测量拟南芥植物中的空间和时间Ca2+信号

摘要

Ca²⁺ 信号调控植物中多种多样的生物学过程。本文介绍了利用基因编码的 Ca²⁺ 探针 Aequorin 或 Case12，监测非生物胁迫在拟南芥细胞和组织中诱导产生的时空 Ca²⁺ 信号的方法。

摘要

发育和环境信号会诱导植物细胞内产生 Ca²⁺ 波动。细胞内的 Ca²⁺ 结合蛋白可感知特定刺激所引发的时空特异性 Ca²⁺ 模式，并启动 Ca²⁺ 信号级联反应。然而，目前我们对这些特定刺激如何产生特异性的 Ca²⁺ 信号仍知之甚少。Ca²⁺ 信号的特异性可能源于在特定刺激下，Ca²⁺ 通道和/或转运蛋白活性受到的精密调控。为了鉴定这些细胞组分并理解其功能，至关重要的是采用能够在组织和细胞水平上灵敏且稳健地记录 Ca²⁺ 信号的系统。靶向不同细胞区室的基因编码 Ca²⁺ 指示剂为活细胞共聚焦成像观察细胞内 Ca²⁺ 信号提供了平台。本文中，我们描述了两种 Ca²⁺ 检测系统的使用方法：基于 aequorin 的 FAS（film adhesive seedlings，薄膜粘附幼苗）发光 Ca²⁺ 成像系统，以及基于 Case12 的活细胞共聚焦荧光 Ca²⁺ 成像系统。利用 FAS 系统进行发光成像可在组织水平上简便、稳健且灵敏地检测时空 Ca²⁺ 信号；而利用 Case12 进行活细胞共聚焦成像则可高分辨率地同时检测细胞质和细胞核内的 Ca²⁺ 信号。

引言

植物细胞通过协调细胞活动的信号转导来响应环境变化。在环境刺激下，早期的细胞信号事件是瞬时的 Ca²⁺ 浓度升高。游离 Ca²⁺ 浓度瞬时升高的模式或特征，由其幅度、频率和持续时间来表征。不同的时空特异性 Ca²⁺ 信号特征可调控不同的细胞活动¹。特定刺激（如高温、低温、盐胁迫、干旱、光照或植物激素）可能精细调节定位于膜上的 Ca²⁺ 通道和/或转运蛋白的时空活性，从而产生特异性的 Ca²⁺ 信号特征。尽管 Ca²⁺ 转运蛋白已被广泛研究，但植物中 Ca²⁺ 通道的分子身份及其功能仍知之甚少¹。针对应激刺激下 Ca²⁺ 响应发生改变的突变体进行遗传筛选，可能是鉴定构成 Ca²⁺ 信号组分的有效方法。近年来，已开发出多种基于水母发光蛋白（Aequorin）的 Ca²⁺ 检测系统，有助于开展针对病原体侵袭和非生物胁迫响应中 Ca²⁺ 信号组分的遗传筛选^2-4。

早在20世纪90年代初，Aequorin即被用于检测植物中的Ca²⁺信号⁵。此后，Aequorin已被靶向至不同的细胞区室，如细胞质⁵、细胞核⁶、叶绿体⁷、液泡膜⁸、线粒体⁹和基质¹⁰，以及根部的不同细胞类型，以监测特定细胞的Ca²⁺信号¹¹。基于Aequorin的Ca²⁺测量可揭示细胞群体对胁迫刺激产生的时空Ca²⁺响应。然而，在大多数情况下，响应组织中单个细胞的Ca²⁺响应是不同步的⁴。因此，Aequorin记录的Ca²⁺信号并不一定反映单个细胞内的Ca²⁺信号。近年来，基于遗传编码的荧光蛋白（FP）的Ca²⁺探针，如黄色彩虹蛋白（YCs）¹²和CASEs12¹³，已被用于以高亚细胞分辨率研究Ca²⁺信号传导。YCs是一类基于荧光共振能量转移（FRET）的Ca²⁺探针，包含通过Ca²⁺结合蛋白钙调蛋白（calmodulin）及其结合肽M13连接的CFP和YFP变体。当钙调蛋白结合Ca²⁺时发生构象变化，使CFP与YFP彼此靠近，从而增强能量转移（FRET增强）。随时间变化的FRET水平大致以YFP与CFP信号强度的比值计算，可反映细胞内Ca²⁺动态变化。已有多种YC版本应用于植物研究。YC3.6已被靶向至细胞质^14,15、细胞核¹⁶、线粒体¹⁷和质膜¹⁸，YC4.6和D4ER被靶向至内质网^15,19，D3cpv则被靶向至过氧化物酶体²⁰。表达YCs的转基因植物可实现对不同类型细胞中不同细胞区室内Ca²⁺动态的活细胞成像。CASEs（推测为Calcium sensor）是一类包含钙调蛋白及钙调蛋白结合肽M13的单个环状重排荧光蛋白（cpFPs）。当结合Ca²⁺时，CASEs发生构象变化，导致荧光强度增加。CASE荧光响应与Ca²⁺浓度之间的相关性使得细胞内Ca²⁺动态可被定量测定。Case12变体在Ca²⁺饱和状态下荧光强度提高12倍。N. benthiminana植物瞬时表达Case12或拟南芥植物稳定表达Case12已被用于研究防御反应及非生物胁迫中的Ca²⁺信号传导^4,21。基于Case12的Ca²⁺成像揭示了病原体攻击或脱水胁迫下细胞中异步的空间和时间Ca²⁺振荡现象。

本文详细介绍了基于Aequorin的拟南芥幼苗组织和刺激特异性Ca²⁺动态的发光成像方法，以及表达Case 12的拟南芥根细胞中细胞质和细胞核Ca²⁺动态的共聚焦成像方法。FAS的发光成像技术可进一步拓展，用于分析完整植株或未在此描述的组织中由胁迫诱导的Ca²⁺动态，或用于筛选经诱变处理的拟南芥群体中胁迫诱导Ca²⁺信号发生改变的突变体。活细胞Ca²⁺成像系统也可通过使用其他Ca²⁺探针，适配于分析不同亚细胞区室或不同类型细胞中的Ca²⁺动态。

方案

1. 利用FAS系统进行基于水母发光蛋白的Ca²⁺成像

1. 准备用于生物发光成像的幼苗。用含有 0.01% Triton-100 的 10% 次氯酸钠溶液对表达 Aequorin 的拟南芥种子进行表面灭菌。将灭菌后的种子播种于方形培养皿（10 × 10 cm 带网格的培养皿）中，培养基为含 1% 蔗糖和 1.2% 琼脂的 1 倍 MS（Murashige 和 Skoog 基本盐混合物）。在 4 °C 下层积处理 2 天后，将培养皿垂直放置于生长培养箱中（图 1A）。
2. 将幼苗转移至薄膜上。将一张粘性薄膜（图 1B）覆盖在培养皿中生长 7–10 天的幼苗表面，用手轻轻按压薄膜，确保幼苗粘附于其上（图 1C）。然后轻柔剥离薄膜，使幼苗保留在薄膜上（图 1D 和 1E）。
3. 用辅因子孵育幼苗。将粘附有幼苗的薄膜转移至另一方形培养皿（10 × 10 cm）中，皿内加入 15 ml 含 2 μg/ml h-CTZ（腔肠素）的水溶液。于室温下避光孵育 4 小时至过夜（图 1F）。
4. 准备进行生物发光成像。将薄膜从 h-CTZ 溶液中取出，沿中线剪成两半，形成两片。将每片薄膜连同幼苗正面朝上分别放入两个不同的培养皿中，静置于暗处 5 分钟。
5. 采集生物发光图像。在暗环境中，将两个培养皿并排置于生物发光成像系统的载物台上（图 1G），同时向两个培养皿中各加入 20 ml 刺激溶液后立即采集图像。
6. 分析生物发光图像。所有生物发光图像应使用相同的显示范围。裁剪出感兴趣区域（ROI），并将图像保存为 JPEG 格式文件（图 2A）。或者，将图像导出为 SPE 格式文件，并导入 ImageJ 图像分析软件。设置测量参数以计算 ROI 的平均灰度值。选取相同大小的 ROI 区域，测量平均灰度值，并以柱状图形式呈现数据（图 2B）。

2. 活细胞共聚焦 Ca²⁺ 成像

1. 准备用于共聚焦成像的幼苗。用含有 0.01% Triton 的 10% 次氯酸钠溶液对表达 case12 的拟南芥种子进行表面灭菌。将灭菌后的种子播种于含有全浓度 MS 盐、1% 蔗糖和 1.2% 琼脂的培养基平板上。在 4 °C 下春化处理 2 天后，将平板垂直放置于生长培养箱中。
2. 搭建成像室
   1. 使用载玻片和盖玻片组装一个成像室（成像室 A）。将一小块吸水后的棉絮置于载玻片中央，然后将一至两株 5 日龄幼苗从平板转移至湿棉絮表面。在盖玻片的四个角粘上小块黏土，将盖玻片盖在幼苗上方，使盖玻片与载玻片之间形成一个间隙（成像室）（图 3A，左图）。将聚乙烯管（直径 0.58 mm）的一端连接至 1 ml 注射器，另一端紧邻成像室放置，并用胶带固定管路位置（图 3A，右图）。
   2. 使用有机玻璃成像室（成像室 B）组装成像室。
      1. 在两根聚乙烯管（直径 0.58 mm）周围涂上一层薄硅脂，然后将涂有硅脂的管子压入有机玻璃成像室两侧的槽道中（图 3B 左图）。在成像室带有管槽的一侧表面涂上一层薄硅脂，然后将盖玻片压入硅脂中，以密封成像室开口（切口）的一侧。
      2. 将一株 5 日龄幼苗从平板转移至成像室内，并在幼苗上方放置一块吸水后的棉絮。在成像室另一侧表面涂上硅脂，再压上另一块盖玻片进行密封。将其中一根管的一端连接至 1 ml 注射器，另一根管的末端保持开放（图 3B 右图）。
   3. 使用带腔室的盖玻片（成像室 C）制备成像室。用 70% 乙醇对带腔室的盖玻片进行灭菌，并置于超净台中晾干。分别向 2 孔或 8 孔腔室的每个孔中加入 0.6 ml 或 0.2 ml 含 1% 蔗糖和 0.5% Phytagel 的全浓度 MS 培养基（图 3C 右图）。对种子灭菌后，直接将其播种于含有薄层透明凝胶的带腔室盖玻片中，并垂直培养 5 天（图 3C）。
3. 使用共聚焦显微镜采集图像。为施加胁迫刺激（如盐、低温或过氧化氢），在图像采集前，缓慢向成像室（成像室 A 或 B）注入约 200 μl 的 150 mM NaCl 溶液、冰冻水或 1 mM H₂O₂ 溶液；或分别向 2 孔或 8 孔腔室的孔中轻轻加入 500 μl 或 100 μl 刺激溶液。使用配备 20X 水浸物镜（数值孔径 0.75）的倒置 Nikon A1R 共聚焦激光扫描显微镜，在刺激施加后立即采集图像。以 4 秒间隔采集时间序列图像，激发波长和发射波长分别为 488 nm 和 500 - 550 nm，像素分辨率为 512 x 512。
4. 图像分析
   使用 Nikon Elements 软件，在每个感兴趣细胞（或区域）周围绘制感兴趣区域（ROI）。通过“时间测量”对话框（也可使用 ImageJ）测量每个 ROI 随时间变化的总荧光强度。将强度数据导出并在 DataGraph 中进行处理。Ca²⁺ 尖峰振幅定义为峰值强度减去静息强度，持续时间定义为尖峰起始至结束的时间，周期定义为两个相邻尖峰峰值之间的时间间隔。采用 t-检验比较均值差异。

结果

甘露醇、NaCl 和 H₂O₂ 分别作为脱水、盐胁迫和氧化胁迫刺激的模拟物。为了检测重金属离子 Cu²⁺ 是否与这三种胁迫刺激中的任何一种产生协同作用，我们比较了在有或无 Cu²⁺ 存在条件下，每种刺激所引发的 Ca²⁺ 响应。如图2所示，FAS 发光成像结果显示，拟南芥幼苗对脱水、盐胁迫和氧化胁迫的响应各不相同。在本研究中所检测的刺激浓度下，75 mM NaCl 在暴露的前 40 秒内，在叶片和根中均诱导出最强的 Ca²⁺ 响应（图2A 中间图和图2B）；而 1 mM H₂O₂ 在暴露的第一和第二个 40 秒内，在叶片和根中均诱导出强烈的 Ca²⁺ 响应（图2A 右图）。400 mM 甘露醇溶液仅在前 40 秒内在根中诱导出 Ca²⁺ 响应，在第二个 40 秒内在叶片中仅产生极微弱的信...

讨论

我们已展示了一种用于记录拟南芥幼苗时空Ca²⁺响应的FAS系统。该FAS Ca²⁺记录系统提供了一种简单、灵敏且稳健的方法，除本文所展示的非生物胁迫刺激外，还可适用于测量由多种其他刺激引发的Ca²⁺动态变化。利用该系统，我们可以在全植株水平上轻松比较组织或刺激特异性的时空Ca²⁺动态。FAS系统的高灵敏度允许使用低强度刺激来检测Ca²⁺响应，这对于避免使用高强度胁迫时因细胞物理损伤而产生的假象至关重要。7至10天大的拟南芥幼苗表现出组织或刺激特异性的Ca²⁺响应，尽管处于不同生理阶段的幼苗对同一刺激的响应可能具有不同的敏感性和特异性。因此，建议使用7–10天大的幼苗以提高FAS测量的通量，在此条件下约100株幼苗可粘附于一张薄膜上。结合操作简便、高灵敏度和良好重复性，FAS系统还可用于筛选EMS诱变后Ca²⁺响应发生改变的突变体。在筛选过程中，确保幼苗生长均匀且在培养板上状态良好并牢固粘附于薄膜上至关重要。粘附有幼苗的薄膜与h-CTZ孵育4至5小时 通常足以完成腔肠素的重建。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 cm x 10 cm 方形培养皿	VWR	60872-310
粘性封口膜	VWR	60941-062
聚乙烯管	PerkinElmer	9908265
1 ml 注射器	VWR	53548-000
硅脂	Beckman	335148
双孔腔载玻片	Nalge Nunc international	155379
八孔腔载玻片	Nalge Nunc international	155409
发光成像系统	Princeton Instruments	N/A
倒置共聚焦激光扫描显微镜	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
成像软件	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 为最新版本
腔肠素	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
通用漂白剂	任意本地商店	N/A
吐温 X-100	Fisher	BP151500
MS 盐	Phytotechnology Labs	M524-50L
蔗糖	VWR	BDH8029-12KG
琼脂	Sigma	A1296-5KG
植物凝胶	Sigma	P8169-1KG