运行图像分析软件的服务器。

4. 图像分析（图6）

注意：以下步骤描述了 Columbus 软件算法的应用。

  1. 选择合适的算法来分割主要对象（细胞核）。如有需要，调整背景阈值和对比度参数。Columbus 软件提供 4 种细胞核检测方法。选择能够有效分割细胞核的方法 通过目视检查已分割的细胞核（在 F 中）来准确地图6a 选择方法M。
  2. 选择神经突算法（CSIRO Neurite Analysis 2）以分割神经突。如有需要，调整背景阈值和对比度参数以去除背景。参见 图6b 用于检测神经突的参数。
  3. 基于二级对象（神经突）并使用β-III微管蛋白通道（Alexa Fluor 640）的-3像素扩展区域作为掩模，识别神经突区域（神经突片段）图 6c).
  4. 计算信号通道（SNAP-25，Alexa Fluor 568）在神经突区域以及β-III微管蛋白通道的强度图6d & 6e).
  5. 选择所需的导出参数，例如神经突长度、SNAP-25 平均荧光强度、β-III 微管蛋白平均荧光强度、细胞核数量、神经突片段数量 等等。 (图6f).
  6. 使用机器人将培养板从板架转移并装载到高内涵成像仪中进行图像采集。

5. 数据分析：

为评估所设计检测方法的稳健性，需根据基于微孔板的实验计算以下参数。

  1. 信号（S）与背景（B）之比：S/B = 高信号对照的平均强度 / 低信号对照的平均强度
  2. 信号与背景的变异系数（CV）（用于衡量特异性信号的均一性）：CV = （标准差（SD）/ 样本均值）×100（%），用于评估液体处理、试剂等方面的变异性
  3. 信噪比：S = （信号的平均强度 – 低信号对照的平均强度）/ 低对照的标准差
    1. 通过在96孔板的一半进行毒素处理，另一半进行模拟处理，计算Z'因子。Z' = 1 - 3 ×（高信号对照的标准差 + 低信号对照的标准差）/（高信号对照的均值 – 低信号对照的均值）。在对筛选数据进行进一步分析时，需将部分原始参数按每块板进行归一化处理，以便在不同板之间以及不同实验日期之间进行比较。
  4. 裂解百分比，反映特异性抗体（BACS）检测到的全长SNAP-25信号的减少程度：% 裂解 = 100% ×（高信号对照的平均强度 - 样本强度）/ 高信号对照的平均强度
  5. 裂解抑制百分比：% 抑制 = 100% ×（样本强度 – 低信号对照的平均强度）/（高信号对照的平均强度 - 低信号对照的平均强度）

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结果

高值对照和低值对照的数据形成了两个明显不同的群体，其两个中位数之差超过3个标准差（图7A）。筛选过程的目标是，在假设样本群体呈正态分布的前提下，找出样本群体中数值更接近阳性对照群体的化合物（图7B(i)）。那些偏离均值超过3个标准差的数据点被认为在统计学上显著区别于背景噪声，并被归类为有活性的“阳性结果”（图7B(ii)，红色框）。被归类为“阳性结果”的化合物将在后续研究中接受进一步的确认性测试。图7B(ii)展示了在代表性筛选板子集的样本群体中检测到的阳性结果。所有4个数值低于（样本中位数 - 3×样本标准差）的数据点均来自同一种抑制剂，该抑制剂在4块不同的筛选板上不同位置被点样。该抑制剂表现出对BoNT/A诱导的SNAP-25降解具有显著的保护作用，如图5所示。

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讨论

肉毒杆菌神经毒素具有极高的毒性，且相对容易被武器化，因此被美国疾病控制与预防中心列为A类（最高优先级）生物威胁制剂。遗憾的是，在毒素已被运动神经元内化之后，目前尚无经美国食品药品监督管理局批准的治疗手段可用于对抗肉毒毒素中毒。任何能够促进神经元从肉毒毒素中毒中恢复的可靶向作用机制，都可能推动开发出潜在疗法，从而保护军队和公众免受这一生物威胁。本文中，我们提供了一种详细的高内涵筛选（HCI）检测方案，用于筛选诸如BoNT/A等致命毒素的抑制剂。该检测方法的一个特殊之处在于对毒素的谨慎操作以及严格执行生物安全规程，以确保实验室安全。在使用活性毒素时必须格外小心。通过甲醇固定使BoNT/A失活，并使用10%次氯酸钠溶液对微孔板进行去污处理，辅以5%表面擦拭消毒，是关键步骤，可使微孔板在完成处理后从生物安全柜中移出，以便在生物安全二级实验室环境中进行后续分析。

由于化合物文库的规模不断扩大，而运动神经元的扩增速度较慢（细胞数量有限），因此用于筛选神经毒素拮抗剂的高内涵筛选（HCI）检测通常需要持续数周。这要求必须消除或尽量减少不同培养板之间以及时间上的变异性。在本方案中，我们提供了免疫染色...

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披露

Krishna P Kota 是位于马萨诸塞州沃尔瑟姆的 Perkin Elmer Inc. 的员工，该公司生产本手稿中使用的仪器和软件。本出版物的内容不一定反映美国卫生与公共服务部、美国国防部、美国陆军部或与作者相关的机构和公司的观点或政策。

致谢

资金由联合科学技术办公室–化学与生物防御（JSTO-CBD）国防威胁降低局（DTRA）在资助项目编号 CCAR# CB3675 下以及美国国立卫生研究院（1 R21 AI101387-01 和 5 U01AI082051-05）提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
肉毒杆菌神经毒素A MetabiologicsNA无目录编号
微量滴定板Greiner 655946聚-D-赖氨酸96孔板
BACs抗体Lampire BiologicalNA
MicrochemNational 0255
甲醇Thermo ScientificA412-20
甲醛Thermo Scientific28908
马血清Invitrogen16050
PE JANUS MDT Mini自动化工作站Perkin ElmerAJMDT01
OperaPerkin ElmerOP-QEHS-01
吐温X-100Sigma-Aldrich9002-93-1
BIII微管蛋白抗体R&D SystemsBAM1195
吐温20SigmaP1379-1L
Hoechst 33342染料 Invitrogen3570
抗小鼠IgGInvitrogenA21236
抗兔IgGInvitrogenA10042
Columbus图像分析软件Perkin ElmerVer 2.4
SpotfirePerkin ElmerVer 5.5
Clorox漂白剂Fisher Scientific18-861-284
PlateStack

参考文献

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