本文介绍了一种结合两种蛋白质组学技术的实验方案，即二维凝胶电泳（2DE）与质谱分析（MS），用于鉴定两个或多个原始样本组之间差异表达或发生翻译后修饰的蛋白质。该方法结合功能实验，可实现对预后标志物或治疗靶点的鉴定与表征。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
肿瘤发生与进展相关分子的鉴定对于理解疾病生物学机制以及患者临床管理至关重要。本文将描述一种优化的蛋白质组学方法，用于鉴定慢性淋巴细胞白血病（Chronic Lymphocytic Leukemia, CLL）进展过程中涉及的分子。具体而言，白血病细胞裂解液通过二维电泳（2-dimensional Electrophoresis, 2DE）分离，并在2DE凝胶上以“点”的形式显现。通过比较蛋白质组图谱，可识别出差异表达的蛋白质（包括丰度变化和翻译后修饰），这些蛋白点被挑选、分离并经质谱（Mass Spectrometry, MS）鉴定。所鉴定候选分子的生物学功能可通过多种实验方法进行验证即 迁移、黏附和F-actin聚合）的实验方法，我们已针对原代白血病细胞进行了优化。
引言
慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方国家最常见的成人白血病，起源于单克隆性肿瘤性CD5+ B淋巴细胞的积聚，临床上具有高度异质性。该病可表现为一种前白血病状态，称为单克隆B细胞淋巴细胞增多症（MBL）1,2,3。在其他情况下，疾病可表现为惰性临床过程，可在多年内保持稳定而无需治疗；也可表现为进展性化疗耐药性疾病，尽管接受治疗，预后仍然极差。此外，该病还可能转化为一种常具致死性的高级别淋巴瘤（Richter综合征-RS）2,3,4。患者通常根据一组提供疾病转归和生存预测互补信息的预后因素，分为预后良好和预后不良两大类。临床异质性可能反映了其生物学异质性。已有研究表明，多种遗传、微环境及细胞因素共同参与疾病发病机制，但迄今尚未发现统一的致病机制5。具体而言，多项研究证实，疾病临床进程的差异在一定程度上可通过某些具有预后价值的生物学标志物的存在或缺失加以解释6,7,8。这些数据表明，深入理解疾病的生物学特性，有助于通过识别预后标志物和治疗靶点，为该疾病的临床管理提供新的线索。
本文的目的是展示如何结合不同的蛋白质组学技术，用于鉴定与慢性淋巴细胞白血病（CLL）发生和进展相关的蛋白质。我们的方法表明，可以将基础蛋白质组学数据与临床数据结合起来5。
在本实验流程中，选取部分患者的原代白血病细胞（良好 <....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：所有组织样本均经圣拉斐尔医院（意大利米兰）机构审查委员会批准获取。
1. 人体组织样本与细胞纯化（图1）
注意：白血病性淋巴细胞取自根据Mulligan标准诊断的慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的外周血（PB）。 等. 9
1.1）从外周血中分离白血病细胞
- 使用含肝素钠的真空采血管收集外周血（PB）。
- 将血液转移至15 ml离心管中，并按每毫升全血加入50 μL人B细胞富集试剂盒，充分混匀后室温孵育20分钟。
- 用等体积的含2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释样本，轻轻混匀，然后小心地将血液叠加于Ficoll液面上，注意避免破坏液面界面。Ficoll与稀释后样本的体积比至少为1:2（i.e. 在15 ml离心管中加入4 ml Ficoll和10 ml血液）。
- 在室温（20 °C）下以400 × g离心20分钟，不启用刹车。单个核细胞将位于界面处。
- 小心吸取界面层以回收细胞，并转移至新离心管中。用PBS洗涤细胞一次，然后在4 °C避光条件下以300 × g离心5分钟。细胞沉淀将位于管底。
- 弃去上清液。用手指轻弹离心管，使残留上清液中的沉淀重悬。加入10 ml完全RPMI培养基（....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
我们从慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者外周血（PB）中分离出原代白血病B细胞，并分析其蛋白质组谱。根据每位患者的临床特征，将样本（n = 104）分为两个主要亚组（预后不良 与 预后良好）并进行了双向电泳凝胶的比较分析。
该分析能够鉴定出两个亚群之间差异表达的蛋白点（基于蛋白点的有无或凝胶上的位置偏移，提示翻译后修饰发生了变化；n ≈ 16）。我们从二维电泳凝胶中切取选定的蛋白点，经还原和烷基化处理后，用胰蛋白酶对蛋白质进行消化，将所得上清液中的肽段点样至MALDI靶板。使用MALDI-ToF Voyager DE仪器采集质谱图谱。所得峰列表提交至MASCOT和ProFound数据库进行检索。在特定质量容差范围内的质谱峰被匹配至数据库中的肽段序列，并拼接成蛋白质序列；若该蛋白质的匹配结果通过特定的概率评分标准，则被认定为已鉴定（图3）。通过该分析，我们鉴定出的蛋白质主要参与细胞骨架活动和代谢过程（未发表数据）。
在这些蛋白中，我们重点关注了造血系细胞特异性蛋白-1（HS1），.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文旨在描述一种优化的实验方案，用于鉴定参与慢性淋巴细胞白血病（CLL）发病机制的分子，尽管该方法也可扩展应用于其他疾病和/或其他类型的样本。16-18通过比较慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者两个亚组的蛋白质组学谱 与 预后不良19我们证实，它们在HS1的磷酸化状态上存在差异，且HS1的活化影响白血病细胞的迁移和黏附能力。
与其他方法相比，本文所述蛋白质组学技术（双向电泳凝胶和质谱）的主要优势在于，它们能够提供细胞蛋白质组的完整图谱，更重要的是，能够提供蛋白质翻译后修饰的相关信息。发生差异磷酸化或糖基化的蛋白质在凝胶中的位置会发生改变，其在细胞中的活性也可能随之改变。
此外，我们描述了用于检测细胞迁移和黏附的实验方案，这些方案可用于评估细胞骨架功能；然而，对于悬浮生长的细胞而言，这类方案的描述仍较为有限，因为它们通常应用于贴壁细胞。例如 伤口愈合）。2DE 和 MS 技术的主要局限性在于所需细胞/蛋白质的数量（≈25 × 106
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢淋巴系统恶性肿瘤研究组、Elisa ten Hacken、Lydia Scarfò、 Massimo Alessio、Antonio Conti、Angela Bachi 以及 Angela Cattaneo。
该项目由意大利癌症研究协会AIRC（研究者资助和分子临床肿瘤学专项计划——5比千项目#9965）资助。
C.S. 和 B.A. 设计了研究，进行了实验，分析了数据并撰写了手稿。M.T.S.B.、U.R.、F.B.、P.R. 协助撰写手稿。P.G. 和 F.C.C. 设计了研究，并提供了患者的样本和临床数据。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈 | MERCK | 61830025001730 | |
| 碳酸氢铵 | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-二硫苏糖醇 | SIGMA | D9680-5G | |
| 碘乙酰胺 | SIGMA | I6125-25G | |
| 二水合氯化钙 | SIGMA | 223506-25G | |
| 测序级胰蛋白酶 | ROCHE | 11418475001 | |
| α-氰基-4-羟基肉桂酸 | SIGMA | C2020-10G | |
| 三氟乙酸 | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| 人B细胞富集混合液（RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail） | STEMCELL | 15064 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | EUROCLONE | ECB4004L | |
| 胎牛血清（FBS） | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| 淋巴细胞分离液（Lymphoprep） | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| 台盼蓝 | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 等电聚焦仪 | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| 尿素 | SIGMA | U6504 | |
| Tris-HCl缓冲液 | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPG胶条 | GE-Healthcare | 17-1233-01 | 线性pH 4-7，18 cm |
| IPG缓冲液 | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| 甘油 | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL 电泳槽 | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| 丙烯酰胺 | BIO-RAD | 161-0156 | |
| 琼脂糖 | INVITROGEN | 16500 | |
| 甲醇 | SIGMA | 32213 | |
| 乙酸 | VWR | 631000 | |
| 福尔马林 | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| 乙醇 | VWR | 9832500 | |
| 硫代硫酸钠 | FLUKA | 72049 | |
| 硝酸银 | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI 激光密度计 | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| 碳酸钠 | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer 软件（版本 3.2） | Applied Biosystems | ||
| transwell 小室（直径 6.6 mm） | CORNING | 3421 | |
| RPMI 培养基 | EUROCLONE | ECB2000L | 含 L-谷氨酰胺 |
| 庆大霉素 | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| 平底 96 孔板 | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Technology | C7025 | 绿色 |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| 多聚甲醛 | SIGMA | P6148 | |
| 皂苷 | SIGMA | S-7900 | |
| 鬼笔环肽 | Life Technology | A12379 | Alexa Fluor 488 |
参考文献
- Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease. J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).
- Rawstron, A. C., et al. Monoclonal B-....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
