使用转座子诱变法构建 Enterobacter sp. YSU 营养缺陷型菌株

摘要

Enterobacter sp. YSU 可在葡萄糖最低盐培养基中生长。通过将转座子导入该菌株，可使其基因组随机插入并产生营养缺陷型突变体。通过从完全培养基到最低培养基的影印平板法筛选获得突变体。通过基因拯救及测序方法鉴定被插入中断的基因。

摘要

原养型细菌可在添加葡萄糖的M-9最低盐培养基（M-9培养基）上生长，其中葡萄糖作为碳源和能源。可通过转座子构建营养缺陷型突变株。本实验方案中使用的商业化Tn5衍生转座子包含一段线性DNA，其上具有R6Kγ复制起点、卡那霉素抗性基因以及两个镶嵌序列末端（作为转座酶结合位点）。该转座子以DNA/转座酶蛋白复合物的形式提供，通过电穿孔法导入原养型菌株Enterobacter sp. YSU中，并随机插入至宿主基因组内。将转化子复制接种于含卡那霉素的Luria-Bertani琼脂平板（LB-kan）和含卡那霉素的M-9培养基琼脂平板（M-9-kan）上。在LB-kan平板上生长但在M-9-kan平板上不生长的转化子被认定为营养缺陷型突变株。从营养缺陷型菌株中提取纯化的基因组DNA，经部分酶切、连接后转化至pir⁺ Escherichia coli（E. coli）菌株中。R6Kγ复制起点使质粒可在pir⁺ E. coli菌株中复制，而卡那霉素抗性标记则可用于质粒筛选。每个转化子均携带一种新的质粒，其中含有被中断染色体区域所侧翼包围的转座子。通过Sanger测序及基本局部比对搜索工具（BLAST）分析，可推测被中断基因的可能身份。采用该转座子诱变策略具有三个优势：第一，该方法不依赖宿主表达转座酶基因；第二，转座子通过电穿孔导入目标宿主，而非通过接合或转导，因而效率更高；第三，R6Kγ复制起点使得被突变基因易于鉴定，因其部分序列可在一个重组质粒中被回收。该技术可用于研究Enterobacter sp. YSU中参与其他性状的基因，或更广泛种类细菌菌株中的相关基因。

引言

野生型细菌可在含有葡萄糖的M-9最低盐培养基（M-9培养基）中生长，通过中心碳代谢途径将葡萄糖转化为生物合成所需的前体物质，例如氨基酸、核酸和维生素¹。M-9培养基含有氯化铵作为氮源，磷酸钠和磷酸钾作为缓冲剂及磷源，硫酸镁作为硫源，葡萄糖作为碳源和能源。LB培养基（Luria-Bertani培养基）富含胰蛋白胨提供的氨基酸以及酵母提取物提供的维生素和生长因子，能够支持营养缺陷型菌株的生长，这些菌株无法合成在M-9培养基上生长所必需的氨基酸、维生素及其他生长因子。因此，野生型菌株可在LB培养基和M-9培养基中生长，而营养缺陷型菌株只能在LB培养基中生长，不能在M-9培养基中生长。通过向野生型细菌群体中引入突变，并鉴定导致营养缺陷型表型的突变基因，可更深入地理解细菌菌株的代谢机制。

转座子诱变可用于鉴定在M-9培养基中葡萄糖生长所必需的众多基因。转座子会随机插入宿主基因组中²通过将转座子转化子点种在LB琼脂平板上，并复制平板至M-9培养基琼脂平板，可筛选营养缺陷型菌株。中断基因通过基因拯救法进行鉴定。本研究采用一种 commercially available Tn5-衍生的转座子，以线性转座子DNA片段与转座酶蛋白混合溶液的形式提供。该DNA片段不含转座酶基因，但包含卡那霉素抗性基因， R6Kγ 复制起点和两个镶嵌基序，后者是位于该片段两端、供转座酶结合的DNA序列^3,4由于转座酶蛋白直接添加到DNA中，因此仅将DNA片段定义为转座子，而将DNA/转座酶蛋白复合物定义为转座复合体。转座复合体通过电穿孔法转化。⁵ 进入卡那霉素敏感的宿主（图1A）。在含有卡那霉素的LB琼脂平板（LB-kan）上生长的菌落含有转座子插入。图1B)，并将转化子影印接种到含卡那霉素的M-9培养基琼脂平板（M-9-kan）上，不能生长的转化子为营养缺陷型（auxotrophs）图1C）。从突变体中纯化基因组DNA，并使用识别4个碱基的限制性内切酶进行部分消化， BfuC I (图1D）。连接的DNA被转化至一种菌株中 大肠杆菌 (E. coli）包含的 pir 基因图1E）。该基因使得含有转座子及侧翼宿主染色体区域的新质粒能够在 大肠杆菌⁶卡那霉素抗性基因作为新质粒的可筛选标记。最后，使用与转座子两端互补的引物进行测序，并进行局部比对基本搜索工具（BLAST）分析。^7,8 利用测序结果确定被中断基因的身份。

这种转座子突变策略具有三个优势³。首先，由于转座酶蛋白直接与转座子结合，插入过程不依赖于宿主细胞内转座酶基因的表达。一旦转座子插入宿主基因组，转座酶即被降解，从而防止转座子进一步移动。然而，如果宿主本身含有内源性的Tn5转座元件，则无法阻止其额外移动。其次，通过电穿孔将转座子复合物导入宿主，使其可在多种宿主中使用，同时避免了通过细菌接合或病毒感染的方式引入转座子，而这两种过程均依赖宿主的易感性。第三，在转座子中包含卡那霉素抗性基因和R6Kγ复制起点，有助于识别被中断的基因。转座子插入的区域可作为质粒保存并进行测序，从而无需采用反向聚合酶链式反应（PCR）技术进行基因鉴定。

本视频中介绍的实验方案详细描述了使用转座子对Enterobacter sp. YSU⁹进行转座子诱变的每一步操作，从转座子复合物导入细菌细胞，到鉴定其插入中断的潜在基因。除此前已发表的实验方案^3,4,10外，本文还提供了利用影印平板法筛选营养缺陷型菌株的详细方法。该诱变技术可用于研究不同类型细菌的其他表型，例如对抗生素和金属的抗性；也可用于合成生物学研究中确定特定培养条件下生长所必需的最少基因数量，或用于遗传学或微生物生理学课程的实验教学部分。

方案

1. 感受态细胞的电穿孔^5,11

1. 将一株过夜培养的 Enterobacter sp. YSU 1/20 LB 培养物稀释至 50 ml 新鲜 LB 培养基中，在 30 °C、120 rpm 振荡条件下培养，使其在 600 nm 处的光密度（O.D.）达到 0.4 至 0.6 之间。可选：在各自最适生长温度下培养其他细菌菌株。
2. 将细胞置于冰上冷却 5 分钟，然后在 4 °C、7,000 × g 条件下离心 5 分钟。
3. 弃去上清液，将细胞重悬于 50 ml 无菌冰水之中，在 4 °C、7,000 × g 条件下再次离心 5 分钟。重复此步骤一次。
4. 弃去上清液，将细胞重悬于与菌体沉淀体积相等的冰水中。如需长期保存，先用 10 ml 冰冷的 10% (v/v) 甘油洗涤细胞，再将其重悬于与菌体沉淀体积相等的冰冷 10% (v/v) 甘油中，于 -80 °C 保存，并在电穿孔前置于冰上解冻。
5. 向 40 µl 细胞中加入 0.5 µl 转座子复合物。市售的转座子溶液 DNA 浓度为 0.33 µg/µl。尽管推荐使用 0.33 µg，但 0.165 µg DNA 已足够。
6. 将细胞与转座子的混合物加入预冷的 0.2 mm 电穿孔杯中，并轻弹管壁使混合液沉至杯底。在 25 µF、200 Ω、2.5 kV 条件下进行电击。为确保细胞保持低温，使用前应将电穿孔杯存放于 -20 °C 冰箱中。
7. 立即向其中加入 960 µl 经滤膜除菌的含分解代谢物阻遏的超优肉汤（SOC）培养基，用移液器吹打混匀，然后将细胞转移至无菌的 1.5 ml 微量离心管中。
   注意：电击后细胞开始死亡，但 SOC 培养基中的盐分有助于细胞恢复。为节约试剂，阴性对照组细胞无需添加转座子或进行电击，仅需加入 960 µl 无菌 SOC 培养基即可。
8. 将细胞在 30 °C、120 rpm 振荡条件下孵育 45–60 分钟。此步骤可使转座子有足够时间与宿主基因组合并，并使细胞表达卡那霉素抗性。
9. 取 100 µl 细胞涂布于 LB-卡那霉素琼脂平板上，于 30 °C 过夜培养 。将剩余的转化混合物于 4 °C 冰箱中保存。如有需要，可在初次电穿孔后的两周内分次取出剩余样品进行涂板。

2. 转化子的划线接种

1. 将一个网格图用胶带固定在直径为100 × 15 mm的空培养皿的皿盖上。可参考《细菌遗传学简明教程》¹²中的网格图进行复制。
2. 在LB-卡那霉素琼脂平板底部画一条直线。使用一小段胶带将平板底部与带有网格的皿盖固定，使网格可通过琼脂清晰可见。确保平板底部的直线与网格顶部中央对齐。用胶带固定平板可防止其滑动，从而实现均匀划格。该直线有助于在复制平板后识别菌落。
3. 用无菌牙签挑取单个转化子，并将其点种在网格中方格的中心位置。仅需轻轻接触菌落和点种位置，切勿将牙签插入琼脂中。为避免污染平板，操作时仅握持牙签的一端。
4. 参照步骤2.3，在相邻的方格中点种另一个转化子。当平板点种完毕后，在30 °C条件下过夜培养。此平板即为母板。

3. 复制平板接种法确定营养缺陷型表型¹²

1. 对于每一块已划线的平板，准备三块新鲜的琼脂平板并按顺序编号：一块用于LB-kan培养基，二块用于M-9-kan培养基，三块用于LB-kan培养基。使用前将平板倒置于37 °C过夜干燥。
2. 在每块平板的顶部画一条线，方法同步骤2.2。
3. 用70%乙醇擦拭复制接种工具，在其表面放置一块无菌的丝绒布，并用夹具固定。即使洗手后，手上仍可能携带大量微生物。为防止污染微生物的引入，请仅通过丝绒布边缘进行操作。
4. 将主平板上的线条与夹具上的线条对齐，然后将平板放置在丝绒布上。轻轻按压，以将细菌从平板转移到丝绒布上。注意避免涂抹导致菌落扩散。转移完成后，移开主平板。
5. 将编号为一的平板上的线条与夹具上的线条对齐，然后将其放置在丝绒布上。轻轻按压，将细菌从丝绒布转移到该平板上。随后移开编号为一的平板。
6. 将使用过的丝绒布丢弃至盛有水的烧杯中，并按照步骤3.3的方法在复制接种工具上更换一块干净且无菌的丝绒布。此步骤可防止过度接种，从而避免穿透性生长和假阳性结果的出现。
7. 将编号为一的平板上的线条与夹具上的线条对齐，然后将其放置在新的丝绒布上。轻轻按压，将细菌从该平板转移到丝绒布上。随后移开编号为一的平板。
8. 将编号为二的平板上的线条与夹具上的线条对齐，然后将其放置在丝绒布上。轻轻按压，将细菌从丝绒布转移到编号为二的平板上。随后移开编号为二的平板。
9. 对编号为三的平板重复步骤3.8。第三块平板用于检测从主平板到其他两块平板的完全转移情况。将使用过的丝绒布丢弃至盛有水的烧杯中。若需重复使用丝绒布，可将装有污染丝绒布的烧杯进行高压灭菌，随后清洗、干燥、用铝箔包裹，并再次高压灭菌。
10. 将平板在30 °C下过夜培养。在两块LB-kan琼脂平板上生长但在M-9-kan平板上不能生长的菌落被认定为营养缺陷型菌株（图2）。
11. 从编号为一的平板上挑取营养缺陷型菌落，在一块新的LB-kan琼脂平板上划线，并在30 °C下过夜培养。
12. 从步骤3.11的划线平板上选取3个单菌落，在一块新的LB-kan平板上进行分离划线，每块平板分为三个区域，每个菌落分别划线于一个区域。在30 °C下过夜培养。此步骤可确保突变株得到良好分离。
13. 将步骤3.12获得的纯化菌落点种到一块新的LB-kan平板上，形成网格状排列，方法同步骤2.1–2.4。每个突变株均以三份重复进行重新测试。
14. 按照步骤3.1–3.10再次进行复制接种，以确认营养缺陷型表型。

4. 基因挽救

1. 从步骤 3.13 中分离的突变单菌落接种，于 30 °C 条件下在液体 LB-kan 培养基中培养 3 ml 过夜培养物。使用 commercially available 基因组 DNA 纯化试剂盒，从 1 ml 培养物中提取基因组 DNA。
2. 在冰上配制包含 0.025 U BfuC I 限制性内切酶和 14 µl 浓度为 1 μg/μl 的基因组 DNA 的 20 µl 反应体系。由于 BfuC I 可在转座子上十二个不同位点进行切割，使用 Bfa I 或 Hae III 限制性内切酶可能更为高效，它们分别在转座子上的两个和三个不同位点进行切割。
3. 将反应体系在 37 °C 孵育 25 分钟，随后在 80 °C 孵育 20 分钟以灭活酶活性。取 3 µl 部分消化的 DNA 在 0.8% 琼脂糖凝胶上进行电泳分析（图 3）。成功的部分消化结果应呈现从 10 kb 以上至凝胶底部的连续弥散条带。
4. 在 500 µl 反应体系中，使用 800 单位 T4 DNA 连接酶对 15 µl 部分消化的基因组 DNA 进行连接反应。在 4 °C 条件下过夜孵育。较大的反应体积有助于最大化单一片段的自连效率，并减少两个或多个 DNA 片段之间的相互作用。
5. 通过加入 50 µl 3 M 醋酸钠（pH 5.5）和 1 ml 95% 乙醇，于 -20°C 孵育 20 分钟，对连接后的 DNA 进行沉淀。
6. 在 4 °C、13,500 × g 条件下离心 10 分钟，用 70% 乙醇洗涤沉淀，于离心真空浓缩仪中干燥，然后将其重悬于 10 µl 无核酸酶水中。或者，也可在室温下空气中干燥 15 分钟。
7. 取 4 µl 重悬的 DNA，通过电穿孔法转化至 E. coli 菌株 ECD100D pir 或 ECD100D pir116 中（如第 1 节所述）。R6kγ 复制起点需要含有 pir 基因的细菌菌株才能复制⁶。pir 菌株产生低拷贝质粒，而 pir116 菌株含有一个 pir 突变基因，可产生高拷贝质粒。每个转化子均含有一个携带转座子及一段中断染色体区域的新质粒（图 1E）。
8. 用单个菌落接种 5 ml LB-kan 培养基，在 120 rpm 振荡条件下于 37 °C 培养过夜，使用 commercial kit 从整个过夜培养物中纯化质粒 DNA。
9. 使用限制性内切酶 Xho I 对 14 µl 质粒 DNA 进行消化，确保反应终体积为 20 µl。该酶识别位于卡那霉素抗性基因 5’ 端转座子中部的一个酶切位点。取 10 µl 未消化和已消化的质粒在 0.8% 琼脂糖凝胶上进行电泳分析（图 3）。该质粒由 2 kb 的转座子及两侧的宿主 DNA 组成。

5. DNA 测序

1. 使用市售测序试剂盒、与转座子两端同源的引物以及毛细管测序分析系统对质粒进行测序。或者，可将质粒送至外部机构进行测序。
2. 利用凝胶中的分子量标准（1 kb DNA ladder）估算质粒的大小，然后估算获得 50 fmol 所需的质粒纳克数（ng）。
3. 使用分光光度计在 260 nm（A₂₆₀）和 280 nm（A₂₈₀）波长下测定质粒 DNA 的浓度。确保比色皿中的光程为 1 cm。通过将 260 nm 处的吸光度乘以 50 ng/µl 来确定浓度。高质量的质粒 DNA 其 A₂₆₀/A₂₈₀ 比值应在 1.8 至 2.0 之间。
4. 每轮测序反应所需的 DNA 体积为 50 fmol 所需的 ng 数除以质粒浓度。将所需体积的质粒与水混合，使总体积达到 10 µl。
5. 将质粒 DNA 与水的混合物在 96 °C 加热 1 分钟，然后冷却至室温。
6. 加入 8 µl 测序试剂盒中的预混液（master mix）以及 2 µl 浓度为 1.6 μM 的其中一种测序引物。
7. 按照测序试剂盒提供的说明书设置热循环仪程序并进行反应后纯化。
8. 使用毛细管 DNA 分析系统对每个样品进行分析。
9. 使用市售软件查看 DNA 序列，搜索序列“5’-GAGACAG-3’”，该序列是转座子的最后 7 个碱基对（图 4）。此 7 bp 片段 5’端之前的序列属于转座子部分，3’端之后的序列则属于被中断的基因。
10. 使用基本局部比对搜索工具（BLAST）^7,8 确定被中断基因的可能功能。访问以下链接：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch。将被中断基因的序列粘贴至查询框中，在数据库选项下选择“others”，然后点击页面底部的“BLAST”按钮。结果出现后，向下滚动页面查看比对结果（图 5）。

结果

通过电穿孔将转座子导入 Enterobacter sp. YSU，实现了转座子在宿主基因组中的随机插入（图1A,B）。一次成功的电穿孔可获得数千个转化子，这些转化子可在LB-kan平板上生长。为获得每板300–400个分布良好的单菌落，优化了涂布于每块LB-kan琼脂平板上的转化混合物体积。每个转化子至少含有一个转座子插入，但在通过影印培养法筛选前，尚不清楚是否已有影响M-9培养基生长的关键基因被中断。将转化子以88个为一组转移至新的LB-kan平板，并影印接种至M-9培养基上。需注意的是，为确保转座子在转化子中稳定维持，方案部分建议在M-9培养基平板中添加卡那霉素。本实验中M-9培养基未添加卡那霉素，但仍可成功筛选出营养缺陷型突变株。在图2中，黑色方块表示两个菌落在LB-kan平板上生长（2A），但在M-9基本培养基平板上不生长（2B）。这些营养缺陷型菌株的转座子可能插入并中断了参与合成氨基酸、核酸或维生素的基因，而这些物质存在于LB培养基中，但不存在于M-9基本培养基中（图1C）。其余86个菌落则未在M-9基本培养...

讨论

利用转座子复合物（transposome）进行转座子诱变是构建Enterobacter sp. YSU以及其他革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌营养缺陷型菌株的有效工具^3,4。该过程首先通过电穿孔将Tn5衍生的转座子复合物导入宿主细胞。为了筛选含有插入片段的菌落，未转化的目标菌株必须对卡那霉素敏感，以便利用转座子携带的抗性标记进行筛选。某些宿主菌株会产生限制性内切酶，在转座子DNA与宿主基因组发生重组前将其降解。在电穿孔混合物中添加限制性内切酶抑制剂可减少DNA降解，提高转化效率³。在制备电转化感受态细菌时，必须尽可能去除盐分，以防止因盐离子存在而产生电弧或火花，导致细菌死亡。即使未出现电弧，细胞在电击后也会迅速开始死亡。立即加入含盐的SOC生长培养基可恢复渗透压平衡，最大限度减少细胞死亡，并提高转化效率⁵。将获得的卡那霉素抗性转化子点种至新鲜的LB-kan平板，并复制到M-9最小培养基琼脂平板上进行筛选。为防止接种过量而导致假阳性结果，遗漏潜在的营养缺陷型菌株，在接种其余平板之前，应在步骤3.6中更换丝绒布方块。随后在复制平板过程中，施加适当...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp 转座子试剂盒	Epicentre（Illumina）	TSM08KR
EC100D pir+ 电转感受态大肠杆菌	Epicentre（Illumina）	ECP09500	能够复制含有 R6K 的质粒γ 低拷贝数的复制起点
EC100D pir-116 电转感受态大肠杆菌	Epicentre（Illumina）	EC6P095H	能够复制含有 R6K 的质粒γ 高拷贝数的复制起点
5X M-9 盐溶液	赛默飞世尔科技	DF048517
Lennox LB 肉汤	赛默飞世尔科技	BP1427-2
琼脂	Amresco, Inc.	J637-1KG	固体培养基含有1.6%（w/v）琼脂
硫酸卡那霉素	Amresco, Inc.	0408-25G	必要时，培养基中含有 50 μg/ml 硫酸卡那霉素
D-葡萄糖一水合物	Amresco, Inc.	0643-1KG
酵母提取物	Amresco, Inc.	J850-500G
胰蛋白胨	Amresco, Inc.	J859-500G
KCl	Sigma-Aldrich	P4504-500G
NaCl	Amresco, Inc.	X190-1KG
MgCl₂2	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO₄2	Fisher Scientific	BP213-1
含分解代谢物阻遏的超优肉汤（SOC）培养基			0.5% (w/v) 酵母提取物，2% (w/v) 胰蛋白胨，10 mM NaCl，2.5 mM KCl，10 mM MgCl₂2，20 mM MgSO₄4 和 20 mM 葡萄糖
BfuC I	NEB	R0636S	基因组DNA的部分消化
Xho I	NEB	R0146S	质粒消化
T4 DNA连接酶	NEB	M0202S
无核酸酶水	Amresco, Inc.	E476-1L	用于溶解沉淀的DNA和限制性内切酶反应
GenomeLab DTCS - 快速启动试剂盒	贝克曼库尔特	608120	DNA测序
Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒	Promega	A1120A
Wizard Plus SV Minipreps DNA 纯化系统	Promega	A1460	质粒纯化
复制平板接种块	赛默飞世尔科技	09-718-1
天鹅绒方块	赛默飞世尔科技	09-718-2	复制平板接种
PetriStickers	Diversified Biotech	PSTK-1100	用于复制平板的网格
培养皿	赛默飞世尔科技	FB0875712
Gene Pulser II	伯乐（BioRad）		电穿孔
电穿孔比色皿 – 2 mm	BioExpress	E-5010-2
CentriVap DNA 真空浓缩仪	Labconco	7970010	干燥DNA
CEQ 2000XL DNA分析系统	贝克曼库尔特		DNA测序
Vector NTI Advance 11.5.0	Life Technologies	12605099	DNA序列分析