从二维电泳凝胶斑点到蛋白质功能：慢性淋巴细胞白血病中HS1蛋白的研究启示

摘要

本文介绍了一种结合两种蛋白质组学技术的实验方案，即二维凝胶电泳（2DE）与质谱分析（MS），用于鉴定两个或多个原始样本组之间差异表达或发生翻译后修饰的蛋白质。该方法结合功能实验，可实现对预后标志物或治疗靶点的鉴定与表征。

摘要

肿瘤发生与进展相关分子的鉴定对于理解疾病生物学机制以及患者临床管理至关重要。本文将描述一种优化的蛋白质组学方法，用于鉴定慢性淋巴细胞白血病（Chronic Lymphocytic Leukemia, CLL）进展过程中涉及的分子。具体而言，白血病细胞裂解液通过二维电泳（2-dimensional Electrophoresis, 2DE）分离，并在2DE凝胶上以“点”的形式显现。通过比较蛋白质组图谱，可识别出差异表达的蛋白质（包括丰度变化和翻译后修饰），这些蛋白点被挑选、分离并经质谱（Mass Spectrometry, MS）鉴定。所鉴定候选分子的生物学功能可通过多种实验方法进行验证即 迁移、黏附和F-actin聚合）的实验方法，我们已针对原代白血病细胞进行了优化。

引言

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方国家最常见的成人白血病，起源于单克隆性肿瘤性CD5⁺ B淋巴细胞的积聚，临床上具有高度异质性。该病可表现为一种前白血病状态，称为单克隆B细胞淋巴细胞增多症（MBL）^1,2,3。在其他情况下，疾病可表现为惰性临床过程，可在多年内保持稳定而无需治疗；也可表现为进展性化疗耐药性疾病，尽管接受治疗，预后仍然极差。此外，该病还可能转化为一种常具致死性的高级别淋巴瘤（Richter综合征-RS）^2,3,4。患者通常根据一组提供疾病转归和生存预测互补信息的预后因素，分为预后良好和预后不良两大类。临床异质性可能反映了其生物学异质性。已有研究表明，多种遗传、微环境及细胞因素共同参与疾病发病机制，但迄今尚未发现统一的致病机制⁵。具体而言，多项研究证实，疾病临床进程的差异在一定程度上可通过某些具有预后价值的生物学标志物的存在或缺失加以解释^6,7,8。这些数据表明，深入理解疾病的生物学特性，有助于通过识别预后标志物和治疗靶点，为该疾病的临床管理提供新的线索。

本文的目的是展示如何结合不同的蛋白质组学技术，用于鉴定与慢性淋巴细胞白血病（CLL）发生和进展相关的蛋白质。我们的方法表明，可以将基础蛋白质组学数据与临床数据结合起来⁵。

在本实验流程中，选取部分患者的原代白血病细胞（良好 与 预后不良）的细胞被分离后，制备细胞裂解液以获取蛋白质组图谱。双向电泳（2DE）可对细胞群体的蛋白质组特征进行表征，包括翻译后修饰，从而间接反映每种蛋白质的生物学活性。全细胞裂解液首先基于等电点进行第一维分离，随后在聚丙烯酰胺凝胶上进行第二维分离，依据蛋白质的分子量进行分辨。通过比较蛋白质组图谱，可在凝胶上识别出差异表达的蛋白质（包括丰度变化和翻译后修饰），这些差异蛋白表现为可被切取并经质谱分析的蛋白点。随后可通过多种实验方法进一步探究各候选蛋白的功能。

该方法目前在本文中仅限于慢性淋巴细胞白血病（CLL），但可轻松扩展至其他疾病/样本，从而提供关于两组之间蛋白质组学/生物学差异的信息即 病理的 与 正常，刺激后 与 未刺激的，野生型 与 敲低

方案

注意：所有组织样本均经圣拉斐尔医院（意大利米兰）机构审查委员会批准获取。

1. 人体组织样本与细胞纯化（图1）

注意：白血病性淋巴细胞取自根据Mulligan标准诊断的慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的外周血（PB）。 等. ⁹

1.1）从外周血中分离白血病细胞

1. 使用含肝素钠的真空采血管收集外周血（PB）。
2. 将血液转移至15 ml离心管中，并按每毫升全血加入50 μL人B细胞富集试剂盒，充分混匀后室温孵育20分钟。
3. 用等体积的含2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释样本，轻轻混匀，然后小心地将血液叠加于Ficoll液面上，注意避免破坏液面界面。Ficoll与稀释后样本的体积比至少为1:2（i.e. 在15 ml离心管中加入4 ml Ficoll和10 ml血液）。
4. 在室温（20 °C）下以400 × g离心20分钟，不启用刹车。单个核细胞将位于界面处。
5. 小心吸取界面层以回收细胞，并转移至新离心管中。用PBS洗涤细胞一次，然后在4 °C避光条件下以300 × g离心5分钟。细胞沉淀将位于管底。
6. 弃去上清液。用手指轻弹离心管，使残留上清液中的沉淀重悬。加入10 ml完全RPMI培养基（RPMI 1640培养基添加10%胎牛血清和15 mg/ml庆大霉素）稀释细胞沉淀，并使用台盼蓝排斥法进行细胞计数。

1.2）纯度评价

注意：所有制备物的纯度必须始终高于 99%。

1. 在FACS管中，将100 μl纯化的细胞悬液与以下抗体（市售；参见材料表）于4 °C孵育20分钟：CD3_FITC （5 µl/测试）、CD14_PE （5 µl/测试）、CD19_ECD （6 µl/测试）、CD16-CD56_PC5 （2 µl/测试）、CD5_PC7（4 µl/测试）。
2. 用4 ml PBS洗涤样本（300 x g离心5分钟），并通过流式细胞术检测纯度。在图中检查共表达CD19和CD5的CLL细胞百分比（> 99%），如图1(6)所示。通过检查图中CD3、CD14和CD16-56的百分比（应接近零），确保样本中几乎不含NK细胞、T淋巴细胞和单核细胞。

1.3）样品储存

1. 进行蛋白质组学研究时，将 25 × 10⁶ 个细胞收集至 1.5 ml 离心管中，在 300 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀冻干 4 小时。保存于 -80 °C 直至使用。
2. 进行验证实验时，将细胞重悬于完全 RPMI 培养基中（体积取决于所选的具体实验），并继续进行第 4 步操作。

2. 双向电泳（2-DE）（图 2）

2.1）等电聚焦电泳（IEF）

1. 用终体积为 380 μl 的 2-DE 缓冲液（344 μl RBthio 溶液（9 M 尿素，10 mM Tris，4% CHAPS），30 μl 65 mM DTT，6 μl 2% IPG 缓冲两性电解质 pH 4-7）溶解 CLL 细胞沉淀。
2. 将蛋白质样品（1 mg）上样至 18 条 IPG 胶条（pH 4-7），并按照 Conti et al.¹⁰ 描述的标准程序进行等电聚焦（IEF）。
3. 将胶条在 2 ml 平衡缓冲液（EB：含 6 M 尿素、30% 甘油、2% SDS 的 50 mM pH 8.8 Tris-HCl 缓冲液）中平衡，加入 2% 新鲜 DTT，室温下振荡孵育 15 分钟。弃去含 DTT 的 EB，加入 2 ml 含 2.5% 碘乙酰胺的 EB，室温下在摇床上继续孵育 15 分钟。

2.2）SDS-PAGE

1. 将胶条放在纸巾上干燥，避免触碰凝胶以去除多余的溴化乙锭（EB）。将每条胶条加样至9-16%梯度SDS-PAGE凝胶的上样孔中。在凝胶上方加入少量SDS电泳缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，0.1% w/v SDS），以利于胶条的加载。
2. 加入约5 ml 0.8%琼脂溶液密封凝胶，防止胶条漂浮，然后组装电泳装置并用SDS电泳缓冲液充满。在4 °C条件下，以每块凝胶60 mA的电流电泳4小时。
3. 从电泳装置中取出凝胶，并将其放入合适的染色盒中。

2.3）制备胶的银染法

固定剂	50% Methanol 12% Acetic Acid 0,05% Formalin	2 小时（或过夜）*
洗涤缓冲液	35% Ethanol	20 分钟（重复三次）
致敏处理	0,02% Sodium Thiosulfate	2 分钟
洗涤	H2O	5 分钟（重复三次）
硝酸银染色	0,2% Silver Nitrate 0,076% Formalin	20 分钟
洗涤	H2O	1 分钟（重复两次）
显影液	6% Sodium Carbonate 0,0004% Sodium Thiosulfate 0,05% formalin	直至染色达到足够强度
终止反应	50% Methanol	30 分钟
	* 蛋白质固定的最短时间为 2 小时

表1.

注意：可通过使用与质谱兼容的银染法染色凝胶来观察蛋白质点¹¹。银染所需的所有溶液均列于表1中。

1. 按照表1中的说明，准备约200 ml的每种溶液/凝胶，并将每种溶液小心加入含有凝胶的染色盒中。所有孵育步骤均在摇床上进行。
2. 染色完成后，移除终止液，并将凝胶置于1%乙酸溶液中，直至成像前。

2.4）凝胶成像与分析

1. 在染色后3天内使用密度计以高分辨率获取图像。
2. 使用双向电泳凝胶分析软件分析二维蛋白质图谱。
   注意：该软件可实现快速且可靠的图像比较。
   1. 在上下文菜单中选择“创建新项目”来建立项目。创建文件夹，并通过选择“导入凝胶图像”导入扩展名为 .tif、.png 或 .gel 的凝胶图像。
   2. 将凝胶导入并添加到工作区后，选择待检测的凝胶，然后在菜单中选择“编辑 > 斑点 > 检测”，执行自动斑点检测。
   3. 接下来，在菜单中选择“减除背景”以执行背景扣除。注意：此后可通过定量和/或定性分析，对多个凝胶进行比较，检测其差异或相似性。

3. 通过MALDI-TOF质谱分析进行蛋白质鉴定（图3）

3.1）蛋白质消化

1. 用清水冲洗凝胶，并通过手动（用洁净的解剖刀切割）或自动切割方式从凝胶中切取目标条带。
2. 用清水洗涤凝胶颗粒（100-150 μl），离心（400 × g，30 秒），弃去上清液。
3. 加入等体积（根据凝胶体积而定）的 CH₃将CN加入凝胶碎块中，静置10–15分钟，直至凝胶碎块收缩。在真空离心机中干燥凝胶颗粒。
4. 加入75-100 µl 10 mM 二硫苏糖醇用 50 mM NH 稀释₄HCO₃ 并在37°C下孵育30分钟 56 °C （还原步骤）。再次使用CH缩小胶块₃CN，如步骤3.1.3所述。
5. 加入75-进行烷基化反应100 µl 55 mM 碘乙酰胺用 50 mM NH 稀释成的溶液₄HCO₃ 在室温避光条件下孵育20分钟。
6. 用 CH 再次收缩凝胶块₃用足量的CN溶液覆盖胶粒，具体操作如步骤3.1.3所述。在真空离心机中干燥。
7. 在含有 25 mM NH₄HCO₃ 的缓冲液中重悬颗粒₄HCO_3, 5 mM CaCl₂,_{和 12.5 ng/}μl 胰蛋白酶的 4 °C 孵育20分钟。使用足量缓冲液以完全覆盖凝胶碎块。移除未被吸收的上清液，加入25 mM NH₄HCO₃₄HCO_3, 5 mM CaCl₂ 不使用胰蛋白酶覆盖凝胶。
8. 将样品放置于 37 °C 至少3小时（肽段消化所需的最短时间）至过夜。

3.2）质谱分析（干滴法）

1. 将每份样品各取 1 μl 点样至不锈钢 MALDI 板上，并加入 1 µl 基质 α-氰基-4-羟基肉桂酸（溶于 50% CH₃CN 和 0.1% TFA 中）混合。
2. 在 MALDI–TOF 质谱仪上获取质谱图。每个样品点累计约 200 次谱图，调节激光强度以避免信号饱和或增强信号。通过 Data Explorer 软件处理谱图，步骤如下：
   1. 导入 .dat 文件，选择“process > baseline correction”进行基线校正。使用胰蛋白酶自裂解产物和基质峰进行质量校准：选择“process > mass calibration > manual calibration”，用鼠标左键拖动选择接近 m/z 855.1 和 2163.1 的峰，并选择相应的参考质量，然后在校准窗口中点击“plot”和“apply calibration”。
   2. 调整峰检测阈值（“peak > peak detection”），复制当前谱图（“display > duplicate active trace”），选中新谱图并进行去同位素峰处理（“peak > deisotoping”）。运行宏命令“getpeaklist”，生成用于蛋白质鉴定的质量列表。如有必要，手动去除被误识别为峰的噪声信号，以净化列表，提高鉴定准确性。
3. 使用 ProFound 和 Mascot 作为搜索引擎，在综合性非冗余蛋白质数据库中进行蛋白质鉴定¹²。
   1. 所有搜索均使用以下参数：每条肽段允许一次漏切，甲硫氨酸氧化作为可变修饰，半胱氨酸羧氨甲基化作为固定修饰，初始质量误差容限为 50 ppm。

4. 细胞骨架活性检测（图4）

注意：将第1步中纯化的细胞重悬于完全RPMI培养基中（每200 μl含10⁶个细胞）。

4.1）迁移实验。该实验可用于定量分析细胞（淋巴细胞）的迁移能力。使用直径为 6.5 mm、孔径为 5.0 μm 的 Transwell 小室，实验设三个重复。若使用不同类型的细胞，需优化孔径和迁移时间（步骤 4.1.3）。

1. 通过添加准备下室 600 μl 含或不含特定刺激物的完全RPMI即 SDF-1）以分别测量诱导迁移和自发迁移。
2. 将上室放上并让系统在 37 °C 在培养箱中。
3. 接种10⁶ 细胞200 μl 在上室（总细胞数）中孵育平板，37°C 条件下孵育 4 小时 37 °C 在培养箱中。
4. 移除上室，收集下室中的培养基，并用 1 ml PBS 清洗下室一次。将 PBS 收集至离心管中。
5. 离心5分钟，300 × g，弃上清，沉淀重悬于 500 μl PBS
6. 通过流式细胞术，在采集1分钟的条件下计数迁移细胞的数量。若为单一细胞群体，则无需添加任何表面抗体。通过二维点图分析细胞侧向散射信号及1分钟内检测到的事件数，确定细胞数量，该数值将用于后续计算。
7. 将迁移指数（MI）计算为：
   

4.2）黏附实验。该实验可用于测定细胞的黏附能力。请设置三个重复样本进行实验。

1. 在4 °C条件下，将96孔板（平底）每孔加入50 μl的2% BSA-PBS（作为背景对照）或用PBS稀释的1 μg ICAM-1，包被过夜。
2. 用PBS洗涤板子两次，每孔加入100 μl 2% BSA-PBS，在37 °C孵育1小时以封闭非特异性结合位点。
3. 同时，将细胞以5 × 10⁶/ml的浓度重悬于完全RPMI培养基中，用1 mM CMFDA绿色细胞示踪剂标记，并在37 °C孵育30分钟。
4. 弃去封闭液（步骤4.2.2）后，将1 × 10⁶个细胞/孔加入已包被的孔中，在37 °C孵育1小时。
5. 使用ELISA读板仪定量黏附情况（激发滤光片：485 nM，发射滤光片：535 nM）。首先对总加入量（INPUT）进行第一次测量。
6. 用2% BSA-PBS（每孔200 μl）轻轻洗涤板子4次（x）。每次洗涤后读取一次板子信号（Adhesion_x）。
7. 对每次测量值扣除背景后，计算特异性黏附率（ADHESION）：
   

4.3）聚合实验。该比色实验用于定量检测F-肌动蛋白的聚合。请设置三组重复实验。

1. 重悬 1×10^6 个细胞于 100 μl 预热的完全RPMI培养基，并加入特定刺激物（即 α-IgM 20 μg/ml 10分钟
2. 用以下方法终止反应 400 μl 用4%多聚甲醛在室温下固定细胞10分钟。
3. 用 PBS 洗涤 3 次（300 x g 离心 5 分钟， 4 °C).
4. 弃去上清液，用含 0.2% 皂苷的 PBS 缓冲液对细胞进行透化处理（200 μl在冰上放置 2 分钟。
5. 用 PBS-皂素 0.1% 洗涤 3 次（100 × g 离心 5 分钟， 4 °C），弃去上清液，重悬于 100 μl PBS-皂苷 0.1%
6. 用鬼笔环肽-Alexa Fluor 488 染色（3 μg/ml在室温避光条件下孵育30分钟。
7. 用 PBS-0.1% 皂素洗涤 3 次。弃去上清液，重悬于 300 μl PBS
8. 通过流式细胞术定量F-actin含量，计算鬼笔环肽（Phalloidin）的平均荧光强度（MFI）。对生成的数据进行一维图分析，以荧光强度为基础绘制直方图，MFI值显示在图形报告中。
9. 测量F-肌动蛋白聚合（∆ F-actin）如下：
   

结果

我们从慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者外周血（PB）中分离出原代白血病B细胞，并分析其蛋白质组谱。根据每位患者的临床特征，将样本（n = 104）分为两个主要亚组（预后不良 与 预后良好）并进行了双向电泳凝胶的比较分析。

该分析能够鉴定出两个亚群之间差异表达的蛋白点（基于蛋白点的有无或凝胶上的位置偏移，提示翻译后修饰发生了变化；n ≈ 16）。我们从二维电泳凝胶中切取选定的蛋白点，经还原和烷基化处理后，用胰蛋白酶对蛋白质进行消化，将所得上清液中的肽段点样至MALDI靶板。使用MALDI-ToF Voyager DE仪器采集质谱图谱。所得峰列表提交至MASCOT和ProFound数据库进行检索。在特定质量容差范围内的质谱峰被匹配至数据库中的肽段序列，并拼接成蛋白质序列；若该蛋白质的匹配结果通过特定的概率评分标准，则被认定为已鉴定（图3）。通过该分析，我们鉴定出的蛋白质主要参与细胞骨架活动和代谢过程（未发表数据）。

在这些蛋白中，我们重点关注了造血系细胞特异性蛋白-1（HS1），...

讨论

本文旨在描述一种优化的实验方案，用于鉴定参与慢性淋巴细胞白血病（CLL）发病机制的分子，尽管该方法也可扩展应用于其他疾病和/或其他类型的样本。^16-18通过比较慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者两个亚组的蛋白质组学谱 与 预后不良¹⁹我们证实，它们在HS1的磷酸化状态上存在差异，且HS1的活化影响白血病细胞的迁移和黏附能力。

与其他方法相比，本文所述蛋白质组学技术（双向电泳凝胶和质谱）的主要优势在于，它们能够提供细胞蛋白质组的完整图谱，更重要的是，能够提供蛋白质翻译后修饰的相关信息。发生差异磷酸化或糖基化的蛋白质在凝胶中的位置会发生改变，其在细胞中的活性也可能随之改变。

此外，我们描述了用于检测细胞迁移和黏附的实验方案，这些方案可用于评估细胞骨架功能；然而，对于悬浮生长的细胞而言，这类方案的描述仍较为有限，因为它们通常应用于贴壁细胞。例如 伤口愈合）。2DE 和 MS 技术的主要局限性在于所需细胞/蛋白质的数量（≈25 × 10⁶

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙腈	MERCK	61830025001730
碳酸氢铵	SIGMA	A6141-500G
1,4-二硫苏糖醇	SIGMA	D9680-5G
碘乙酰胺	SIGMA	I6125-25G
二水合氯化钙	SIGMA	223506-25G
测序级胰蛋白酶	ROCHE	11418475001
α-氰基-4-羟基肉桂酸	SIGMA	C2020-10G
三氟乙酸	SIGMA	T6580
ZipTipµ-C18	MILLIPORE	ZTC18M096
人B细胞富集混合液（RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail）	STEMCELL	15064
磷酸盐缓冲液（PBS）	EUROCLONE	ECB4004L
胎牛血清（FBS）	DOMINIQUE DUTSCHER	S1810
淋巴细胞分离液（Lymphoprep）	SENTINEL DIAGNOSTICS	1114547
台盼蓝	SIGMA	T8154
CD19	BECKMAN COULTER	082A07770	ECD
CD5	BECKMAN COULTER	082A07754	PC5
CD3	BECKMAN COULTER	082A07746	FITC
CD14	BD	345785	PE
CD16	BECKMAN COULTER	082A07767	PC5
CD56	BECKMAN COULTER	082A07789	PC5
Ettan IPGphor 3 等电聚焦仪	GE-Healthcare	11-0033-64
尿素	SIGMA	U6504
Tris-HCl缓冲液	BIO-RAD	161-0799
CHAPS	SIGMA	C2020-10G
DTT	SIGMA	D9163-5G
IPG胶条	GE-Healthcare	17-1233-01	线性pH 4-7，18 cm
IPG缓冲液	GE-Healthcare	17-6000-86	pH 4-7
甘油	SIGMA	G6279
PROTEAN II XL 电泳槽	BIO-RAD	165-3188
SDS	INVITROGEN	NP0001
丙烯酰胺	BIO-RAD	161-0156
琼脂糖	INVITROGEN	16500
甲醇	SIGMA	32213
乙酸	VWR	631000
福尔马林	BIO-OPTICAL	05-K01009
乙醇	VWR	9832500
硫代硫酸钠	FLUKA	72049
硝酸银	FLUKA	85228
Molecular Dynamics Personal SI 激光密度计	Amersham Biosciences
ImageMaster 2D Platinum 5.0	Amersham Biosciences
碳酸钠	MERCK	A0250292
MALDI-TOF Voyager-DE STR	Applied Biosystems
Data Explorer 软件（版本 3.2）	Applied Biosystems
transwell 小室（直径 6.6 mm）	CORNING	3421
RPMI 培养基	EUROCLONE	ECB2000L	含 L-谷氨酰胺
庆大霉素	SIGMA	G1397
SDF-1	PREPROTECH	300-28A
平底 96 孔板	BECTON DICKINSON	353072
牛血清白蛋白（BSA）	SANTA CRUZ	9048-46-8
ICAM-1	R&D Systems	720-IC
CMFDA	Life Technology	C7025	绿色
IgM	SOUTHERNBIOTECH	2020-02
多聚甲醛	SIGMA	P6148
皂苷	SIGMA	S-7900
鬼笔环肽	Life Technology	A12379	Alexa Fluor 488